血液标本收集和保存..

血液标本的收集和保存方法

说明：一般建议用新鲜的血液标本进行实验。如果标本已经保存较长时间，请联系康成公司技术部，以确认样本是否适合进行实验。

一、 全血收集

请按照实际使用的收集方法，如注射器收集或真空收集管等，参考相应的厂商提供产品说明进行操作。采集好全血，将采集好的全血转移至单独的冻存管，按照每400~500ul/管分装好。短期保存，可放入- 20°C 或- 70°C冰箱。长期保存，请放入液氮。

二、 血浆收集

为获得血浆进行实验，应使用抗凝管采集全血，并尽快进行血浆分离：1000g离心10分钟，分离血浆和细胞组分。将采集好的血浆转移至单独的冻存管，按照每400~500ul/管分装好。短期保存，可放入- 20°C 或- 70°C冰箱。长期保存，请放入液氮。

图片来源：Exiqon ‘ Quantification of MicroRNA expression in Blood Plasma/Serum Samples’

注意：血浆收集应使用抗凝管，抗凝剂可以用柠檬酸钠或EDTA等，但一定不要使用肝素抗凝，因为肝素对RNA实验有较大影响

三、 血清收集

为获得血清进行实验，应使用凝血管采集全血，采血后两小时内分离血清。采血后轻轻倒转采血管混合4~5次，直立置于室温待血液完全凝固（一般约一小时），1000g离心10分钟，分离血清。将采集好的血清转移至单独的冻存管，按照每400~500ul/管分装好。短期保存，可放入- 20°C 或- 70°C冰箱。长期保存，请放入液氮。

四、 血清、血浆和全血样本的保存和运输

→ microRNA芯片检测血清、血浆或全血标本约需要1~2ml的量（即每份样品2~4管）。

→在样品保存及转移的过程中，应避免反复冻融样品。

→运输过程必须使用足量干冰保证始终低温。干冰量至少为8公斤（足量），且运输用厚壁泡沫箱，且需用封箱带密封。

注：

保存血清，血浆或者全血所使用的1.5 ml冻存管或离心管，操作中使用的枪头等必须高温灭菌，装好样品后管口需要以封口膜封好。

参考文献：

1. Signature microRNA Expression Profile of Essential Hypertension and Its Novel Link to Human Cytomegalovirus Infection. Li S., et al., Circulation, 2011.

2. Characterization of microRNAs in serum: a novel class of biomarkers for diagnosis of cancer and other diseases. Xi C., et al., Cell Research, 2008.

附：TRI抽提RNA protocol

→如果条件允许，亦可采用TRI Reagent BD保存全血、血浆和血清，并抽提其中的RNA

→TRI Reagent BD（For processing whole blood, plasma, or serum）可以从Sigma或者MRC(Molecular Research Center)订购

1、RNA的抽提

采用TRI Reagent BD从全血、血浆和血清中抽提RNA，整个过程可以在1小时内完成，完整的RNA的得率比其他的抽提方法高30－150％。其他方法抽提的RNA的完整性都不如TRI Reagent BD，特别是采用柱离心式抽提方法很可能改变RNA的组成。TRI Reagent BD尤其适用于抽提病毒RNA。抽提得到的RNA可用于northern、dot blot bybridization、poly A＋ selection、in vitro translation、RNase protection assay、molecular cloning和PCR。

实验方法

需要自备的试剂：1‐bromo‐3‐chloropropane（溴氯丙烷，BCP）或氯仿、异丙醇、乙醇和5N醋酸

建议使用一次性的聚丙烯离心管，并可承受12,000g离心。

1、裂解：0.75ml TRI Reagent BD＋0.2‐0.25ml全血、血浆或血清

2、两相分离：裂解液＋0.1ml溴氯丙烷或0.2ml氯仿

3、RNA沉淀：水相层＋0.5ml异丙醇

4、洗RNA：1ml 75％ 乙醇

5、RNA溶解：FORMAzol、0.5% SDS、或水

实验在室温中进行，除非特定步骤。

1、裂解

A、血清：加入0.25ml血清和2‐8ul Polyacryl Carrier（Cat.No.PC152）到0.75ml TRI Reagent BD中，

盖上盖子，用手或震荡器晃动离心管直至充分混匀。

B、全血或血浆：加入0.2ml全血或血浆到0.75ml TRI Reagent BD，每0.2ml全血或血浆添加20ul

5N 醋酸，盖上盖子，用手或震荡器晃动离心管直至充分混匀。

醋酸可以在混合血液样品前的TRI Reagent BD中添加，也可混合后添加。用1ml冰醋酸（>99％）与2.48ml水混合制备5N的醋酸。样品体积与试剂体积的比例始终与上述实验方法中一致。样品体积过大会导致DNA污染，而体积太小则有可能获得过于少量的RNA。

注意：使用TRI裂解样品后，样品干冰运输，或于－70℃存放数月，至进行后续实验。

2、两相分离

将裂解液室温放置5分钟，使得核蛋白复合物充分解离。接下来，每0.75ml裂解液中添加0.1ml 溴氯丙烷或者0.2ml氯仿，盖紧盖子，剧烈晃动15秒。混合液室温放置2‐5分钟，12,000g，4℃离心15分钟。离心后，混合物分为下部褐色的酚-氯仿相、中间相和上部无色的水相。RNA保留在水相中，DNA和蛋白分别在中间相和有机相中。水相层的体积大约为用于裂解的TRI Reagent BD试剂体积的60％。

用溴氯丙烷代替氯仿不会影响RNA、DNA和蛋白的质量，并且可以降低DNA污染RNA的可能性（4）。用于两相分离的氯仿不能含有异戊醇或者其他添加物。