病毒感染的实验室诊断课件
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如果在培养瓶中加入相应 的血凝素抗血清，则不出现红 细胞吸附现象，即红细胞吸附 抑制试验阳性
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（6）血凝及血凝抑制试验
含有血凝素的病毒能吸附一定种类的哺乳动物或禽类的 红细胞，使红细胞凝集。该现象可被相应的血凝素抗体抑制， 称为血凝抑制试验，可用于分型。
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病毒的理化性质测定
牛血清白蛋白的Hank’s液
3.无菌送检
• 抑制细菌生长 100U/ml青霉素＋100μg/ml链霉素 • 抑制真菌生长 2.5μg/ml二性霉素B 或40 μg/ml制霉菌素
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二、病毒的分离与鉴定
（一）病毒分离和鉴定的一般程序
标本采集
标本处理后接种
动物接种
组织培养
鸡胚接种
观察发病
抗原检测 抗体检测 病理检查
CPE EM
包涵体
空斑试验
红细胞吸附
中和试验
卵黄囊膜 尿囊液 羊膜腔液 绒毛尿囊膜
观察囊膜病变
血凝试验
血凝抑制试验
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（二）病毒的分离
• 组织培养 • 鸡胚培养 • 动物接种
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1.组织培养
将人或动物离体的活组织或分散的活细胞在体外人工控制的 条件下使其生长繁殖的一种技术。
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2. 鸡胚培养
常用于粘病毒、疱疹病毒和痘类病毒的分离培养
接种途径及方法
38～39℃
新鲜受精卵 7～13d
接种病毒
卵黄囊接种 羊膜腔接种 尿囊腔接种 绒毛尿囊膜接种
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绒毛尿囊膜表现有痘病毒的特异性损伤
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3. 动物接种
常用动物 小鼠、大白鼠、豚鼠、家兔、猴等。不同病对 动物的敏感性不同，根据病毒种类加以选择。
组织培养的类型
（1）组织块培养
（2）器官培养 人胚气管－呼吸道病毒；人胚肠－肠道病毒
（3）细胞培养 最常用
• 原代和次代细胞培养 • 二倍体细胞培养 • 传代细胞培养
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原代和次代培养细胞
动物新鲜组织（人胚肾等）→胰酶消化→营养液培养→单 层细胞（原代细胞）
原代细胞→胰酶消化→转种培养（次代培养细胞） 对病毒敏感，但制备费时费力，只能传2～3代。 • 二倍体细胞株 原代细胞反复传代（50～70代）仍保持二 倍体染色体特性。病毒分离和疫苗制备的首选细胞株。 • 传代细胞系 来源于肿瘤细胞或突变的二倍体细胞，能在体 外无限增殖。增殖快，不易衰老，易于传代保存。常用于 病毒的分离鉴定，但不能用于制备疫苗。
• 细胞变圆、融合、肿胀、细胞空泡、核 浓缩、形成嗜酸性或嗜碱性包涵体等。
• 某些病毒感染细胞后不出现CPE
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（3）空斑现象
• 空斑（plaque）是指在单层细胞中，由活细胞包围的由病 毒感染引起的死细胞的区域。一个空斑由一个病毒颗粒感 染 所致，利用空斑可纯化病毒。
• 不同种类病毒形成 的空斑大小和形状不同，可用于鉴定病 毒。
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（4） 干扰现象
当两种不同的病毒同时或先后感染同一细胞时，其中一种 病毒可抑制另一种病毒的增殖，称为病毒的干扰现象。
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（5）红细胞吸附及吸附抑制试验
受感染的宿主细胞膜含病 毒抗原（血凝素），可吸附鸡、 豚鼠或猴红细胞
试验等 分离的新病毒，必须进行系统的鉴定
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病毒在细胞培养中的表现
（1）细胞代谢作用改变（培养液颜色变化） 正常细胞代谢： 培养液由红变黄 病毒增殖，抑制细胞代谢：培养液颜色不变或更红
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（2）细胞病变效应（cytopathic effect ，CPE）
• 病毒在细胞内增殖后，使宿主的形态发 生不同程度改变，这种由病毒增殖引起 的细胞形态变化，称为细胞病变效应。
接种途径 按病毒侵袭部位选择相应的接种途径： • 乙型脑炎病毒及狂犬病毒 小鼠脑内接种 • 柯萨奇病毒 乳鼠腹腔接种 • 乙肝病毒 黑猩猩静脉注射 • 流感病毒 鼻腔滴种 用途
• 分离鉴定病毒，制备疫苗，制备抗血清
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（三）病毒的鉴定
病毒的初步鉴定 • 动物感染范围及潜伏期 • 对鸡胚的敏感性 • 在细胞培养中的表现 • 理化性质的测定 最后鉴定 • 血清学鉴定: 中和试验、补体结合试验、血凝抑制
主要用于新发现病毒的鉴定 （1）病毒的大小及形态 电镜直接观察 （2）核酸类型
5-溴-2-脱氧尿苷（BUDR）能抑制DNA复制，而不抑制 RNA病毒。 （3）乙醚敏感试验
有包膜病毒对乙醚敏感，经乙醚作用后，失去感染性 （4）耐酸试验
肠道病毒耐酸，在pH3的环境下稳定，鼻病毒不耐酸， 在pH3的环境下被灭活
1. 活病毒 2. 敏感细胞、鸡胚或动物
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ຫໍສະໝຸດ Baidu23
中和试验的常用方法： • 固定V.，稀释血清，测定抗体效价 （常用） • 固定血清，稀释V.，求中和指数 中和试验的优缺点 • 特异，敏感，既可检测抗体，也可测定抗原（定属、定型）。 • 既可用细胞培养做，也可用动物或鸡胚接种，以细胞最常用。 • 检测IgG，不能用于早期诊断，常用用于流行病学调查。
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病毒的血清学鉴定
• 中和试验、补体结合试验、血凝抑制试验等
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三、病毒的血清学诊断
单份血清IgM测定 早期诊断 双份血清IgG测定 4倍以上增长，有诊断意义
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病毒血清学试验常用方法
（一）中和试验
原理 抗体与相应病毒结合后，能够使病毒失去感染性。 V.＋Ab → 失去感染易感细胞的能力 一定量抗体可中和一定量病毒。 中和试验的必要条件：
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（二）标本的运送与保存
1.低温送检
• 4℃可保存数小时 •-70℃可长期保存 • -10 ～ -20℃下病毒易灭活，不可用于保存病毒标本 • 对冷冻标本应避免反复冻融
2.保湿送检
–50%甘油盐水保存送检 – 病毒转运培养基（virus transport medium ，VTM）含0.5%明胶或
病毒感染的实验室诊断
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病毒感染的实验诊断方法
➢病原学诊断
➢病毒分离培养 ➢显微镜检查 ➢抗原检测 ➢核酸检测
➢血清学诊断
➢ 抗体检测 IgM、IgG
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一、标本采集与运送
（一）标本采集
➢采集时间：尽早采集（越早越好） ➢标本种类：根据感染的部位、可能感染的病毒类型选择
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（6）血凝及血凝抑制试验
含有血凝素的病毒能吸附一定种类的哺乳动物或禽类的 红细胞，使红细胞凝集。该现象可被相应的血凝素抗体抑制， 称为血凝抑制试验，可用于分型。
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病毒的理化性质测定
牛血清白蛋白的Hank’s液
3.无菌送检
• 抑制细菌生长 100U/ml青霉素＋100μg/ml链霉素 • 抑制真菌生长 2.5μg/ml二性霉素B 或40 μg/ml制霉菌素
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二、病毒的分离与鉴定
（一）病毒分离和鉴定的一般程序
标本采集
标本处理后接种
动物接种
组织培养
鸡胚接种
观察发病
抗原检测 抗体检测 病理检查
CPE EM
包涵体
空斑试验
红细胞吸附
中和试验
卵黄囊膜 尿囊液 羊膜腔液 绒毛尿囊膜
观察囊膜病变
血凝试验
血凝抑制试验
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（二）病毒的分离
• 组织培养 • 鸡胚培养 • 动物接种
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1.组织培养
将人或动物离体的活组织或分散的活细胞在体外人工控制的 条件下使其生长繁殖的一种技术。
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2. 鸡胚培养
常用于粘病毒、疱疹病毒和痘类病毒的分离培养
接种途径及方法
38～39℃
新鲜受精卵 7～13d
接种病毒
卵黄囊接种 羊膜腔接种 尿囊腔接种 绒毛尿囊膜接种
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绒毛尿囊膜表现有痘病毒的特异性损伤
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3. 动物接种
常用动物 小鼠、大白鼠、豚鼠、家兔、猴等。不同病对 动物的敏感性不同，根据病毒种类加以选择。
组织培养的类型
（1）组织块培养
（2）器官培养 人胚气管－呼吸道病毒；人胚肠－肠道病毒
（3）细胞培养 最常用
• 原代和次代细胞培养 • 二倍体细胞培养 • 传代细胞培养
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原代和次代培养细胞
动物新鲜组织（人胚肾等）→胰酶消化→营养液培养→单 层细胞（原代细胞）
原代细胞→胰酶消化→转种培养（次代培养细胞） 对病毒敏感，但制备费时费力，只能传2～3代。 • 二倍体细胞株 原代细胞反复传代（50～70代）仍保持二 倍体染色体特性。病毒分离和疫苗制备的首选细胞株。 • 传代细胞系 来源于肿瘤细胞或突变的二倍体细胞，能在体 外无限增殖。增殖快，不易衰老，易于传代保存。常用于 病毒的分离鉴定，但不能用于制备疫苗。
• 细胞变圆、融合、肿胀、细胞空泡、核 浓缩、形成嗜酸性或嗜碱性包涵体等。
• 某些病毒感染细胞后不出现CPE
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（3）空斑现象
• 空斑（plaque）是指在单层细胞中，由活细胞包围的由病 毒感染引起的死细胞的区域。一个空斑由一个病毒颗粒感 染 所致，利用空斑可纯化病毒。
• 不同种类病毒形成 的空斑大小和形状不同，可用于鉴定病 毒。
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（4） 干扰现象
当两种不同的病毒同时或先后感染同一细胞时，其中一种 病毒可抑制另一种病毒的增殖，称为病毒的干扰现象。
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（5）红细胞吸附及吸附抑制试验
受感染的宿主细胞膜含病 毒抗原（血凝素），可吸附鸡、 豚鼠或猴红细胞
试验等 分离的新病毒，必须进行系统的鉴定
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病毒在细胞培养中的表现
（1）细胞代谢作用改变（培养液颜色变化） 正常细胞代谢： 培养液由红变黄 病毒增殖，抑制细胞代谢：培养液颜色不变或更红
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（2）细胞病变效应（cytopathic effect ，CPE）
• 病毒在细胞内增殖后，使宿主的形态发 生不同程度改变，这种由病毒增殖引起 的细胞形态变化，称为细胞病变效应。
接种途径 按病毒侵袭部位选择相应的接种途径： • 乙型脑炎病毒及狂犬病毒 小鼠脑内接种 • 柯萨奇病毒 乳鼠腹腔接种 • 乙肝病毒 黑猩猩静脉注射 • 流感病毒 鼻腔滴种 用途
• 分离鉴定病毒，制备疫苗，制备抗血清
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（三）病毒的鉴定
病毒的初步鉴定 • 动物感染范围及潜伏期 • 对鸡胚的敏感性 • 在细胞培养中的表现 • 理化性质的测定 最后鉴定 • 血清学鉴定: 中和试验、补体结合试验、血凝抑制
主要用于新发现病毒的鉴定 （1）病毒的大小及形态 电镜直接观察 （2）核酸类型
5-溴-2-脱氧尿苷（BUDR）能抑制DNA复制，而不抑制 RNA病毒。 （3）乙醚敏感试验
有包膜病毒对乙醚敏感，经乙醚作用后，失去感染性 （4）耐酸试验
肠道病毒耐酸，在pH3的环境下稳定，鼻病毒不耐酸， 在pH3的环境下被灭活
1. 活病毒 2. 敏感细胞、鸡胚或动物
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中和试验的常用方法： • 固定V.，稀释血清，测定抗体效价 （常用） • 固定血清，稀释V.，求中和指数 中和试验的优缺点 • 特异，敏感，既可检测抗体，也可测定抗原（定属、定型）。 • 既可用细胞培养做，也可用动物或鸡胚接种，以细胞最常用。 • 检测IgG，不能用于早期诊断，常用用于流行病学调查。
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病毒的血清学鉴定
• 中和试验、补体结合试验、血凝抑制试验等
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三、病毒的血清学诊断
单份血清IgM测定 早期诊断 双份血清IgG测定 4倍以上增长，有诊断意义
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病毒血清学试验常用方法
（一）中和试验
原理 抗体与相应病毒结合后，能够使病毒失去感染性。 V.＋Ab → 失去感染易感细胞的能力 一定量抗体可中和一定量病毒。 中和试验的必要条件：
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（二）标本的运送与保存
1.低温送检
• 4℃可保存数小时 •-70℃可长期保存 • -10 ～ -20℃下病毒易灭活，不可用于保存病毒标本 • 对冷冻标本应避免反复冻融
2.保湿送检
–50%甘油盐水保存送检 – 病毒转运培养基（virus transport medium ，VTM）含0.5%明胶或
病毒感染的实验室诊断
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病毒感染的实验诊断方法
➢病原学诊断
➢病毒分离培养 ➢显微镜检查 ➢抗原检测 ➢核酸检测
➢血清学诊断
➢ 抗体检测 IgM、IgG
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一、标本采集与运送
（一）标本采集
➢采集时间：尽早采集（越早越好） ➢标本种类：根据感染的部位、可能感染的病毒类型选择
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