方法验证 (SOP, 适用于色谱类)

1.适用范围

本SOP适用于色谱类方法验证

2.参考标准/资料

3.检测方法的适用性验证内容

3.1专属性

a. 试剂空白实验：考察实验过程中所用试剂对目标物的干扰情况。

b. 干扰实验：当空白样品（样品不含目标物，其它基质一致）可获得时，直接进行空白实验（使用空白样品经过完整的样品前处理及分析过程），考察在目标物出峰时间有无干扰峰。当没有空白样品情况下，对于液相色谱，目标物有紫外吸收时可采用DAD检测器验证峰的光谱特征是否与标准品一致；另可采用不同填料色谱柱、选择不同流动相、改变梯度洗脱等方法考察目标物的出峰变化情况；对于气相色谱，可采用不同填料色谱柱、选择不同载气、改变程序升温等方法考察目标物的出峰变化情况。

注：1. 专属性：是指在样品介质中有其它组份共存时，检测方法对目标物准确而专属的测定能力。

2. 如以上方法不能确定其专属性，可由其它分析方法予以补充，例如：质谱、旋光仪、核磁共振等方法。

3. 应附代表性图谱，以说明方法的专属性，并应标明目标物在图中的位置，色谱法中的分离度应符合R s≧1.0要求（一般来说R s<1.0，两峰总有部分重叠；当R s=1.0，两峰能明显分离；当R s=1.5，两峰已完全分离；摘自《仪器分析》武汉大学化学系编，高等教育出版社2001版）。

R s=2(t2-t1)/(Y1+Y2)；t：色谱峰保留时间；Y：峰底宽。

3.2校准曲线

a. 对于含量<0.01%的痕量成分分析，样品中目标物含量一般比较低，标曲浓度范围应包含检测限及尽可能覆盖一个数量级，但不宜过宽，一般为1-2个数量级，至少作5个点（不包括空白）。

b. 对于含量>0.01%的常量与微量成分分析，可根据方法定量限和实际样品含量选择标曲浓度范围，标曲浓度范围尽可能覆盖一个数量级，但不宜过宽，一般为1-2个数量级，至少作5个点（不包括空白）。

c. 应描述校准曲线的数学方程，相关系数不应低于0.99。

注：1. 在分析化学中，根据分析试样中待测成分的含量多少，分析化学可以分为：

常量成分分析（质量分数>1%）、微量成分（0.01%~1%）分析和痕量成分分析（<0.01%）；摘自《分析化学》武汉大学主编，高等教育出版社2000年第四版）。

2. 确定测试样品中被测成分浓度应在校准曲线的线性范围内。

3. 标曲中每个浓度水平分置在3个进样瓶中，分别进样，结果取平均值。

4. 应附相关图谱。

3.3 检出限与定量限

a.（首选）信噪比法：把已知低浓度试样测出的信号与空白样品测出的信号进行比较，计算出能被可靠地检测出的最低浓度或量。一般以信噪比为2:1/3:1时相应浓度确定检测限，信噪比为10:1时相应浓度确定量限。

b.（可选）空白值标准偏差法：

C L=（2或3）S b/b

式中：C L-方法的检出限

S b-空白值标准偏差（一般平行测定20次得到）

b-方法校准曲线的斜率

对于定量限一般为检出限的3倍。

注：1. 检出限:被测物能被检测出的最小值。

2. 定量限:被测物能被准确测定的最小量，其测定结果应具有一定准确度和精密度。

3. 无论用哪种方法，均需制备相应检出限浓度的样品，反复测试进行确定。

4. 检测方法SOP编写时应将仪器检出限和定量限换算为方法检出限和定量限。

5.应附相关图谱。

3.4 准确度（回收率）

a. 对于含量<0.01%的痕量成分分析，样品中目标物含量一般比较低，回收率应在方法检出限、三倍方法检出限、十倍方法检出限进行三个水平实验，每个水平测定次数至少为3次。回收率要求参考范围见表1。

b. 对于含量>0.01%的常量与微量成分分析，可在定量限附近和根据实际样品含量选择合适点进行三水平（高、中、低）实验，每个水平测定次数至少为3次。回收率要求参考范围见表2。

注：1. 准确度是指用该方法测定的结果与真实值或参考值的接近程度，一般以回收率（%）表示。

2. 对于样品基质或前处理特别复杂的实验，回收率要求可根据条件适当放宽。

3. 标准品与样品应混合均匀，所有加标样品必须经过完整的前处理过程。

4. 回收率实验一般有两种方式。在空白样品可获得的情况下，通过在空白样品中加入已知量A的标准对照品，进行回收试验，其回收率可表示为：

R=(M-空白)/A*100%

式中：R：回收率（%）

M：试验测定值

A：加入已知标准品的量

在空白样品不可获得，但可以得到已知量的真实样品时（样品含量应尽量接近或小于检出限，否则会影响加标实验），可通过在真实样品中加入已知量A的标准对照品，进行回收试验，其回收率可表示为：

R=(M-P)/A*100%

式中：R：回收率（%）

M：真实样品中加入标准对照品后试验测定值

P：真实样品的试验测定值

A：加入已知标准品的量

5. 标准品与样品充分混合均匀时，可配制不同水平（高、中、低）加标样品各一个。针对同一个加标样，重复取样检测6次，可同时考察本浓度水平的回收率与精密度情况。

6. 应附相关图谱。

3.5 精确度（重复性）

a. 根据实际样品含量选择一合适点（一般取实际样品含量范围的中间值）进行考察，重复测定次数至少为6次。实验室内部重复性考察的相对标准偏差参考范围见表3。

b．（根据实际情况选作）重复性限r：根据实际样品检测需求选择一（一般取含量范围的中间值附近）或多个浓度水平进行考察，每个浓度水平重复测定次数建议为20次，对应的重复性限r=2.8σ, σ为标准差。

c.（根据实际情况选作）中间精密度：根据实际样品检测需求选择一（一般取含量范围的中间值附近）或多个浓度水平进行考察。要求不同的分析人员采用相同的分析方法、在不同的时间、使用不同的仪器进行测试，以确认方法的适用性。

注：1. 精密度是指在规定的测试条件下，同一个均匀的样品，经过多次取样测定所得结果之间的接近程度，即一组测量值彼此符合的程度，一般用相对标准偏差表示。

2. 重复性限是一个数值，在重复性条件下，两个测试结果的绝对差小于或等于此数的概率为95%。

3.中间精密度：在一定测量条件下的测量精密度，这些条件包括相同的测量程序、相同地点并且对相同的样品在一长时间段内重复测量，但可包含其它相关条件的改变（如设备系统、操作者和环境条件等变量）。

4. 有的样品含量范围比较宽，考察一个浓度点的重复性代表性不够，可选择在方法检出限和常见样品浓度之间选择高、中、低三水平进行重复性考察，每个水平重复测定次数至少为6次。

5. 本SOP对重现性及重现性限等暂不作要求。

6. 应附相关图谱。

3.6系统适用性