瘤胃微生物定量方法的研究进展_郭同军
瘤胃微生物类群的多样性及其综合发酵的研究进展
ｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ） 在瘤胃中常被检测到。如降解淀粉为主的 Ｒ． ｂｒｏｍｉｉ（ Ｋｒａｕｓｅ 等， １９９９） ； 降解纤维为主的 Ｒ． ｆｌａｖｅ－ ｆａｃｉｅｎｓ 在孙 云章 （ ２００５） 的 研 究 中 占 测 序 克 隆 子 中 比 例 为 ２．０８％； 在 Ｋｒａｕｓｅ 等 （ １９９９） 报 道 中 占 有 ２．２％的 比例， 是以粗饲为主的反刍动物瘤胃中的常在菌类。
狭义遗传多样性是指种内基因的变化， 包括种内 Ｓｕｎｄｓｅｔ 等 （ ２００７） 对 ｒｅｉｎｄｅｅｒ 瘤 胃 微 生 物 １６Ｓ ｒＲＮＡ
ｇｅｎｅ 的测序结果表明 Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌｅｓ 的比例为
王梦芝 ， 扬 州 大 学 动 物 科 学 与 技 术 学 院 ， 博 士 ， ２２５００９， 江 苏省扬州市文汇路东路 １２ 号。
用于构建系统树的 １６Ｓ ｒＤＮＡ 序列 ６ ２０５ 个， 而随着 ｃｌｕｓｔｅｒｓ） （ Ｐｒｙｄｅ 等， ２００２） 。
研究的不断深入，还有新发现的序列不断上传，丰富瘤
瘤胃中除有种类繁多的革兰氏阳性菌外尚存在一
胃微生物的基因库，足以说明其遗传多样性的丰富。 定比例的同样种类繁多的革兰氏阴性菌（ 安登第，２００３） 。
和基因表达具有很大的差异。目前，据 １６Ｓ ｒＤＮＡ 序列 维二糖、蔗糖、淀粉和糖原等几种 ＣＨＯ， 主要产生或只 同源分析建立的核糖体小亚基 １６Ｓ ｒＤＮＡ 和 １８Ｓ ｒＤＮＡ 产生丁酸， 其 ＤＮＡ 的 Ｇ＋Ｃ 摩尔百分比是 ４２．３％。据
（精选）近10年瘤胃微生物分离培养研究进展
China）
【Abstract】 The research of rumen microbiology is the key of ruminant nutrition． A large number of microorganisms par-
ticipating in nutritional metabolism have been isolated from rumen since the middle of 20th century． Nowadays，although it is
more and more popular to use molecular biological methods in the study of rumen microorganisms，traditional methods still play
瘤胃微生物总DNA快速提取法研究
第27卷第1期家畜生态学报Vol.27No.1 2006年1月Acta Ecologiae Animalis Domastici J an2006瘤胃微生物总DNA快速提取法研究淡瑞芳1,龙瑞军1、23,杨予海3(1.甘肃农业大学草业学院,甘肃兰州 730070;2.中国科学院西北高原生物所,青海西宁 810008;3.青海省三角城种羊场,青海刚察 812300)[摘 要] 本文介绍了一种简便快速地提取瘤胃微生物细胞总DNA的方法,该法是对提取植物的CTAB法进行改进而成。
与经典反复冻融+SDS/蛋白酶K裂解法相比,该法可在数小时内高效地提取瘤胃内容物总DNA,经琼脂糖凝胶电泳对所提取瘤胃微生物总DNA进行检测,证明所获得的瘤胃总DNA符合分子生物学操作要求。
[关键词] 瘤胃微生物;DNA提取;C TAB;SDS[中图分类号] S811.5[文献标识码] A [文章编号] 100425228(2006)0120018204 反刍动物瘤胃微生物一直是一个研究热点,但由于瘤胃是一个特殊的厌氧环境,采用传统的微生物培养不但耗时耗力,而且不能全面了解瘤胃微生物。
直接提取样品中微生物总DNA进行分析的方法,避开了纯培养的步骤,减少了处理时间[1],而且能对很多难培养的微生物进行分析。
目前报道的瘤胃微生物的DNA提取方法有三种:十二烷酰-肌氨酸/蛋白酶K裂解法,是用终浓度含2%的十二烷酰-肌氨酸和2mg/mL蛋白酶K的缓冲液裂解细胞抽提其总DNA[3](T ajima等,1999);反复冻融+SDS/蛋白酶K 裂解法[4](Barns等,1994),是将样品与抽提缓冲液混合后在-80℃和65℃间反复冷冻-消融,使细胞壁裂解,然后用SDS和蛋白酶K处理获得总DNA。
和玻璃珠破碎法是利用机械力破坏细胞壁暴露DNA[5] (Stahl等,1988)。
在这两种方法中,第二种所获得的总DNA所包含的微生物较为广泛,而第一种方法偏好于“较易裂解”的革兰氏阴性细菌,其覆盖范围相对较窄[3](T ajima,1999),第三种方法应用较为广泛,已多为研究者采用[6、7](Wood等,1998、T ajima等, 2000)。
瘤胃微生物定量方法研究进展
瘤胃微生物定量方法研究进展杨舒黎,王加启,卜登攀(中国农业科学院北京畜牧兽医研究所动物营养学国家重点实验室,北京 100094)摘要:瘤胃微生物的定量有传统计数和现代分子定量2大类方法。
其中,传统方法包括经典的亨氏滚管法和最大可能法,但它们测定瘤胃微生物总数的结果可能偏低。
运用分子方法定量一些重要的微生物不仅能很好地解释它们在瘤胃代谢中的作用,而且有助于描述更多的微生物特性。
因此,作者综述了瘤胃微生物定量方法的发展历程及研究进展,重点描述了运用分子定量方法的研究情况。
关键词:瘤胃微生物;传统计数;分子定量中图分类号:Q9323 文献标识码:A 文章编号:167127236(2007)0320005204 反刍动物的瘤胃内栖息着复杂、多样、非致病的各种微生物,包括瘤胃细菌、原虫、真菌和噬菌体等几大类,形成一个十分复杂的微生物系统。
细菌的数量最大,瘤胃内容物中细菌达1010～1011个/ml, 200多种;瘤胃原虫104～106个/ml,25个属;厌氧真菌游动孢子数103～105/ml,6个属;噬菌体颗粒数可达107～109/ml(Hespell等,1997;Orpin等, 1997;Stewart等,1997;Miron等,2001)。
Krause 等(1996)对细菌的多样性进行了大量的研究,他们认为瘤胃中主要的细菌有22种。
这些研究都是基于传统的培养方法,如亨氏滚管计数法(roll2t ube technique)(Hungate,1966,1969)和最大可能计数法(most probable number technique,M PN)(De2 hority等,1989),培养的已知菌种可能不完全适合培养条件或者进入了未培养状态,因而测定的瘤胃微生物总数可能偏低。
瘤胃微生物数量巨大、种类繁多,且绝大多数严格厌氧,体外培养困难,阻碍了对瘤胃微生物的研究,因此,寻找快速、准确、灵敏的新方法已成为瘤胃微生态研究的迫切需要与必然趋势。
瘤胃微生物区系及其相互关系的研究进展
处于 动态 半衡 ，维 系 着机 体正 常 的生 长和 营养 。瘤
协 同叉制 约的动 态平衡 关 系。文章主要 论述 了瘤 胃内细菌 、真菌和原 虫的分类、存在形式及其在反 刍动物 中的应 用等 ，并 阐述 了瘤 胃微 生物之 间的相 互关系。
关键 词 ： 瘤 胃 ；微 生物 ；反 刍动 物 中 图 分 类 号 ：Ｑ ５ ：￥ ２ ． 文 献标 志 码 ：Ａ 文 章 编 号 ： １０ — ０ ４ ２ １ ）８ ０ ０ — ５ ９ ９ ８ ３８ ０ １ ０ ８ （０ １０ — ０ ９ ０
动 物 正 常 营 养 、生 理 和 防御 功 能 起 着 举 足 轻 重 的
动孢 子 数 则 在 １ ｌ ・ ～ ０～ ０个 ｍＬ 、噬菌 体数 量 在 １ ０～
ｌ。 ０微粒 ・ Ｌ 。 ｍ‘ …。瘤 胃内 的微 生 物种 群 与 反 动物 宿 主之 间 以及各 种 微 生物 之 间 （ 菌 与 原虫 、细 菌 细 种 问 ） 成 了一 个 复 杂 而完 善 的生 态 系统 ，保 证了 形
瘤 胃微 生 物 区 系是 寄 居 于 反 刍 动 物 瘤 胃 内 的
一
大 、相互 之 问仔 在着竞 争 和协 同 的复杂 关 系 ，但 是
这种 复 杂 的 、混 合 的微 生 态 区 系在 反 刍动物 瘤 胃内
个 复 杂 的微 生 物 群 落 。瘤 胃为 瘤 胃微 生 物 的生
存 和 繁 衍 提 供 持 续 而稳 定 的 环境 条 件 ，瘤 胃微 生
瘤胃微生物的传统定量方法在反刍动物中的应用
通 信 作 者 ： 英 庭 （９ ２ ， ， 东 省 乳 山市 人 ， 授 ， 士 生 导 师 ， 林 １６ 一）男 山 教 硕 主 要 从 事 反 刍 动 物 营养 研 究 。
一
是数 量 最 多而 且 最 为重 要 的微 生物 ． 胃内 容物 中 瘤
细菌 达 ｌ ｌ “个／ ．０ Ｏ一０ ｍＬ ２ ０多 种 ： 胃原 虫 ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ４ １ 瘤 ０～ ０
个 ／ ，５个 属 ； 氧 真 菌 游 动 孢 子 数 ｌ 。１ ／ ， ｍＬ ２ 厌 ０～ ０ 个 ｍＬ
６个 属 ； 噬菌 体颗 粒 数可 达 １ １ ｍＬ 由众 多 的 ０～ ０ 个／ 。
亨 盖 特 厌 氧 滚 管 技 术 是 美 同 微 生 物 学 家 亨盖 特 （ ｕ ｇｔ） １ ５ Ｈ ｎ ａ 于 ９ ０年 首 次提 并 应用 于瘤 胃厌氧 ｅ 微 生物 研究 的一种 厌氧 培 养技术 。以后这 项技 术经
用 模 拟 瘤 胃环 境 而设 计 的培 养 基 ， 瘤 胃微 生 物进 对 行 分 离 、 培 养 、 数 、 态 鉴 定 、 理 生 化 特 性 的 纯 计 形 生
鉴别 、 分类 等 。瘤 胃细菌 与真 菌 的数 量用 显微 镜直接
计数 ， 常采 用滚 管 法 计 数 ， 以及 最 大或 然 数 计 数 法 。 微 生 物学 家 从 上 世纪 ５ ０年 代 就 开 始 研 究 瘤 胃细 菌 的培 养方 法 ， 中最 为 经 典 的 是亨 氏滚 管 法 和 最 大 其
关 键 词 ： 胃 微 生 物 ； 氏 滚 管 法 ； 大 或 然 法 瘤 亨 最
反 刍 动 物 在 长 期 的 自然 进 化 过 程 中 形 成 了独
等 ，９ ９ ， 养 的 已知菌 种 可能不 完 全适 合培 养 条 １８ ） 培 件 或 者进 入 了未 培养 状 态 ， 因而 测 定 的瘤 胃微 生 物
瘤胃微生物的研究进展111
瘤胃微生物的研究进展朱河水1,陈宇2,刘记强1(1.河南农业大学,郑州 450002;2.河南省畜牧局,郑州 450008)摘要:瘤胃微生物的活动受很多因素的影响,作者对蛋氨酸、肽类、有机酸、不同日粮类型等对瘤胃微生物代谢活动的影响及相关研究方法进行了综述。
对生产实践中合理使用添加剂,增强瘤胃微生物的利用率,提高反刍动物的生产性能有重要意义。
关键词:微生物;瘤胃中图分类号:S811.6 文献标识码:A 文章编号:167127236(2007)0920014203 瘤胃微生物在反刍动物的消化中占有重要地位。
反刍动物对各营养物质的消化利用情况受瘤胃微生物的种类及其之间的数量比例影响,同时瘤胃微生物的代谢活动一方面受动物有机体分泌的活性物质的调节,另一方面受日粮中不同物质的影响。
利用各种物质调控瘤胃微生物的活动,从而增强反刍动物的消化功能,提高其生产性能已是现在反刍动物研究中的热点。
目前有关瘤胃微生物的研究多采用瘤胃液体外培养的方法,同时现代分子生物学相关技术也得到了应用。
作者就目前有关瘤胃微生物的研究情况进行了分析和总结。
1 蛋氨酸对瘤胃微生物代谢活动的影响蛋氨酸(Met )是动物的必需氨基酸,也是反刍动物的限制性氨基酸,由于瘤胃微生物的发酵降解,日粮中直接添加蛋氨酸不能明显增加其进入小肠的量,但可以影响瘤胃微生物的活动,间接影响动物的消化和吸收。
在无其他氮源和碳源的条件下,体外培养的瘤胃液中添加Met ,对微生物谷草转氨酶和谷丙转氨酶活性无明显影响,但可使产物中游离甘氨酸(Gly )含量和Met 含量极显著增加。
培养液中收稿日期:2007203219作者简介:朱河水(1975-),男,河南人,博士生,主要从事反刍动物生理生化研究。
通讯作者:刘记强。
游离半胱氨酸(Cys 2s )和丝氨酸(Ser )含量随培养时间的增加而减少,培养16h 培养液中的游离组氨酸(His )含量较培养8h 显著提高。
由此可见,Cys 2s 、Ser 和His 可能对以Met 为唯一氮源和碳源的瘤胃微生物是十分重要的氨基酸。
瘤胃微生物的分离、鉴定及定量分析技术
１１ 瘤 胃中的细 菌 ．
瘤 胃细 菌数量 巨大 ． 胃内容物 中细菌达 １ １ １ ｎ 瘤 ０￣ ０ 个／ 。 ｍＬ 已从 瘤 胃分 离 出 ２ ０多种 ， ２ ０ 分 ９个 属 ． 多 数 大 为 厌氧 菌和兼 性 厌氧 菌 。１ ６ ９ ６年 Ｈ ｎ ａｅ 瘤 胃内细 ｕ ｇｔ 将
摘 要 ： 胃微 生物在 反 刍动物饲 料 营养物 质 消化 中起 着举足 轻重 的作 用 ， 胃微 生物 的分 离、 定及 定量 分析技 术 瘤 瘤 鉴
是研 究瘤 胃微 生物 生长及 动 态 变化规 律 的重要 手段 。本 文对瘤 胃微 生物 的分 离、 定及 定量 分析 技 术进行 了简要 鉴
菌 分成 ｌ 类 ， １ 即纤维 分 解菌 、 纤 维素 分解 菌 、 白分 半 蛋 解菌、 淀粉分 解 菌 、 肪 分解 菌 、 生素 合成 菌 、 脂 维 甲烷 产 气 菌 、 用 糖 的 细 菌 、 用 酸 的细 菌 、 氨 细 菌 和尿 素 利 利 产
分 解细 菌等［ １ ］
一Leabharlann 的机体 健康 、 高反 刍 动物 的生 产性 能 、 少环 境 污染 提 减
作 者 简 介 ： 建 ￣，１ ８ 一 ， ， 读 硕 士研 究 生 ， 孙 ｑ（９ ５ ）女 在 主要 从 事动 物 营 养 与 饲
单糖 和双 糖作为生长介质 ， 分瘤 胃细菌利用纤 维素 、 一部 半 纤 维素及 其 分解 产物 作 为生 长介 质 ： 另外 ， 胃细菌 瘤 生长 还 需要 无 机 氮 、 机氮 以及 维 生 素 Ｂ族 中的一 种 有
Ｎ ｗ ｅ ｌｎ ． ： ｒ ｓ ． ｔ ． ｄ ．ｏａ ｅｌｇ ｍｅ ｒＥ ｅｇ — ｅ Ｚ ａａ ｄＩ Ｂｕｎ Ｃ ｅ ， ｓＦ ｒｇ ｕ ｓｆ ｎ ｒｙ ｎ Ｊ １ ａ ｅ ｅ ｏ
牛瘤胃微生物定量测定方法研究进展
牛瘤胃微生物定量测定方法研究进展荆元强;宋恩亮;杨维仁;刘桂芬;谭秀文;万发春【摘要】瘤胃微生物数量测定一直是反刍动物营养的难点之一.传统的定量方法有亨氏滚管法和最大可能计数法(MPN)两种,方法简单,但工作量大,测定结果与实际存在偏差.现代分子定量技术的出现和发展,为瘤胃微生物数量的测定提供了一种新的思路和方法.如核算分子杂交技术、变性梯度凝胶电泳(DGGE)或温度梯度凝胶电泳(TGGE)、定量PCR技术等.随着现代分子定量技术的不断发展和完善,人们对瘤胃微生物的定量研究必将更加深入.论文简要对瘤胃微生物数量测定方法进行了综述,旨在为开展瘤胃微生物的研究提供参考.【期刊名称】《动物医学进展》【年(卷),期】2011(032)007【总页数】4页(P93-96)【关键词】瘤胃微生物;传统定量;分子定量【作者】荆元强;宋恩亮;杨维仁;刘桂芬;谭秀文;万发春【作者单位】山东农业大学动物科技学院,山东泰安271018;山东省农业科学院畜牧兽医研究所,山东济南250100;山东省畜禽疫病防治与繁育重点实验室,山东济南250100;山东省农业科学院畜牧兽医研究所,山东济南250100;山东省畜禽疫病防治与繁育重点实验室,山东济南250100;山东农业大学动物科技学院,山东泰安271018;山东省农业科学院畜牧兽医研究所,山东济南250100;山东省畜禽疫病防治与繁育重点实验室,山东济南250100;山东省农业科学院畜牧兽医研究所,山东济南250100;山东省畜禽疫病防治与繁育重点实验室,山东济南250100;山东省农业科学院畜牧兽医研究所,山东济南250100;山东省畜禽疫病防治与繁育重点实验室,山东济南250100【正文语种】中文【中图分类】S854.47反刍动物的瘤胃是一个复杂而又独特的微生态系统,其内栖息着多种多样的微生物。
这些微生物的存在使瘤胃成为反刍动物消化吸收的最重要部位。
因此,研究瘤胃微生物的种类和数量变化有助于探索瘤胃在反刍动物消化代谢体系中的作用机理,进而达到调控瘤胃功能的目的[1]。
体外产气法研究不同钾水平日粮对绵羊瘤胃发酵的影响
ＡＤ 粉
３２ ． Ｉ Ｏ １ ｏ
ｏ】 ． ０５ ． Ｏ６ ． ｌ
ｏ１ ．
代谢 能 （ ／ｇ ＭＪｋ ） Ｎ （ ＤＦ ％） Ａ （ ） ＤＦ ％
Ｃｆ ） ａ％ Ｐ％） （ Ｋ（ ） ％
平 的 日粮 。Ａ组 为对 照组 （ 础 日粮 ）Ｂ组 （ 基 ， 基础 日
粮 ＋ ３ ｇ ｇ ， ５ ８ｍ ／ ）Ｃ组 （ 础 日粮 ＋ ８ ｇ ｇ ， ｋ 基 １ ４ｍ ／ ）Ｄ组 （ ０ ｋ 基
础 日粮 ＋ ３ ｇ ｇ ，使 四组 的 钾 水 平 分 别 达 到 １６ １ｍ ／ ） ｋ １ ％、． ２２ ． １ ％、． ４ ８ ％和 ２６ 每个 处理设 ３ 重复 。 ．％。 个 在体
Ｎ Ｎ浓度 、 Ｈ一 纤维 酶活 性 、 发性 脂 肪酸浓 度 以及 干 挥
大 豆 粕 葵 花 籽 粕
含量（ ％） ６ ５ ４ ５５ ．
营 养 水平 干物质（ ） ％ 粗蛋白（ ） ％ 粗脂 肪 （ ） ％
８． ９３
ｌ． ６４ ３ １ ．３
棉 籽 粕 菜 籽 粕 小 麦 麸
ｔ 人工 瘤 胃微生物 培养液组 成 ． ５
参考 Ｍｅｋ ｎｅ等（９９的活 体外产气 法进行 配制 ， １７ ）
２ １ 郭鹏举 ， 石河子 大学动物科技 学院 ，３０ ３ 新疆乌鲁木 瘤 胃液与人工培养液的比例为 １： ，加入数滴 ｎ ％的刃 ８０ １，
齐市安 宁 渠 ２号 天 康 生 物 添加 剂有ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ限 公 司。
转化率 及生 产性 能一 直是 反 刍动物 营 养研究 的重点
之一。 对瘤 胃微 生物的生长 以及瘤 胃发 酵都是必需 钾 的 ， 同钾水平 的 日粮 在很大程 度上影 响 了瘤 胃发 酵 不
瘤胃微生物对蛋氨酸的利用及微生物氮流转特征研究
蛋氨酸作为生长山羊玉米－豆粕型精料和玉 米－秸秆型饲粮的第一限制性氨基酸，能够提高反 刍动物氨基酸利用效率，其缺乏会导致其他氨基 酸的利用率下降［１］ 。 瘤胃保护性蛋氨酸能改善反 刍动物生产性能。 据报道，瘤胃保护性蛋氨酸能 提高山羊的产奶量和乳品质［２］ ，提高荷斯坦 奶 公 牛的生长效率和能量利用效率［３］ ，泌乳期奶 山 羊 饲喂瘤胃保护性蛋氨酸能够减少体重损失［４］ 。 瘤 胃非保护性蛋氨酸在反刍动物上的应用也有一定 的研究。 Ｂａｒｒｙ 等［５］ 研 究 发 现， 腹 膜 注 射 和 口 服 ＤＬ－蛋氨 酸 均 能 提 高 青 年 绵 羊 的 增 重；王 杰 等［６］ 研究发现，限制饲粮中蛋氨酸水平会降低羔羊瘤 胃重量、 生 长 性 能 和 屠 宰 性 能， 恢 复 蛋 氨 酸 水 平 后，羔羊生 长 性 能 及 内 脏 器 官 发 育 状 况 也 随 之 恢
１ 材料与方法
１．１ 试验材料 发酵底物：玉米－豆粕型精料及玉米－秸秆型 基础饲粮，基础饲粮组成及营养水平见表 １。 添加剂：蛋氨酸为同位素标记的碳 １３ 蛋氨酸 （ １３Ｃ⁃Ｍｅｔ） ，纯度 ９８％，碳 １３（ １３ Ｃ） 标记率 ９９％，由 美国安德沃公司提供，其中蛋氨酸碳链上的 １ 号 碳原子用１３ Ｃ 标记。 １．２ 试验方法 １．２．１ 试验设计 本试验采用单因子随机区组试验设计，设置 对照组（Ｃ 组）和试验组（ Ｔ 组），对照组不添加蛋 氨酸，试验组添加 ０．３３ μｍｏｌ 蛋氨酸（ 具体添加物 为１３Ｃ⁃Ｍｅｔ，以 ０．１８ ｍＬ 溶液的形式添 加 到 体 外 培 养底物中） ， 蛋 氨 酸 添 加 量 参 照 Ｆｏｗｌｅｒ 等［１２］ 的 研 究。 每组 设 置 １２、２４、３６、４８、７２ ｈ ５ 个 采 样 时 间 点，每个采样时间点设置 ３ 个样品重复。 １．２．２ 人工瘤胃液配制 晨饲前采集 ３ 头瘘管羊瘤胃食糜，用 ６ 层纱布 过滤，滤液等体积混合后，装入事先充满 ＣＯ２ 并预 热到 ３９． ５ ℃ 的 保 温 瓶 中， 迅 速 带 回 实 验 室， 与 ３９．５ ℃ 预热的厌氧缓冲液混合（ 缓冲液体积∶瘤胃 液体积 ＝ ４∶１） ，缓冲液按照 Ｃｏｎｅ 等［１３］ 提供的配方 配制，并持续通入 ＣＯ２。 １．２．３ 体外培养 称取 ０．５ ｇ 玉米－豆粕型精料和 ０．５ ｇ 玉米－秸 秆型饲 粮 于 发 酵 瓶 中， 向 试 验 组 发 酵 瓶 中 加 入 ０．１８ ｍＬ蛋氨 酸 溶 液， 对 照 组 加 入 ０． １８ ｍＬ 蒸 馏
牛瘤胃与肠道微生物多样性的研究进展
动物营养学报2014，26（4）：852-862C hi ne s e J our nal of A ni m al N ut r i t i ond o i ：10.3969/j .i ssn .1006-267x.2014.04.004牛瘤胃与肠道微生物多样性的研究进展马 晨 张和平*刘彩虹 赵 洁（内蒙古农业大学，乳品生物技术与工程教育部重点实验室，呼和浩特010018）摘 要：牛瘤胃与肠道中的微生物区系共同影响着宿主的营养与健康。
宏基因组学与代谢组学的飞快发展，帮助研究者逐渐解析了牛体内这2大微生物群落的真实面貌。
二代高通量测序技术的出现，加快了挖掘瘤胃微生物与肠道微生物这2大基因库的速度，使得对其中功能基因的筛选更加高效。
牛共生微生物的研究不局限于基础科学，其成果在工业生产、食品安全检测、疾病诊疗与预防等许多领域都得到很广泛的应用。
本文综述了近些年来围绕牛的瘤胃和肠道共生微生物的研究报告，例举了大量瘤胃细菌、真菌、古菌的研究，宏基因组学的研究以及常见疾病诊疗预防的研究，旨在为养殖业与乳品行业生产中遇到的难题提供科学有效的指导。
关键词：牛；瘤胃微生物；肠道微生物；微生物多样性中图分类号：S823 文献标识码：A 文章编号：1006-267X （2014）04-0852-11收稿日期：2013-11-12基金项目：农业部现代农业产业技术体系建设项目（C A R S-37）作者简介：马 晨（1986—），女，内蒙古呼和浩特人，博士研究生，从事肠道微生物研究。
E -m a i l ：m a c he n21@s i na .c om *通讯作者：张和平，教授，博士生导师，E-m a i l ：he pi ngdd@vi p.s i na .c om牛是反刍动物，具有不同于其他食草动物的特殊生理结构，可食用难以被其他动物体所消化的纤维素物质，并通过自身的生物转化，将一些人类无法直接利用的营养物质合成动物性蛋白质（肉、奶），为人类所利用[1]。
瘤胃微生物研究进展
瘤胃微生物与瘤胃发酵调控研究进展一、国内研究进展1.植物提取物对瘤胃发酵调控的影响陆燕等(2009)综述了大蒜素及其抑菌机制，以及大蒜素对甲烷产量和瘤胃发酵的影响。
认为大蒜中活性物质能调控瘤胃发酵模式，可抑制瘤胃内甲烷生成，降低蛋白降解率，降低氨态氮浓度，保护过瘤胃蛋白。
与其他植物提取物相比，添加低浓度的大蒜素对饲料消化率的负面影响较小，具有很大的开发前景。
林波等（2009）综述认为植物提取物中的挥发油、皂苷、生物碱、萜类等化学物质具有抗菌、促生长、提高免疫力和抗氧化等功能。
并总结近年来研究发现，植物提取物还可以调控反刍动物瘤胃发酵模式，提高氮存留，减少甲烷排放的功能，因此，植物提取物作为调控反刍动物瘤胃发酵的一种重要添加剂得到了广泛的研究与应用。
目前国内外的学者已经在有效植物品种的筛选和植物提取物作用机理、剂量效应等方面的研究取得了较大进展。
文中就目前植物提取物对反刍动物瘤胃发酵调控的最新研究进展作一综述，为我国开展植物提取物作为反刍动物瘤胃发酵调控添加剂的研究提供参考。
李世霞(2009)以4只安装永久性瘤胃瘘管的徐淮山羊羯羊为试验动物，探讨银杏叶提取物对山羊瘤胃发酵参数、纤维降解及各血清指标的影响，旨在寻找一种新的瘤胃发酵调控剂。
研究结论如下：①以淀粉、酪蛋白和纤维素粉为底物，探讨银杏叶提取物对山羊瘤胃体外发酵的影响，发酵时间24h，银杏叶提取物可降低pH值、NH3-N浓度、原虫蛋白产量和乙丙比，提高发酵的产气量、乙酸、丙酸、丁酸、TVFA浓度和细菌蛋白产量；②以淀粉、酪蛋白和纤维素粉为底物，探讨银杏叶提取物对山羊瘤胃体外纤维降解的影响，随着银杏叶提取物添加量的增加，纤维素降解率呈上升趋势，添加量为1.2%时，纤维素降解率可达到55.30%；银杏叶提取物可提高滤纸纤维素酶、和木聚糖酶的活性，对木聚糖酶的影响最大；银杏叶提取物可增加产琥珀酸丝状杆菌、白色瘤胃球菌和黄色瘤胃球菌的数量；③通过体内试验得出：瘤胃发酵参数的结论与体外试验一致，本试验所设定的银杏叶提取物的添加范围对山羊各血清指标没有显著影响，此添加范围对山羊机体是安全的、可靠的。
瘤胃微生物蛋白测定方法
瘤胃微生物蛋白测定方法
瘤胃微生物蛋白的测定方法主要包括以下几种：
1. 体内法：通过测定动物采食前后瘤胃内氨氮浓度的变化，间接计算瘤胃微生物蛋白的产量。
这种方法简单易行，但准确性相对较低。
2. 离体法：将瘤胃液取出后进行培养，测定培养过程中微生物蛋白的合成量。
离体法可以更准确地反映瘤胃微生物蛋白的合成情况，但操作较为复杂。
3. 同位素标记法：利用放射性或稳定性同位素标记饲料，追踪其在瘤胃内的代谢过程，从而确定微生物蛋白的合成量。
这种方法精度高，但成本也较高。
4. 免疫学方法：利用特异性抗体检测瘤胃微生物蛋白或其代谢产物，如酶联免疫吸附法（ELISA）等。
这种方法快速、灵敏，但需要特异性高的抗体。
5. 蛋白质组学方法：通过分析瘤胃微生物的蛋白质组成，确定微生物蛋白的含量和变化。
这种方法可以提供更全面的信息，但技术要求较高。
在实际应用中，通常会根据实验条件和研究目的选择合适的方法。
同时，为了提高测定结果的准确性，还需要注意样品的采集、处理和保存等环节。
瘤胃微生物的研究方法
瘤胃微生物的研究方法
研究胃癌微生物的方法包括：一、细菌培养法运用细菌培养法是研究胃癌微生
物最常用的方法，它能够清晰地分离出胃癌微生物，并有利于确诊胃癌微生物的分类。
此外，培养法还能够检测胃癌微生物的生长过程，并能够收集胃癌微生物的信息，建立起胃癌微生物的文献数据库，以及准确确定有害微生物对胃癌微生物引发疾病的影响程度。
二、PCR-DGGE技术PCR-DGGE技术（Polymerase Chain Reaction-Denaturing Gradient Gel Electrophoresis）是一项无分离媒介高灵敏检测技术，主要应用于检测环境界面中DNA聚合物、真菌、细菌等.由于此技术能够检测低浓度的微生物，在检测胃癌微生物中有较大的应用价值。
三、免疫电镜法免疫电镜是一种可以结合传统的电镜技术，利用抗体及特异性
探针，通过免疫反应来记录病原微生物形态、位置和生长状态，更快更准确地进行病原微生物检测。
在研究胃癌微生物时，免疫电镜可以迅速有效地确定胃癌微生物的分布及表型，对于深入研究胃癌微生物的生物学特性具有十分重要的意义。
四、荧光原位杂交技术荧光原位杂交技术（FISH）是一种高灵敏、高特异性的
分子生物学技术，通过intact真核或细胞的细胞来检测微生物的存在，并可以确
定其种类。
在研究胃癌微生物时，即可准确地判断胃癌微生物种，也可以对其表型进行描述，便于细胞分类判定。
以上就是关于研究胃癌微生物的几种方法，它们分别可以检测胃癌微生物的分类、状态和形态、位置和生长情况，为胃癌微生物研究奠定了坚实的基础，并以此深入挖掘胃癌微生物的秘密，为诊断和治疗胃癌提供有力的支持。
反刍动物瘤胃微生物多样性的研究进展
反刍动物瘤胃微生物多样性的研究进展摘要：瘤胃微生物区系是一个组成和功能极其复杂的体系，微生物的多样性决定了动物机体的健康和生产性能。
反刍动物的瘤胃中栖息着复杂多样的微生物，包括瘤胃原虫、细菌、真菌和古甲烷菌等，具有种类多样性和相互作用的复杂性。
庞大的微生物群落参与日粮营养物质的降解过程，对饲料利用和宿主自身代谢有深远的影响。
研究反刍动物胃肠道微生物多样性有助于了解其结构、功能、影响因素以及可能的调控措施。
本文就反刍动物瘤胃内环境和瘤胃微生物多样性的研究进展做一简要综述。
关键词：反刍动物、瘤胃微生物、多样性反刍动物的瘤胃约占全胃的80 %, 除反刍、食管沟反射和瘤胃运动外, 尚有微生物群系独特的生理作用。
瘤胃微生物的种类极为多样，每毫升瘤胃内容物中有不同种类细菌1010～1011个,已从瘤胃分离出200多种，分29个属，大多数为厌氧菌和兼性厌氧菌。
饲料在瘤胃中经微生物发酵降解为挥发性脂肪酸、肽类、氨基酸及氨等成分, 同时利用氮源、能源等合成微生物蛋白及B 族维生素等。
很显然, 瘤胃是反刍动物的一个极其重要的营养消化器官，就像一个庞大密闭发酵罐, 在整个消化过程中起着重要的作用。
研究反刍动物瘤胃微生物的多样性，首先要了解瘤胃内环境，即微生物的栖息之所。
1 瘤胃内环境的特点瘤胃可看作是一个供厌氧微生物繁殖的发酵罐, 具有微生物活动及繁殖的良好条件。
1.1 瘤胃内的温度：瘤胃内的温度大约39-40℃, 比体温稍高一些。
瘤胃微生物在这一恒定温度下才能有最好的生长和繁殖, 瘤胃原虫在高于40℃的环境中难以存活。
1.2 瘤胃内的pH 值：瘤胃内正常pH 值6.2-6.8, 为中性或弱酸性, 这个酸度恰好是瘤胃微生物存活的最佳条件, 同时对酸性或中性洗涤纤维的消化降解以及挥发性脂肪酸的形成有促进作用。
只有在这个范围内, 才能保证最高的采食量, 最佳的消化率, 瘤胃中产生乳酸的淀粉分解菌耐受pH 值不得超过5.5,但纤维分解菌在pH值6.0以下无法存活, 而最适纤维分解菌作用的条件则是pH值是6.4 时,可见pH值的高低严重影响到瘤胃内不同微生物种群的数量和比例,进而影响瘤胃发酵的发酵功能和饲料的消化率。
奶牛瘤胃微生物的研究进展
奶牛瘤胃微生物区系不是一出生就存在的，而随着
的微生物，这些微生物互相作用，维持奶牛的健康生 奶牛与外界环境的不断接触，经过对环境的适应，逐步 长。许多研究证实，奶牛不同的生理阶段其微生物的组 定植、存活和繁殖的[14]。在奶牛瘤胃中栖息的这些微生
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
成结构不同，这种微生物随奶牛生理状态变化而变化的 物具有种类多样性及相互作用复杂性的特点，对消化日 模式有助于维持奶牛的健康和产生性能[8~10]。另有研究 粮中的营养物质起主要作用。
到非常重要的作用，与产奶量呈显著正相关。 有研究表明，瘤胃微生物的组成与奶牛的饲料转化率
有关，这说明瘤胃微生物具有调控饲料转化率的功能[24]。 Li等[27]应用宏基因组技术检测高、低饲料转化率组牛的 瘤胃微生物组成和代谢通路，结果显示，低饲料转化 率组牛的瘤胃微生物的活动性比高饲料转化率组高。 Shabat等[28]测定了146头奶牛的生产性能、饲料转化率 以及瘤胃微生物组成，结果表明，瘤胃微生物丰度与饲 料转化率呈负相关关系，通过瘤胃微生物的种类可以预 测饲料转化率和生产性能，对微生物种类进行优化可以 提高奶牛对能量的利用率，减少甲烷的排放。Ross等[29] 也认为奶牛瘤胃微生物的变化与甲烷的排放相关。由此 可见，奶牛瘤胃微生物具有多种功能，在奶牛生长发育 以及生产性能的发挥中起着非常重要的作用，通过对瘤 胃微生物进行分析，不仅能反映奶牛机体状况，还有助 于为人类带来更多的畜产品资源，保护生态环境。
牛生产技术。
瘤胃微生物主要包括细菌、真菌、古菌和原虫四大 类，狭义上指的是细菌[15]。有研究指出，每克瘤胃内容 物约有1011个细菌，200个种类，纤毛虫104～106个，涵 盖24个属，厌氧真菌有102～104个，包括5个属[16]。瘤胃 微生物的组成在奶牛上研究较多，Jami等[17]对不同年龄
瘤胃能氮同步释放对微生物蛋白产量影响的研究
瘤胃能氮同步释放对微生物蛋白产量影响的研究马百顺;王中华【期刊名称】《山东农业大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2009(040)002【摘要】采用双外流连续培养系统,连续灌注酪蛋白动态模拟氮源释放,研究瘤胃能氮同步化释放对微生物蛋白产量的影响.结果表明,酪蛋白灌注数量对OM和ADF 降解率的影响显著(P<0.001),对NDF降解率的影响显著(P<0.05).随酪蛋白灌注数量的增加,OM、NDF和ADF降解率均有增加趋势.酪蛋白灌注量对氮降解数量、可降解有机物利用效率和降解氮利用效率影响极显著(P<0.001),对微生物氮产量影响显著(P<0.05).MN/RDN=0.9921-0.2095 Ln(RDN/DOM),(n=27,R2=0.6058).【总页数】5页(P235-239)【作者】马百顺;王中华【作者单位】山东农业大学动物科技学院,山东,泰安,271018;山东农业大学动物科技学院,山东,泰安,271018【正文语种】中文【中图分类】Q341【相关文献】1.瘤胃能氮同步释放对奶牛微生物蛋白合成和瘤胃发酵的影响 [J], 张俊瑜;臧长江;王文奇;郭同军;王世昌;桑断疾2.瘤胃能氮同步释放对瘤胃微生物蛋白质合成的影响 [J], 卜登攀;卢德勋;崔慰贤;王加启3.过瘤胃赖氨酸对奶牛瘤胃微生物蛋白产量、产奶性能和氮排泄的影响 [J], ZHANG Kaixiang;XING Defang;GAO Xulei;TENG Lebang;LYU Yongyan;SUN Guoqiang4.过瘤胃蛋氨酸与过瘤胃赖氨酸不同组合对奶牛瘤胃微生物蛋白产量、产奶性能和氮排泄的影响 [J], 丁大伟;高许雷;滕乐帮;吕永艳;孙国强5.半胱胺和过瘤胃蛋氨酸不同组合对奶牛产奶性能、瘤胃微生物蛋白产量和氮排泄的影响 [J], 张仔堃;张玉利;高许雷;孙国强因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
瘤胃微生物不同区系的硝态氮还原、甲烷产生和发酵参数比较
瘤胃微生物不同区系的硝态氮还原、甲烷产生和发酵参数比较林淼;郭望山;任丽萍;周振明;孟庆翔【期刊名称】《中国农业科学》【年(卷),期】2010(043)019【摘要】[目的]以硝态氮为惟一氮源,评价体外培养瘤胃微生物不同区系还原硝酸盐的程度以及对甲烷产生和发酵参数的影响.[方法]采用Menke人工瘤胃产气法进行24h厌氧发酵,以硝酸钠、可溶性淀粉和微晶纤维素组成纯合日粮,用物理离心和化学抑制剂相结合的方法,将瘤胃液分成8种区系:金瘤胃液(WRF)、原虫(P)、细菌(B)、真菌(F),原虫+细菌(P+B)、原虫+真菌(P+F)、细菌+真菌(B+F)和负对照(CTN),测定微生物硝酸盐降解率及发酵参数.[结果]P区系硝酸盐降解率显著高于B 区系(P<0.001),P+F及B+F区系硝酸盐降解率低;WRF产气量和硝酸盐降解率最高,P+B和P区系次之,这3个区系的甲烷(CH4),总挥发酸(TVFA)含量和乙酸比例均高于其它区系(P<0.001);硝酸盐的还原有利于微生物蛋白的合成,P+B区系的合成量最高.[结论]瘤胃原虫(P)和细菌(B)区系具有高还原硝酸盐(NO3)和亚硝酸盐(NO2)能力,原虫区系的硝态氮还原能力更强;真菌(F)区系培养于此发酵底物中,还原硝酸盐的能力很弱,几乎可以忽略.瘤胃原虫和细菌区系是硝态氮还原、产甲烷和微生物蛋白合成的主要区系.【总页数】6页(P4088-4093)【作者】林淼;郭望山;任丽萍;周振明;孟庆翔【作者单位】动物营养学国家重点实验室/中国农业大学动物科技学院/肉牛研究中心,北京,100193;动物营养学国家重点实验室/中国农业大学动物科技学院/肉牛研究中心,北京,100193;动物营养学国家重点实验室/中国农业大学动物科技学院/肉牛研究中心,北京,100193;动物营养学国家重点实验室/中国农业大学动物科技学院/肉牛研究中心,北京,100193;动物营养学国家重点实验室/中国农业大学动物科技学院/肉牛研究中心,北京,100193【正文语种】中文【相关文献】1.不同氧化还原电位条件下稻田土壤中15N标记硝态氮的反硝化作用 [J], 倪吾钟;沈仁芳;朱兆良2.施氮对不同品种冬小麦植株硝态氮和硝酸还原酶活性的影响 [J], 李东方;李紫燕;李世清;王全九;邵明安;李凤民3.测定土壤硝态氮的紫外分光光度法和镉柱还原法比较 [J], 涂成;黄威;陈安磊;宋歌;陈春兰;王卫;谢小立4.不同品种菠菜叶肉及叶柄中硝态氮累积与硝酸还原酶活性的关系 [J], 王海华;魏永胜;王朝辉5.还原蒸馏法与酚二磺酸比色法测定土壤硝态氮的比较 [J], 徐晓荣;李恒辉;陈良因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
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瘤胃微生物定量方法的研究进展郭同军1,2,王加启1,王建平1,霍小凯1,2,卜登攀1,魏宏阳1,周凌云1,刘开朗1(1.中国农业科学研究院北京畜牧研究所动物营养学国家重点实验室,北京 100193;2新疆农业大学,乌鲁木齐 830052)摘要:当前人们对瘤胃中微生物的认识只有10%～20%,不断改进研究技术和手段,才能大大推动瘤胃微生态领域的研究。
作者阐述了瘤胃微生物传统定量方法(滚管计数法和最大或然数法)和分子生物学定量方法,如探针杂交技术、荧光原位杂交、D GGE、定量PCR和流式细胞计量术(flow cytometry)等的应用状况及其各自的优缺点。
关键词:瘤胃微生物;滚管计数法;最大或然数法;Real2Time PCR;流式细胞计量术中图分类号:Q93.3 文献标识码:A 文章编号:167127236(2009)0420019206 反刍动物在长期的自然进化过程中获得了独特的瘤胃发酵系统。
瘤胃内有大量的微生物,目前为止,所知细菌达200种以上,活菌数为1011个/mL,原虫超过25个属,其数量为104～106个/mL,真菌含有5个属(Miron等,2001)。
由众多的细菌、真菌和原虫组成的微生态系统中,不仅每种微生物与底物的作用机理不同,各种微生物之间的关系更是复杂(冯仰廉,2004)。
传统定量方法如滚管法(Hun2 gate,1969)和最大似然法(Dehority等,1989)只能培养瘤胃微生物中的一小部分,这使得瘤胃微生物的多样性被严重低估(Amann等,1995)。
20世纪80年代,基于16S/18S rRNA/rDNA的分子生物学定量方法的兴起,可以提供微生物核酸分子方面的特征,评价不同生态系统中微生物的遗传多样性和收稿日期:2008211226作者简介:郭同军(1981-),男,甘肃人,硕士生,研究方向:瘤胃微生物工程。
通信作者:王加启(1967-),男,安徽人,研究员,博士生导师,从事反刍动物营养和牛奶质量改良研究。
E2mail:wang2jia2qi@;010*********基金项目:“十一五”国家奶业科技支撑计划(2006BAD04A14和2006BAD04A10)。
系统发育关系(Tajima等,1999),而且还能对瘤胃微生物进行计数(Sdiva等,2004),由于研究方法的不断改进,使得人们不断的发现许多新的瘤胃微生物品种(K oike等,2003;Shin等,2004)。
认识瘤胃微生物的功能、活动规律和建立准确、快速、高效的瘤胃微生物定性及定量评价方法,是瘤胃微生态研究必然的趋势。
作者主要就当前瘤胃微生物定量方法的研究进展做了详细阐述。
1 定量研究方法在瘤胃微生物研究中的应用及评价1.1 传统定量方法 采用Hungate发展起来的厌氧培养技术,以及采用模拟瘤胃环境而设计的培养基,对瘤胃微生物进行分离、纯培养、计数、形态鉴定、生理生化特性的鉴别、分类等。
瘤胃细菌与真菌的数量用显微镜直接计数,常采用滚管法计数,以及最大或然数计数法(mo st p robable number,MPN) (Dehority等,1989)。
1.1.1 稀释平板记数法 稀释平板记数法又称活菌记数法,是根据微生物在高度稀释条件下固体培养基上所形成的单个菌落是由一个单细胞繁殖而成这一特征设计的记数方法。
瘤胃液中细菌或真菌的活菌记数常采用亨氏滚管计数法(roll2t ube tech2 nique)(Hungate,1969)。
亨氏滚管计数法可以获 Abstract:The advances on nutrient requirements,feedstuff evaluation and formulation techniques of broiler are reviewed in this paper.It showed that feeding phases decision is more scientific f rom three to four phases;nutrient requirement specifica2 tions is presenting diversified trend of development,which are referred to be combined with the broiler breeds,environment, production goal and the evaluation systems of the feedstuff itself etc;secondly,formulation optimization technology itself is rel2 ative invariable,but if the coefficients matrix of formulation model is integrated f rom the standard deviation of the nutrients of used feedstuff,it will evidently enhance the true probability for goal nutrients to reach.The third,performance prediction a2 bout broiler is improved when diets are formulated on the basis of standardized ileal amino acid digestibility.The results and thought can provide the scientific basis for developing the new generation expert system of broiler feeding and nutrition.K ey w ords:broiler;nutrient requirements;formulation technology;standardized ileal digestibility得瘤胃微生物的特定生长因素、代谢产物等信息,其优缺点如表1所示。
Hobson(1969)采用滚管法对纤维分解菌、蛋白分解菌和淀粉分解菌等计数。
Leedle等(1982)利用滚管法对饲喂后的瘤胃总细菌计数,结果发现总细菌数减少,减少的原因可能与饲喂有关,有可能是氧气浓度升高而使细菌数目减少。
杨舒黎(2007)采用滚管法研究了日粮中添加胡麻油和豆油对奶牛瘤胃纤维分解菌、蛋白分解菌、淀粉分解菌和总细菌数量变化。
1.1.2 最大或然数法 最大或然数(M PN)记数法又称稀释培养测数法,是利用待测微生物的特殊生理功能的选择性来摆脱其它微生物类群的干扰,并通过该生理功能的表现来判断该类群微生物的存在和丰度,是目前比较常用的方法。
该法是将待测样品作一系列稀释,一直稀释到少量的稀释液接种到新鲜培养基中没有或极少出现生长繁殖。
根据没有生长的最低稀释度与出现生长的最高稀释度,采用“最大或然数”理论,可以计算出样品单位体积中细菌数的近似值。
Dehority等(1989)首次将M PN用于瘤胃细菌记数,结果发现该法与滚管法的总细菌数无差异。
Theodorou等(1990)报道了改良的M PN用于瘤胃厌氧真菌的记数,研究结果表明, M PN法记数结果与滚管法相似,但与游动孢子直接记数的结果有很大差异。
最大或然数对接种等试验技能要求较低,液体培养基制备和接种所需时间较短,可直观观察生长情况,最终p H也易于检测。
此外,M PN法对液相和固相中的真菌均能可靠记数,对产生游动孢子少的厌氧真菌的记数更适用。
M PN的缺点是不能对微生物进行分离研究。
表1 亨氏滚管法优缺点优点缺点易维持厌氧环境;滚管重新利用;不用打开盖子就能检测培养物;感染机会减少;滚管法中厌氧环境一旦建立就无需再通额外的除氧气体;同一个管能被用来进行形态鉴定和分离纯培养;不同的培养物能够在满足它们的任一需要的条件下不同的环境中生长。
从滚管中挑选菌落非常需要技巧,当分离纯菌到一个新管中时要在环境中保留一段时间,这个操作需要反复的实践练习,以便使这个时间缩短至最短。
操作麻烦,操作者需有熟练的技术;对在实验室难于培养的微生物,无法利用该法进行检测;不同微生物的最适培养基、培养条件不同而导致生长速度不同,使得记数结果与实际菌数差异较大1.2 分子生物学定量方法 传统培养方法是早期研究瘤胃微生物的最重要手段。
但由于瘤胃微生态的复杂性,微生物又都是厌氧或兼性厌氧的,计数过程中要求的条件高、难度大,再加上传统的记数方法工作量大、耗时长,对一些不可培养的微生物又无法记数等原因,瘤胃微生物的定量研究进展缓慢。
20世纪80年代以来,以小核糖体RNA16S rRNA为主的分子生物学技术的发展,用分子生物学方法研究瘤胃微生物生态克服了基于培养方法带来的局限,加快了对瘤胃微生物群落的了解。
1.2.1 基于16S rRNA的核苷酸(基因)探针杂交技术定量瘤胃微生物 点杂交和狭线杂交技术是一种分子生物学的标准技术,最早出现于1979年,是将原始样品中的总RNA或几种核酸样品分别定量固定在固相支持物(尼龙膜或纤维素膜)上,然后用特异的探针与样品杂交,通过估计样品点信号强度,与已知浓度的标准品信号强度进行比较,确定待测样品中靶序列的量;也可通过通用探针和特异探针在相同条件下分别对同一样品进行杂交后的相应信号强度比来计算特异探针所对应的靶RNA占通用探针所对应的靶RNA的百分含量。
Olsen等(1986)首先提出杂交技术研究天然微生物的数量。
Stahl等(1988)率先利用特异性16S rRNA序列的寡核苷酸探针研究了添加莫能菌素对瘤胃纤维分解菌的变化规律,开辟了瘤胃微生物分子定量研究的先河。
Forster等(1997)运用组特异探针通过狭缝杂交技术定量了瘤胃溶纤维丁酸弧菌(B.f ibrisol2 vens)。
Weimer等(1999)使用16S rRNA狭缝杂交技术研究了4种不同日粮(青贮苜蓿和青贮玉米、24%或32%的中性洗涤纤维)对瘤胃内3种主要纤维分解菌白色瘤胃球菌(R.albus)、黄色瘤胃球菌(R.f l avef aciens)和产琥珀酸丝状杆菌(F.succi no2 genes)的影响。
Michalet2Boreau等(2002)利用该技术研究了瘤胃和盲肠内纤维分解菌的差异。
尽管分子杂交法开创了瘤胃微生物分子定量的先河,并一度广泛运用;但其结果重现性差,导致试验结果不可靠。
1.2.2 荧光原位杂交(FISH)技术定量瘤胃微生物 荧光原位杂交是采用特异的荧光标记探针在未破碎的细胞内与它的互补序列完整结合,通过荧光信号检测核酸序列。