HPLC指纹图谱建立的技术要求
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（7）相似度软件
2004年SFDA《中药指纹图谱计算机辅助相似度评价软件》，一 般成品指纹图谱相似度计算结果在0.9-1.0之间为符合要求。
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图1 福建莲子HPLC指纹图谱
图2 福建太子参a HPLC指纹图谱
பைடு நூலகம்
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第五节 研究实例
丹参HPLC指纹图谱构建 一、药材来源（GAP基地）与鉴定 二、色谱条件与系统适应性试验
（2）精密度
主要考察仪器的精密度。取同一供试品，连续进样5次以上，考 察色谱峰的相对保留时间、峰面积比值的一致性。其峰面积比值的相 对标准偏差RSD不得大于3%。
（3）重现性
主要考察实验方法的重现性。取同一批号的供试品5份以上，按 照供试品的制备和检测方法制备供试品并进行检测，考察色谱峰的相 对保留时间、峰面积比值的一致性。其峰面积比值的相对标准偏差 RSD不得大于3%。
面积10%的共有峰，峰面积比值不作要求，但必须标定相对保留时
间。未达到基线分离的共有峰，应计算该组峰的总峰面积作为峰面积，
同时标定该组各峰的相对保留时间。
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4、非共有峰面积
非共有峰总面积不得总面积的10%。
5、方法学考察
（1）稳定性
主要考察供试品的稳定性。取同一供试品，分别在不同时间检测， 考察色谱峰的相对保留时间、峰面积的一致性，确定检测时间。
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三、参照物的制备
选择适宜的对照品作为参照物，如果没有适宜的对照品，可选择适 宜的内标物作为参照物。
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四、测定方法
包括测定方法、仪器、试剂、测定条件等必须固定。建议优先考 虑色谱方法。对于成分复杂的中药材可以考虑采用多种测定方法，建 立多张指纹图谱。注意方法学考察。
1、指纹图谱
第一，指纹图谱记录时间一般为1小时，但应提供2小时的记录图。 第二，TLC法必须提供从原点至溶剂前沿的图谱。第三，对于化学成 分复杂，必要时可建立多张指纹图谱。
用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇-0.1%乙酸 （5：95）为流动相；检测波长254nm；柱温为室温；流 速为1ml/min。
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四、供试溶液的制备
40目，10批次，各1g（精密称取），蒸馏水提取， 趁热过滤，得提取液100ml，加10%盐酸调pH为2，再用 乙酸乙酯40ml萃取1次。萃取液浓缩至干，残渣用1ml流 动相溶解，作为供试品溶液，HPLC分析前用微孔滤膜过 滤。
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6、其他注意问题
（1）样品定容 一般制成样品的标示浓度单位为g/ml或mg/ml。
（2）放置 供试品溶液应在避光、低温、密闭容器条件下保存，
一般不超过两周，溶液不稳定的，一般不超过48小时。 （3）有效数字
相对保留时间和相对峰面积的有效数字要求取小数点 后3位。
（4）留样
注意留样的数量不少于实验实际用量的3倍。
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（5）参照物
复方制剂首选君药的活性成分或指标性成分，尽可能阐明参照物 的化学结构及化学名称，也可以选择适当的内标物插入色谱中。
（6）量化的含义
是指在定量的操作条件下，所得到的药材指纹图谱在整体特征上 可以半定量的比较，以表达原料药材指纹图谱在“量”方面的总体差 异程度，以及半成品（提取物）和成品之间及成品批间指纹图谱在 “量”的相对程度。
五、测定
分别取各批次药材供试品10l，注入HPLC仪，记录 1h色谱。
供试品指纹图谱应与质量标准所附的对照指纹图谱有 良好的相似性。
指纹图谱应有12个特征峰。
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相对保留时间/min（特征峰序号） 0.150（1）、0.368（2）、0.437（3）、0.495（4）、 0.591（5）、1.000（S）、1.143（6）、1.393（7）、 1.627（8）、2.585（9）、2.911（10）3.968（11）。
（2）以内标物作为参照物的指纹图谱，则以共有指纹峰中其中一个峰 （要求面积相对较大、较为稳定的共有峰）的峰面积作为1，计算其 他各共有指纹峰面积的比值。
（3）各共有峰的面积比值必须相对固定。
（4）共有峰面积要求：单峰面积占共有峰总面积20%的共有峰，其差
值不得20%；若20%面积10%共有峰，其差值不得25%； 若
2、共有指纹峰的标定
采用色谱方法制定指纹图谱，必须根据参照物的保留时间，计算 指纹的相对保留时间。根据10批次的检测结果，标定中药材的共有指 纹峰。
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3、共有指纹峰面积的比值
（1）以参照物峰面积作为1 （要求能出现稳定的峰） ，计算各共有指纹 峰面积与参照物峰面积的比值（参照物可以是对照品也可以是内标 物）。
第四节 HPLC指纹图谱建立的关键技术要求 一、药材样品来源（中间体和注射剂另有规定）
应固定品种、药用部位、产地、采收期、产地加工和炮制方法等。 供试品的取样参照《中华人民共和国药典》2010年版中规定的中药材 取样方法，以保证供试品的代表性和均一性。按1：10取样。
二、供试品制备
必须确保中药材的主要化学成分在指纹图谱中的体现。多种有效组 分应分别提取制备。
特征指纹峰面积积分相对比值 0.152±30%(1)、0.72(2)、0.191±30%(3)、
0.297±25%(4)、0.046(5)、1.000(S)、0.059(6)、0.038(7)、 0.139(8)、0.354±25%(9)、0.411±25%(10)、0.054(11)。 仪器Agilent HPLC及3D色谱工作站；色谱柱：Zorbax C18 （4.6mm250mm）色谱分析柱.
2004年SFDA《中药指纹图谱计算机辅助相似度评价软件》，一 般成品指纹图谱相似度计算结果在0.9-1.0之间为符合要求。
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图1 福建莲子HPLC指纹图谱
图2 福建太子参a HPLC指纹图谱
பைடு நூலகம்
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第五节 研究实例
丹参HPLC指纹图谱构建 一、药材来源（GAP基地）与鉴定 二、色谱条件与系统适应性试验
（2）精密度
主要考察仪器的精密度。取同一供试品，连续进样5次以上，考 察色谱峰的相对保留时间、峰面积比值的一致性。其峰面积比值的相 对标准偏差RSD不得大于3%。
（3）重现性
主要考察实验方法的重现性。取同一批号的供试品5份以上，按 照供试品的制备和检测方法制备供试品并进行检测，考察色谱峰的相 对保留时间、峰面积比值的一致性。其峰面积比值的相对标准偏差 RSD不得大于3%。
面积10%的共有峰，峰面积比值不作要求，但必须标定相对保留时
间。未达到基线分离的共有峰，应计算该组峰的总峰面积作为峰面积，
同时标定该组各峰的相对保留时间。
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4、非共有峰面积
非共有峰总面积不得总面积的10%。
5、方法学考察
（1）稳定性
主要考察供试品的稳定性。取同一供试品，分别在不同时间检测， 考察色谱峰的相对保留时间、峰面积的一致性，确定检测时间。
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三、参照物的制备
选择适宜的对照品作为参照物，如果没有适宜的对照品，可选择适 宜的内标物作为参照物。
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四、测定方法
包括测定方法、仪器、试剂、测定条件等必须固定。建议优先考 虑色谱方法。对于成分复杂的中药材可以考虑采用多种测定方法，建 立多张指纹图谱。注意方法学考察。
1、指纹图谱
第一，指纹图谱记录时间一般为1小时，但应提供2小时的记录图。 第二，TLC法必须提供从原点至溶剂前沿的图谱。第三，对于化学成 分复杂，必要时可建立多张指纹图谱。
用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇-0.1%乙酸 （5：95）为流动相；检测波长254nm；柱温为室温；流 速为1ml/min。
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四、供试溶液的制备
40目，10批次，各1g（精密称取），蒸馏水提取， 趁热过滤，得提取液100ml，加10%盐酸调pH为2，再用 乙酸乙酯40ml萃取1次。萃取液浓缩至干，残渣用1ml流 动相溶解，作为供试品溶液，HPLC分析前用微孔滤膜过 滤。
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6、其他注意问题
（1）样品定容 一般制成样品的标示浓度单位为g/ml或mg/ml。
（2）放置 供试品溶液应在避光、低温、密闭容器条件下保存，
一般不超过两周，溶液不稳定的，一般不超过48小时。 （3）有效数字
相对保留时间和相对峰面积的有效数字要求取小数点 后3位。
（4）留样
注意留样的数量不少于实验实际用量的3倍。
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（5）参照物
复方制剂首选君药的活性成分或指标性成分，尽可能阐明参照物 的化学结构及化学名称，也可以选择适当的内标物插入色谱中。
（6）量化的含义
是指在定量的操作条件下，所得到的药材指纹图谱在整体特征上 可以半定量的比较，以表达原料药材指纹图谱在“量”方面的总体差 异程度，以及半成品（提取物）和成品之间及成品批间指纹图谱在 “量”的相对程度。
五、测定
分别取各批次药材供试品10l，注入HPLC仪，记录 1h色谱。
供试品指纹图谱应与质量标准所附的对照指纹图谱有 良好的相似性。
指纹图谱应有12个特征峰。
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相对保留时间/min（特征峰序号） 0.150（1）、0.368（2）、0.437（3）、0.495（4）、 0.591（5）、1.000（S）、1.143（6）、1.393（7）、 1.627（8）、2.585（9）、2.911（10）3.968（11）。
（2）以内标物作为参照物的指纹图谱，则以共有指纹峰中其中一个峰 （要求面积相对较大、较为稳定的共有峰）的峰面积作为1，计算其 他各共有指纹峰面积的比值。
（3）各共有峰的面积比值必须相对固定。
（4）共有峰面积要求：单峰面积占共有峰总面积20%的共有峰，其差
值不得20%；若20%面积10%共有峰，其差值不得25%； 若
2、共有指纹峰的标定
采用色谱方法制定指纹图谱，必须根据参照物的保留时间，计算 指纹的相对保留时间。根据10批次的检测结果，标定中药材的共有指 纹峰。
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3、共有指纹峰面积的比值
（1）以参照物峰面积作为1 （要求能出现稳定的峰） ，计算各共有指纹 峰面积与参照物峰面积的比值（参照物可以是对照品也可以是内标 物）。
第四节 HPLC指纹图谱建立的关键技术要求 一、药材样品来源（中间体和注射剂另有规定）
应固定品种、药用部位、产地、采收期、产地加工和炮制方法等。 供试品的取样参照《中华人民共和国药典》2010年版中规定的中药材 取样方法，以保证供试品的代表性和均一性。按1：10取样。
二、供试品制备
必须确保中药材的主要化学成分在指纹图谱中的体现。多种有效组 分应分别提取制备。
特征指纹峰面积积分相对比值 0.152±30%(1)、0.72(2)、0.191±30%(3)、
0.297±25%(4)、0.046(5)、1.000(S)、0.059(6)、0.038(7)、 0.139(8)、0.354±25%(9)、0.411±25%(10)、0.054(11)。 仪器Agilent HPLC及3D色谱工作站；色谱柱：Zorbax C18 （4.6mm250mm）色谱分析柱.