HPLC指纹图谱建立的技术要求
玉屏风药材汤剂HPLC指纹图谱的建立
液 相 色 谱 （ Ｌ 指 纹 图 谱 研 究 有 大 量 文 献 报 ＨＰ Ｃ） 道 ＿ Ｊ全 方药 材 Ｈ Ｌ ４ ， Ｐ Ｃ指纹 图谱 研 究 较 少 ¨ 。本
研究 采 用 Ｈ Ｌ Ｐ Ｃ法 ， 立 全 方 药 材 汤 剂 的 ＨＰ Ｃ指 建 Ｌ 纹 图谱 ， 玉 屏 风 中升 麻 苷 、 一 一 基 维 斯 阿 米 醇 为 ５Ｏ 甲
技 有 限公 司 ） １ 黄 芪 、 ；０批 防风 、 炒 ） （ 白术 饮 片 ， 别 分 购 于合 肥市 多 家 药 材公 司 和药 店 （ １ ， 芪 为 豆 表 ）黄 科 植 物 蒙 古 黄 芪 Ａ ｔ ｇｌｓｍｅ ｒｎ ｅｕ （ ｉ ｈ ） ｓ ａａｕ ｍｂａａｅ ｓ Ｆｓ ． ｒ ｃ
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要 含皂 苷 、 异黄 酮及 多糖 等成分 ， 中黄芪 甲苷 为 活 其
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摘要 目的
俊， 宋
珏 ， 飞龙 李
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
建立玉屏 风药 材汤剂 的指 纹 图谱。方 法 采
苷、 芒柄 花 素稳 定性 提供 一定 参 考 。
１ 材料 与 方法
１ １ 材 料 ．
用高效液相色谱 法 （ Ｐ Ｃ） 析 ， ＨＬ 分 色谱 柱 为 Ｈ ｐ ｒｌＯ Ｓ柱 ｙ ｅｓ Ｄ ｉ （５ ｉ ４ ６ｍ ５Ｉ ， ２ ０ｉｎ× ． ｍ， ｘ 流动相 为 乙腈 一水梯 度洗脱 ， ／ ｍ） 检
玉屏 风药材 汤剂 主
１ １ １ 实验 仪 器 ． ．
云南烤烟HPLC指纹图谱数据库的建立和规程研究
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Ａｂ ｔａ ｔ Ｃｈ ｏ ｉｇａ ｐ ｒ ｐ ａｅｍｅｈ ｄｔ ｌｓｉｙｔｂ ｃ ｏｑ ａｉ ｆｓｇ ｉ ｃ ｎ ｅｆ ｒ ｍｐｏ ｉｇｔｅｑ ａｉ ｆｏ ａ ｃ ｒ ｕ ｔ ｓ ｒ ｃ ： ｏ ｓ ｎａ ｐ ｏ ｒ ｔ ｔｏ ｃａ ｓｆ ａ ｃ ｕ ｌ ｙｉ ｏ ｎｆ ａ ｃ ｏ ｒ ｖｎ ｕ ｔ ｏ ｂ ｃ ｏｐ ｏ ｃ． ｎ ｉ ｏ ｏ ｔ ｓ ｉ ｉ ｉ ｈ ｌｙ ｔ ｄ
３湖北 中烟工业股份有 限公司 ，武汉 ４ ０ ５ ） ． ３ ０ １ 摘 要： 选择合适 的方 法对烟 叶质 量进 行科学合理 的分类对于提高卷烟 质量和生产技 术水 平具 有重要意义。 对云 南省典型烤
烟的 Ｈ Ｌ 指纹 图谱分析规程进行 了研 究。规程包括样 品取样和处理 、特征提取 剂的选择 、仪器条件和分析及数据库 的建 ＰＣ 立等 ４个关键过程。首次提 出 了烤 烟指 纹 图谱分 时数据库 的概念和建 立方法。 所建 立的指纹 图谱技术规程可 ；分 时数据 库； 品质 ；分类 中图分类号 ： ５ ２ Ｔ ３ １ ￥ ７ ； Ｐ １ 文章编号 ：１０ ．１ ９ ２ １ ０ —０ １ ６ ０ ７５ １ （ ０ ２） ２０ ０ — ０ Ｄ ： ０３ ６ ０ｉｓ． ０ ．１９２ １．２ ０ ＯＩ １．９ ９ ． ｎ１ ７５ １ ． ２０ ． １ ｓ ０ ０ ０
中国烟草科学
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云 南 烤 烟 ＨＰ Ｃ指 纹 图谱 数 据 库 的建 立 和 规 程 研 究 Ｌ
唐徐 红 ，矣跃平 ，涂 书新 ，袁仕信 ，何云 燕 ２ 磊 ，尹晓 东２ ，刘 ，何 结望 ，李 琳
HPLC指纹图谱建立的技术要求
供试品溶液应在避光、低温、密闭容器条件 下保存，一般不超过两周，溶液不稳定的，一般 不超过48小时。 〔3〕有效数字
相对保存时间和相对峰面积的有效数字要求 取小数点后3位。 〔4〕留样
〔5〕参照物
复方制剂首选君药的活性成分或指标 性成分，尽可能说明参照物的化学构造及 化学名称，也可以选择适当的内标物插入 色谱中。
用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇-0.1%乙酸 〔5：95〕为流动相；检测波长254nm；柱温为室温；流 速为1ml/min。
四、供试溶液的制备
40目，10批次，各1g〔精细称取〕，蒸馏水提取， 趁热过滤，得提取液100ml，加10%盐酸调pH为2，再用 乙酸乙酯40ml萃取1次。萃取液浓缩至干，残渣用1ml流 动相溶解，作为供试品溶液，HPLC分析前用微孔滤膜过 滤。
HPLC指纹图谱建立的技术要求
四、测定方法
包括测定方法、仪器、试剂、测定条件 等必须固定。建议优先考虑色谱方法。对 于成分复杂的中药材可以考虑采用多种测 定方法，建立多张指纹图谱。注意方法学 考察。
1、指纹图谱
第一，指纹图谱记录时间一般为1小时， 但应提供2小时的记录图。第二，TLC法必 须提供从原点至溶剂前沿的图谱。第三， 对于化学成分复杂，必要时可建立多张指总面积不得 总面积的10%。
5、方法学考察
〔1〕稳定性
主要考察供试品的稳定性。取同一供 试品，分别在不同时间检测，考察色谱峰 的相对保存时间、峰面积的一致性，确定 检测时间。
〔2〕精细度
主要考察仪器的精细度。取同一供试 品，连续进样5次以上，考察色谱峰的相对
6、其他注意问题 〔1〕样品定容
3、共有指纹峰面积的比值
黄连HPLC Maxplot指纹图谱的建立
570... 天津中医药..Tianjin Journal of Traditional Chinese Medicine 2017年8月第34卷第8期Aug. 2017,Vol.34 No.8DOI：10.11656/j.issn.1672-1519.2017.08.20黄连HPLC M a x p l o t指纹图谱的建立*张春艳u,成睿珍2,刘海2(1.天津中医药大学中医药研究院，天津300193; 2.天津市滨海新区中医医院药学科，天津300451)摘要:[目的]以髙效液相色谱-二极管阵列检测器(H PLC-PDA)M axPlot色谱图为基础，建立黄连指纹图谱分析方法。
[方法]米用高效液相色谱(HPLC)法，色谱柱为AgilentSB-C18(4.6m m x l50mm,3.5|x m);流动相为乙腈-0.1% 三氟乙酸水溶液，线性梯度洗脱;210~400 nm波长下提取M axplot色谱图。
以黄连对照药材随行测定所得M axPlot色谱图作为黄连的标准对照指纹图谱，通过相似度评价黄连药材质量。
[结果]结果显示,PDA M axPlot模式下黄连指纹 图谱共获得11个共有峰，较单一波长345 nm下多1个微量成分峰。
12批样品指纹图谱与对照药材随行对照标准指 纹图谱相似度达0.994以上。
[结论]M axPlot指纹图谱显著提髙了黄连中各类成分检测的灵敏度，有效增加了黄连药材共有峰数量,为该药材多成分的质量控制提供了借鉴。
关键词:黄连;PDA M axPlot;随行对照;指纹图谱;质量评价中图分类号:R284 文献标志码:A文章编号：1672-1519(2017)08-0570-04中药为多成分复杂体系，其所含化学成分种 类、含量及理化性质存在着差异，而中药指纹图谱 是一种综合、可量化的质量控制手段，能够确切地 反映中药有效部位中化合物的化学信息。
目前，高 效液相色谱(HPLC)指纹图谱技术是公认的应用最 广的方法[1]。
中蒙药制剂指纹图谱建立和辨认的方法和步骤
中蒙药制剂指纹图谱建立和辨认的方法和步骤杨永生 2009级研究生学号：2009110100摘要目的：介绍中蒙药制剂指纹图谱建立和辨认的方法和步骤，为祖国传统医药走向世界提供手段方法。
方法：归纳国内近年关于指纹图谱的大量文献，分析其研究的方法，在中蒙药制剂质量控制中起到了重要作用。
结果：中蒙药制剂指纹图谱技术进展很快完全可以利用其作为中蒙药质量控制的手段。
结论：中蒙药制剂指纹图谱的研究进展很快其科学的方法和步骤可以更好的提升中蒙药质量，中蒙药制剂指纹图谱技术一定可以加速祖国传统医药走向世界。
关键词中蒙药制剂指纹图谱；方法和步骤中蒙药是我国人民在数千年治疗疾病过程中积累起来的宝贵财富，中蒙药生产和质量的规范化和现代化是祖国传统医药走向世界的重要前提，目前中蒙药正处于迈向现代化的瓶颈阶段，中蒙药制剂指纹图谱的出现为解决这个问题提供了现代技术手段、中蒙药制剂指纹图谱近年来进展很快，本文综合了国内近年的有关文献对中蒙药制剂指纹图谱的建立和辨认的方法和步骤作一论述。
1、中蒙药指纹图谱的定义、特点、分类1.1 定义：中蒙药指纹图谱是指某种（或某产地）中蒙药材或中成药经适当处理后，采用一定的分析手段,得到的能够标志该中蒙药材或中成药特征的色谱或光谱的图谱。
利用色谱技术进行指纹图谱分析的中蒙药材因生长年限，生长环境的变化而可能产生个体间较为明显的差异，但个体间必然有群体共有的相似性[1]。
1.2 特点：①通过指纹图谱的特异性，能有效鉴别样品的真伪或产地；②通过指纹图谱主要特征峰的含量或比例的制定，能有效控制样品的质量，确保质量的相对稳定。
中蒙药指纹图谱有两个基本属性[2]：整体性和模糊性。
1.3 分类：按应用对象来分类，可分为中蒙药材(原料药材)指纹图谱、中蒙药原料药(包括饮片、配伍颗粒)指纹图谱、中蒙药中间体（工艺生产过程中间产物）指纹图谱和中蒙药制剂指纹图谱。
按测定手段可分为：中蒙药化学指纹图谱和中蒙药生物指纹图谱。
2013070467-川渝地区金银花HPLC指纹图谱的建立
1.不同地方购买的金银花可能为不同品种金银花药材，色谱峰面积相差很大是否跟此有关，因此得出的结论无具体实用价值，需补充。
答：是存在品种不同的问题，所以在实验之前专门要找专家从形态、显微结构等方面进行种属鉴定，然后投入实验（此部分内容在材料部分有显示）。
本实验测定结果中每种样品都有11个共有峰（金银花特征峰），证明属于该药材，峰面积差别反映了药材质量。
HPLC可以用于鉴别药材真伪及评价药材质量。
2.作者并没有就主要活性成分（绿原酸、木犀草苷）进行定量分析研究，建议继续进行深入研究。
答：感谢老师的建议，我收益匪浅。
绿原酸、木犀草苷定量分析已经完成，目前还未形成文字。
尚在进一步撰写中。
3.文章并没有比较所用HPLC法与参考方法的优劣，故文章重点在于质量评价的确定（而不是HPLC法的建立及验证）。
请注意相应篇幅的调整。
答：多谢老师指点，文章题目已经调整为“川渝地区金银花HPLC指纹图谱的研究”，文章正文中内容也有所调整。
4.“1.2试验方法”和“3 小结与讨论”部分内容简单重复，应适当精炼，得出本文的结论及其他研究结果的比较。
答：试验方法”和“3 小结与讨论重复内容已经精炼，属于结论部分的内容已经移至结论部分；根据建议添加了修改稿图1、图2；删除了原稿中表2，表4；原稿中图1，图2已经重做，分离效果较好。
但线条不能变成黑色，由于用软件作出来就是彩色的。
5.论文的错误较多，具体建议参见审改稿，请仔细修改。
答：论文中细节错误都一一改正，有很多无法标注的也已经按要求修改。
参考文献已经核对，两篇卷期没有写反，故未作修改。
另外原稿中表格中15个特征峰在修改稿中删减至11个。
参照峰选择是随机的，没有依据；另外稳定性试验是在冰箱放置，不是室温，所以未改动。
个人简介：赵君峰（1978-），女，河南洛阳，讲师，博士，主要从事食品生物技术及药用植物资源开发方面的研究。
中图分类号：TS275.4文献标识码：A川渝地区金银花HPLC指纹图谱的研究赵君峰1马丽苹1白志川2(1河南科技大学食品与生物工程学院河南洛阳471023；2西南大学园艺园林学院重庆北碚400715)摘要：采用HPLC法测定十个不同商品来源的金银花样品，建立川渝地区金银花药材甲醇溶解部分的HPLC指纹图谱，为科学评价与有效控制金银花质量提供新方法。
HPLC指纹图谱建立的技术要求
2、共有指纹峰的标定
采用色谱方法制定指纹图谱，必须根据参照物的保留时间，计 算指纹的相对保留时间。根据10批次的检测结果，标定中药材的共有 指纹峰。
3、共有指纹峰面积的比值
（1）以参照物峰面积作为1 （要求能出现稳定的峰） ，计算各共有指 纹峰面积与参照物峰面积的比值（参照物可以是对照品也可以是内标 物）。 （2）以内标物作为参照物的指纹图谱，则以共有指纹峰中其中一个峰 （要求面积相对较大、较为稳定的共有峰）的峰面积作为1，计算其 他各共有指纹峰面积的比值。 （3）各共有峰的面积比值必须相对固定。 （4）共有峰面积要求：单峰面积占共有峰总面积20%的共有峰，其差 值不得20%；若20%面积10%共有峰，其差值不得25%； 若 面积10%的共有峰，峰面积比值不作要求，但必须标定相对保留时 间。未达到基线分离的共有峰，应计算该组峰的总峰面积作为峰面积， 同时标定该组各峰的相对保留时间。
（5）参照物
复方制剂首选君药的活性成分或指标性成分，尽可能阐明参照
物的化学结构及化学名称，也可以选择适当的内标物插入色谱中。
（6）量化的含义
是指在定量的操作条件下，所得到的药材指纹图谱在整体特征 上可以半定量的比较，以表达原料药材指纹图谱在“量”方面的总体 差异程度，以及半成品（提取物）和成品之间及成品批间指纹图谱在纹图谱计算机辅助相似度评价软件》，一 般成品指纹图谱相似度计算结果在0.9-1.0之间为符合要求。
图1 福建莲子HPLC指纹图谱
图2 福建太子参HPLC指纹图谱
第五节 研究实例
丹参HPLC指纹图谱构建 一、药材来源（GAP基地）与鉴定 二、色谱条件与系统适应性试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇-0.1%乙酸 （5：95）为流动相；检测波长254nm；柱温为室温；流
中药指纹图谱建立的原则与步骤
（一）建立指纹图谱的一般原则中药指纹图谱的建立，应以系统的化学成分研究和药理学研究为依托，体现系统性、特征性和稳定性三个基本原则。
唯此，才能保证指纹图谱的标准化、规范化、客观化，从而便于推广和应用。
1.系统性是指指纹图谱中反映的化学成分应包括该中药有效部位所含大部分成分，或指标性成分的全部，如中药两头尖中抗肿瘤的有效成分为皂苷类化合物，则其指纹图谱应尽可能地反映其中的皂苷类成分；银杏叶的有效成分是黄酮类和银杏内酯类，则其指纹图谱可采用两种方法，针对这两类成分分别分析，达到系统全面的目的。
2.特征性是指指纹图谱中反映的化学信息（如保留时间）应具有较强的选择性，这些信息的综合结果，将能特征性地区分中药的真伪与优劣，成为中药自身的“化学条码”。
如北五味子的HPLC指纹图谱和TLC指纹图谱，不仅包括多种的五味子木脂素类成分，而且具有许多未知类成分，这些成分的峰位顺序、比值在一定范围内是固定的，并且随药材品种不同而产生差异，依此可以很好地区别其来源、产地，判别药材的真伪优劣。
3.稳定性是指所建立的指纹图谱在规定的方法、条件下的耐用程度，即不同操作者、不同实验室所重复做出的指纹图谱应在所允许的误差范围内，以体现其通用性和实用性。
因而要求包括样品制备、分析方法、实验过程、数据采集、处理、分析等全过程都要规范化操作，同时，还应建立相应的评价机构，对其进行客观评价。
（二）建立指纹图谱的一般步骤1.方案设计与思路（1）研究对象的确定在调研有关文献、新药申报资料(质量部分和工艺部分)及其它研究结果的基础上，尽可能的详尽地了解药材、中间体及成品中所含成分的种类及其理化性质，综合分析后找出成品中的药效成分或有效成分，作为成品和中间体指纹图谱的研究对象，即分析检测目标。
例如，黄芪含黄酮、皂苷及多糖三类有效组分，黄芪多糖注射液及其中间体的指纹图谱则以多糖为研究对象，黄芪原药材的指纹图谱应把黄酮、皂苷及多糖作为研究对象。
复方注射剂应根据君臣佐使的原则，以君药、臣药中的有效成分作为指纹图谱的研究对象，佐使药中的成分可采用其它指纹图谱方法进行辅助、补充研究。
HPLC同时测定何首乌中5种成分及指纹图谱的建立
HPLC同时测定何首乌中5种成分及指纹图谱的建立何首乌是一种常见的中药材，主要用于滋养肝肾、益气活血、补肝肾以及黑发。
为了保证何首乌的质量，必须对其中有效成分进行准确测定。
建立何首乌的指纹图谱也是评价其质量的重要手段。
本文将利用高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography, HPLC）技术同时测定何首乌中5种主要成分的含量，并建立其指纹图谱。
为了保证实验的准确性和可靠性，选择合适的HPLC条件是非常关键的。
对于何首乌中的5种成分，经过文献调研和实验探索，确定了以下HPLC条件：使用C18色谱柱，流动相为甲醇-水（含0.1%磷酸调节pH至3.0），流速为1.0 mL/min，检测波长为254 nm。
这些条件在实验前需要进行优化和验证，以保证测得的结果准确可靠。
收集一批优质何首乌样品，并进行样品的处理。
将何首乌样品粉碎成细粉，然后精确称取一定量的样品，并加入适量的甲醇进行超声提取。
待提取液离心沉淀后，将上清液取出，过滤后即可进行HPLC分析。
在测定何首乌中5种成分的含量时，首先需要准备好5种成分的标准品。
根据前期的研究和文献报道，选择广性向量曲线法（Wide Linear Range Calibration Curve, WLRC）进行定量分析。
即分别准备5个浓度不同的标准品溶液，通过HPLC测定其峰面积，并绘制标准曲线。
然后，测定何首乌样品中5种成分的峰面积，并通过标准曲线反推其含量。
在建立何首乌的指纹图谱时，需要将一批何首乌样品进行HPLC分析，获得它们的色谱图。
然后，根据样品的峰面积和保留时间，通过计算相似度和聚类分析等方法建立指纹图谱。
相似度由0到1，数值越大表示两个样品的相似度越高，说明它们的成分越相近。
对测定结果进行统计分析和评价。
根据测定样品的含量和指纹图谱的相似度，可以对何首乌的质量进行评价。
可以对不同产地、不同加工工艺或不同储藏条件下的何首乌样品进行比较，以找出质量的差异和原因。
骨碎补药材HPLC指纹图谱的构建及质量控制
似度＞ ． ９ ， Ｓ Ｏ ９０ Ｒ Ｄ＜２ ％，符合中药Ｈ Ｌ 指纹图谱的检验要求 。 ９ ． ５ ＰＣ 】
重现性 试验 ：取 １ 批样品 中某一样 品药材 ５ ，分 别制备供 试 品 ０ 份
溶液 ，分 别进行测定 ，结 果各共有指纹 峰的相对保 留时间和 相对峰面
积基本一致 ，相似度 ＞０ ５ Ｓ ． ，Ｒ Ｄ＜２ ％。 ９ ． ５ 稳定 性试验 ：取上 述某一供试 品溶液 ，分别在 制备后０ 、１ 、 、６ ２ ２ 、 ８进样测定 ，结果指纹峰的相对保 留时间和相对峰面积亦基本一 ４ ４ｈ 致 ，相似度 ＞０ ８ Ｓ ． ，Ｒ Ｄ＜２ ％，表明样品溶液在４ｈ ９ ． ５ ８ 内稳定。但新北美 圣草苷的峰面积在２ｈ ４后测定数值逐步降低，样品在冰箱保存则无碍 。
柱 温２ ℃ ，流速 ：ｌ Ｌｍ ｎ ５ ｍ ／ ｉ，检 测波长为 ２３ｍ。如 此色谱条件 下骨 ８ｎ
谱 可 以比较 全 面控 制 骨碎 补 骨碎补 药材 ；高效液 相 色谱指 纹 图谱 ；构 建 ；质量控 制 关
中图分 类号 ：Ｒ８ ．１ ２ ２７
文献 标 识码 ：Ｂ
文章编 号 ：１７ － １４ （０ １ ４ ０５ － ２ ６ １ ８９ ２ １ ）３ － ０ ７ ０
ｐ ｗｅ ｐｏ 谱工作 站 （ 国Ｗａｅｓ 司 ）。柚皮 苷对照 品 （ 号 ： ｏ ｒ ｒ色 美 ｔｒ 公 批
精密 吸取上述对 照 品溶 液１ Ｌ，上述 １＋样 品的供试 品溶液各 Ｏ ｏｔ Ｌ １ ０ Ｌ，分别 注入 高效 液相 色谱 仪 ，测 定其 各 自峄面积 ，计 算 ，即 ｕ 得 。ｌ批不 同来源骨 碎补 中的抽皮 苷和新北美圣草苷含 量测定结果详 Ｏ
售骨 碎补药材 有１种 之多 。本实验 研究 以抽皮 苷和新北美 圣草苷 为 ２ ｌ 对照 品 ，对 １批不 同产地 的骨 碎补药材 进行测 定 ，初步建 立了Ｈ Ｌ ０ ＰＣ 指纹 图谱 ，并进行 方法学 的考察 ，标出８ 共有指纹 峰 ，借 此指纹 图 个 谱鉴 定市售骨碎 补药材的真假 。 １仪 器 与试药 ２ ９ 型 高 效 液 相 色 谱 仪 ，２ ９ 型 二 级 管 阵 列 检 测 器 、Ｅ ６５ ９６ ｍ－
中药指纹图谱建立的原则和步骤
（一）建立指纹图谱的一般原则中药指纹图谱的建立，应以系统的化学成分研究和药理学研究为依托，体现系统性、特征性和稳定性三个基本原则。
唯此，才能保证指纹图谱的标准化、规范化、客观化，从而便于推广和应用。
1.系统性是指指纹图谱中反映的化学成分应包括该中药有效部位所含大部分成分，或指标性成分的全部，如中药两头尖中抗肿瘤的有效成分为皂苷类化合物，则其指纹图谱应尽可能地反映其中的皂苷类成分；银杏叶的有效成分是黄酮类和银杏内酯类，则其指纹图谱可采用两种方法，针对这两类成分分别分析，达到系统全面的目的。
2.特征性是指指纹图谱中反映的化学信息（如保留时间）应具有较强的选择性，这些信息的综合结果，将能特征性地区分中药的真伪与优劣，成为中药自身的“化学条码”。
如北五味子的HPLC指纹图谱和TLC指纹图谱，不仅包括多种的五味子木脂素类成分，而且具有许多未知类成分，这些成分的峰位顺序、比值在一定范围内是固定的，并且随药材品种不同而产生差异，依此可以很好地区别其来源、产地，判别药材的真伪优劣。
3.稳定性是指所建立的指纹图谱在规定的方法、条件下的耐用程度，即不同操作者、不同实验室所重复做出的指纹图谱应在所允许的误差范围内，以体现其通用性和实用性。
因而要求包括样品制备、分析方法、实验过程、数据采集、处理、分析等全过程都要规范化操作，同时，还应建立相应的评价机构，对其进行客观评价。
（二）建立指纹图谱的一般步骤1.方案设计与思路（1）研究对象的确定在调研有关文献、新药申报资料(质量部分和工艺部分)及其它研究结果的基础上，尽可能的详尽地了解药材、中间体及成品中所含成分的种类及其理化性质，综合分析后找出成品中的药效成分或有效成分，作为成品和中间体指纹图谱的研究对象，即分析检测目标。
例如，黄芪含黄酮、皂苷及多糖三类有效组分，黄芪多糖注射液及其中间体的指纹图谱则以多糖为研究对象，黄芪原药材的指纹图谱应把黄酮、皂苷及多糖作为研究对象。
复方注射剂应根据君臣佐使的原则，以君药、臣药中的有效成分作为指纹图谱的研究对象，佐使药中的成分可采用其它指纹图谱方法进行辅助、补充研究。
藤茶HPLC指纹图谱
藤茶HPLC指纹图谱陈帅;郁建平【摘要】为了提供藤茶药材质量标准的依据,本文采用HPLC法建立了藤茶药材指纹图谱.色谱条件为迪马C 18色谱柱(4.6mm×250mm,5μm),流动相为乙腈-水(0.1％)磷酸,梯度洗脱,流速1.0mL/min,检测波长291 nmm.采用中华人民共和国药典委员会出版的中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件(版本:2004A)进行数据分析,最终建立了藤茶的HPLC指纹图谱,并标定了10个共有指纹峰.方法学考察结果符合指纹图谱技术要求,可用于建立藤茶药材的指纹图谱.%To provide the basis for quality standards of Ampelopsis grossedentata, the fingerprints of Ampelopsis grossedentata were established by HPLC in the present study. The samples were separated by a Diamonsil C18 column (4. 6 mm × 250 mm, 5 μm) with acetonitril e -0.1% H3PO4 gradient system as mobile phase. The flow rate was 1.0 mL ? Min-1 and the detective wave length for the fingerprinting was at 291 um. Then the chromatograms were compared with "Similarity Evaluation System for Chromatographic Fingerprint of TCM" software published by ChPC ( Version 2004A). Therefore, HPLC fingerprint were established with 10 marked common peaks, and the methodology satisfy the requirements of fingerprint technology. The obtained method was stable and reliable with good repeatability, which may be used to establish HPLC fingerprint of Ampelopsis grossedentata (Hand-Mazz) W.T.Wang.【期刊名称】《山地农业生物学报》【年(卷),期】2011(030)003【总页数】5页(P275-279)【关键词】藤茶；显齿蛇葡萄；HPLC；指纹图谱【作者】陈帅;郁建平【作者单位】贵州大学生命科学学院，贵州贵阳550025;贵州大学生命科学学院，贵州贵阳550025【正文语种】中文【中图分类】R93藤茶系葡萄科蛇葡萄属植物显齿蛇葡萄Ampelopsis grossedentata(Hand－Mazz)W.T.Wang的嫩茎叶［1］，又名甜茶藤、田婆茶、乌蔹、红五爪金龙、大齿蛇葡萄。
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2004年SFDA《中药指纹图谱计算机辅助相似度评价软件》，一 般成品指纹图谱相似度计算结果在0.9-1.0之间为符合要求。
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图1 福建莲子HPLC指纹图谱
图2 福建太子参a HPLC指纹图谱
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第五节 研究实例
丹参HPLC指纹图谱构建 一、药材来源（GAP基地）与鉴定 二、色谱条件与系统适应性试验
三、参照物的制备
选择适宜的对照品作为参照物，如果没有适宜的对照品，可选择适 宜的内标物作为参照物。
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四、测定方法
包括测定方法、仪器、试剂、测定条件等必须固定。建议优先考 虑色谱方法。对于成分复杂的中药材可以考虑采用多种测定方法，建 立多张指纹图谱。注意方法学考察。
1、指纹图谱
第一，指纹图谱记录时间一般为1小时，但应提供2小时的记录图。 第二，TLC法必须提供从原点至溶剂前沿的图谱。第三，对于化学成 分复杂，必要时可建立多张指纹图谱。
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6、其他注意问题
（1）样品定容 一般制成样品的标示浓度单位为g/ml或mg/ml。
（2）放置 供试品溶液应在避光、低温、密闭容器条件下保存，
一般不超过两周，溶液不稳定的，一般不超过48小时。 （3）有效数字
相对保留时间和相对峰面积的有效数字要求取小数点 后3位。
（4）留样
注意留样的数量不少于实验实际用量的3倍。
（2）以内标物作为参照物的指纹图谱，则以共有指纹峰中其中一个峰 （要求面积相对较大、较为稳定的共有峰）的峰面积作为1，计算其 他各共有指纹峰面积的比值。
（3）各共有峰的面积比值必须相对固定。
（4）共有峰面积要求：单峰面积占共有峰总面积20%的共有峰，其差
值不得20%；若20%面积10%共有峰，其差值不得25%； 若
2、共有指纹峰的标定
采用色谱方法制定指纹图谱，必须根据参照物的保留时间，计算 指纹的相对保留时间。根据10批次的检测结果，标定中药材的共有指 纹峰。
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3、共有指纹峰面积的比值
（1）以参照物峰面积作为1 （要求能出现稳定的峰） ，计算各共有指பைடு நூலகம் 峰面积与参照物峰面积的比值（参照物可以是对照品也可以是内标 物）。
五、测定
分别取各批次药材供试品10l，注入HPLC仪，记录 1h色谱。
供试品指纹图谱应与质量标准所附的对照指纹图谱有 良好的相似性。
指纹图谱应有12个特征峰。
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相对保留时间/min（特征峰序号） 0.150（1）、0.368（2）、0.437（3）、0.495（4）、 0.591（5）、1.000（S）、1.143（6）、1.393（7）、 1.627（8）、2.585（9）、2.911（10）3.968（11）。
（2）精密度
主要考察仪器的精密度。取同一供试品，连续进样5次以上，考 察色谱峰的相对保留时间、峰面积比值的一致性。其峰面积比值的相 对标准偏差RSD不得大于3%。
（3）重现性
主要考察实验方法的重现性。取同一批号的供试品5份以上，按 照供试品的制备和检测方法制备供试品并进行检测，考察色谱峰的相 对保留时间、峰面积比值的一致性。其峰面积比值的相对标准偏差 RSD不得大于3%。
第四节 HPLC指纹图谱建立的关键技术要求 一、药材样品来源（中间体和注射剂另有规定）
应固定品种、药用部位、产地、采收期、产地加工和炮制方法等。 供试品的取样参照《中华人民共和国药典》2010年版中规定的中药材 取样方法，以保证供试品的代表性和均一性。按1：10取样。
二、供试品制备
必须确保中药材的主要化学成分在指纹图谱中的体现。多种有效组 分应分别提取制备。
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（5）参照物
复方制剂首选君药的活性成分或指标性成分，尽可能阐明参照物 的化学结构及化学名称，也可以选择适当的内标物插入色谱中。
（6）量化的含义
是指在定量的操作条件下，所得到的药材指纹图谱在整体特征上 可以半定量的比较，以表达原料药材指纹图谱在“量”方面的总体差 异程度，以及半成品（提取物）和成品之间及成品批间指纹图谱在 “量”的相对程度。
面积10%的共有峰，峰面积比值不作要求，但必须标定相对保留时
间。未达到基线分离的共有峰，应计算该组峰的总峰面积作为峰面积，
同时标定该组各峰的相对保留时间。
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4、非共有峰面积
非共有峰总面积不得总面积的10%。
5、方法学考察
（1）稳定性
主要考察供试品的稳定性。取同一供试品，分别在不同时间检测， 考察色谱峰的相对保留时间、峰面积的一致性，确定检测时间。
特征指纹峰面积积分相对比值 0.152±30%(1)、0.72(2)、0.191±30%(3)、
0.297±25%(4)、0.046(5)、1.000(S)、0.059(6)、0.038(7)、 0.139(8)、0.354±25%(9)、0.411±25%(10)、0.054(11)。 仪器Agilent HPLC及3D色谱工作站；色谱柱：Zorbax C18 （4.6mm250mm）色谱分析柱.
用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇-0.1%乙酸 （5：95）为流动相；检测波长254nm；柱温为室温；流 速为1ml/min。
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四、供试溶液的制备
40目，10批次，各1g（精密称取），蒸馏水提取， 趁热过滤，得提取液100ml，加10%盐酸调pH为2，再用 乙酸乙酯40ml萃取1次。萃取液浓缩至干，残渣用1ml流 动相溶解，作为供试品溶液，HPLC分析前用微孔滤膜过 滤。
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