chap3二代测序数据分析

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二代测序数据分析

1-PAM矩阵平均改变1%的氨基酸，能否说2PAM矩阵平均改变2%
用Blast在GenBank中查询序列 GAATTCCAATAGA，命中了什么数据库序列
S和t的长为l的比对，把该比对拆成两部分，一个从列1到列k，另一个从列k+1到l。计分系统的什么性质保证对任意的k整个比对的计分是其部分比对计分的和
acg $ac a acg aac g $ac aca a cg$ acg $ aca caa c g$a 5cg$ a caa 6g$a c aac
X=L[0] i=0
LF[0]=6, L[6]=c i=6 二代测序数据分析
LF[6]=5, L[5]=a i=5
BW Tranform 重构
恢复原序列
aacg $acaacg aacg$ac acaacg$ 3acg$aca caacg$a 5cg$acaa 6g$acaac
caacg $acaacg 1aacg$ac acaaCg$ 3acg$aca caacg$a 5cg$acaa 6g$acaac
LF[5]=3, L[3]=a i=3
LF[3]=1, L[1]=c i=1
循环转换
0a c a a c g $ 1 caa c g$a 2 aac g $ac 3 acg $ aca 4 cg$ a caa 5 g$a c aac 6 $ac a acg
字典方式排序
6$acaacg 2aacg$ac 0acaacg$ 3acg$aca 1caacg$a 4cg$acaa 5g$acaac
二代测序数据分析
短片段Mapping
输入
一个参考基因组大量(10-1000M)的25~100bp的reads
输出
成功map到参考基因组上的每一个位点信息未成功map比例

二三代测序技术的介绍和比较

二三代测序技术的介绍和比较二代测序技术（也称为高通量测序技术）和三代测序技术是目前最常用的两种DNA测序技术。

下面将对这两种技术进行详细介绍和比较。

1.二代测序技术：二代测序技术的代表性平台包括Illumina HiSeq、Ion Torrent PGM 等。

其工作原理是将DNA样本切割为较短的片段，并通过PCR扩增产生大量的拷贝。

然后，这些片段被连接在测序芯片上，每个片段都被反复地鸟嘌呤（A）、胸腺嘧啶（T）、胞嘧啶（C）、鸟嘧啶（G）四种碱基中的一种互补的碱基识读，并记录下与之相对应的碱基序列。

这些碱基序列最后被计算机软件组装为完整的DNA序列，进而获取样本的遗传信息。

优点：（1）高通量：可以同时测序数百万个DNA片段，获得庞大数量的数据。

（2）成本低廉：通过并行测序的方式，可以大大减少测序成本。

（3）高精度：二代测序技术的错误率较低，可以达到0.1%以下。

（4）测序速度快：每天可获得几百GB的数据。

缺点：（1）仅适用于短序列：由于二代测序技术的局限性，只能测序相对较短的DNA片段，对于长序列的测序存在困难。

（2）高度依赖参考序列：在组装过程中，需要有可靠的参考序列作为基础，否则可能出现组装错误。

（3）无法解析复杂的基因组结构：由于只能产生相对较短的序列片段，二代测序技术无法很好地解析复杂的基因结构，例如重复序列。

2.三代测序技术：三代测序技术的代表性平台包括PacBio SMRT、Oxford Nanopore等。

三代测序技术的特点是可以直接测量DNA单分子的临床序列。

该技术中的样本DNA被引入到小孔中，随后测序设备会通过测量DNA分子在小孔中的电信号变化来捕捉和记录碱基序列。

这种技术可以完整地获取较长的DNA片段，从而提供了更全面和准确的基因组信息。

优点：（1）长读长：能够测序较长的DNA片段，可以获得更全面和准确的基因组信息。

（2）无需参考序列：三代测序技术不需要依赖已知的参考序列，可以直接解析未知基因组。

二代测序数据分析简介

• The Solexa pipeline (i.e., the software delivered with the Illumina Genome Analyzer) earlier used
Quality
Encoding
• Sanger format can encode a Phred quality score from 0 to 93 using ASCII 33 to 126 • Illumina's newest version (1.8) of their pipeline CASAVA will directly produce fastq in Sanger format • Solexa/Illumina 1.0 format can encode a Solexa/Illumina quality score from -5 to 62 using ASCII 59 to 126 • Starting with Illumina 1.3 and before Illumina 1.8, the format encoded a Phred quality score from 0 to 62 using ASCII 64 to 126 • Starting in Illumina 1.5 and before Illumina 1.8, the Phred scores 0 to 2 have a slightly different meaning
二代测序数据分析简介
童春发 2013.12.23
主要内容
• • • • 重测序的原理及流程数据结构与质量评估 SRA数据库及数据获取 Bowtie2、BWA和SAMtools软件使用
重测序的原理及流程

一代测序二代测序以及三代测序的优缺点及应用对比

一代测序二代测序以及三代测序的优缺点及应用对比一代测序（Sanger测序）是最早的测序技术，使用DNA聚合酶扩增特定区域的DNA片段，并通过合成带有不同碱基的荧光标记引物进行测序。

一代测序的优点是高可靠性和准确性，能够得到较长的读长，适用于小规模的基因组测序和位点测序。

不过，一代测序存在的缺点是昂贵、耗时且无法进行高通量测序，适用于较小规模的实验。

二代测序（高通量测序）是目前最为常用的测序技术，如Illumina和Ion Torrent等商业平台。

二代测序基于串联的扩增反应，DNA模板被分成数百万小片段，每个片段通过扩增、聚合和测序步骤进行处理。

二代测序具有高通量、较低的成本和快速的测序速度等优点，能够同时测序多个样本。

缺点是读长比较短，通常为几百个碱基对。

二代测序主要应用于全基因组测序、转录组测序、表观基因组测序等大规模测序项目。

三代测序（单分子测序）是较新的测序技术，如PacBio和Oxford Nanopore等商业平台。

三代测序通过直接测量单个DNA分子的顺序来进行测序，不需要扩增反应。

三代测序的优点是具有极长的读长，可以达到几十万个碱基对，能够测序重复序列和大的结构变异。

缺点是较高的错误率和较低的测序准确性。

三代测序主要应用于长读长测序、基因组组装和变异检测等需要长reads的研究。

总结起来，一代测序适用于小规模的实验，提供高质量的数据，但成本昂贵和耗时。

二代测序适用于大规模的测序项目，具有快速、高通量和较低的成本等优点，但读长较短。

三代测序适用于长读长测序和大结构变异的分析，但错误率较高。

根据研究需求选择合适的测序技术，或者结合多种技术来获得更全面的基因组信息。

第三代测序技术(单分子实时DNA测序)与第二代测序技术(高通量测序技术)简介

第三代测序技术（单分子实时DNA测序）与第二代测序技术（高通量测序技术）简介第三代测序技术(单分子实时DNA测序)与第二代测序技术(高通量测序技术)简介第三代测序技术简介如果有人告诉你用显微镜实时观测单分子DNA聚合酶复制DNA，并用它来测序，你一定会认为他异想天开，没有一点生物的sense。

我最初就是这样认为的，然而它不仅可以实现，而且已经实现了～这个就是被称为第三代的测序技术，Pacific Biosciences公司推出的“Single Molecule Real Time(SMRT) DNA Sequencing”(单分子实时DNA测序)。

我有幸在NIH听到了这个技术发明人Stephen Turner博士的讲座，根据自己粗浅的理解记录整理一下。

要实现单分子实时测序，有三个关键的技术。

第一个是荧光标记的脱氧核苷酸。

显微镜现在再厉害，也不可能真的实时看到“单分子”。

但是它可以实时记录荧光的强度变化。

当荧光标记的脱氧核苷酸被掺入DNA链的时候，它的荧光就同时能在DNA链上探测到。

当它与DNA链形成化学键的时候，它的荧光基团就被DNA聚合酶切除，荧光消失。

这种荧光标记的脱氧核苷酸不会影响DNA聚合酶的活性，并且在荧光被切除之后，合成的DNA链和天然的DNA链完全一样。

第二个是纳米微孔。

因为在显微镜实时记录DNA链上的荧光的时候，DNA链周围的众多的荧光标记的脱氧核苷酸形成了非常强大的荧光背景。

这种强大的荧光背景使单分子的荧光探测成为不可能。

Pacific Biosciences公司发明了一种直径只有几十纳米的纳米孔[zero-mode waveguides (ZMWs)]，单分子的DNA聚合酶被固定在这个孔内。

在这么小的孔内，DNA链周围的荧光标记的脱氧核苷酸有限，而且由于A，T，C，G这四种荧光标记的脱氧核苷酸非常快速地从外面进入到孔内又出去，它们形成了非常稳定的背景荧光信号。

而当某一种荧光标记的脱氧核苷酸被掺入到DNA链时，这种特定颜色的荧光会持续一小段时间，直到新的化学键形成，荧光基团被DNA聚合酶切除为止(见图)。

二代和三代测序原理及技术详解

二代和三代测序原理及技术详解二代测序（Second Generation Sequencing）和三代测序（Third Generation Sequencing）是现代生物学中常用的两种高通量测序技术。

二代测序技术主要包括Illumina测序技术和Ion Torrent测序技术，而三代测序技术则由PacBio和Oxford Nanopore等公司开发。

本文将详细介绍二代和三代测序的原理和技术。

二代测序技术采用了不同的原理，但其基本步骤相似。

首先，DNA 或RNA样本需要经过一系列的前处理步骤，如DNA片段化、连接测序指示子、PCR扩增等。

然后，将样品片段化的DNA或RNA分子固定到测序平台上，通过荧光标记的碱基依次加入到模板上，并经过图像采集系统进行扫描和记录。

最后，根据荧光信号的强度和位置确定每个碱基的序列，并通过计算机算法进行基因组的重建和分析。

Illumina测序技术是目前应用最广泛的二代测序技术之一。

其基本原理是通过将DNA片段固定到测序芯片上的特定位置上，然后通过反复的循环扩增和碱基加入的方式进行测序。

在每个循环中，只能加入一种荧光标记的碱基，并记录荧光信号，之后通过去除荧光信号并进行图像分析来确定碱基的序列。

Illumina测序技术具有高通量、高准确性和较低的测序成本，并广泛应用于基因组学、转录组学和表观遗传学等领域。

Ion Torrent测序技术是另一种常用的二代测序技术。

其原理基于DNA聚合酶催化链延伸反应，该反应会释放出质子，通过测量质子释放的情况来确定碱基的序列。

Ion T orrent测序技术具有高通量和较低的测序成本，但由于其测序误差率较高，主要应用于低复杂度的基因组测序和个体检测等领域。

与二代测序技术相比，三代测序技术具有更长的读长和更高的速度。

PacBio是其中一种代表性的三代测序技术。

PacBio测序技术基于单分子实时测序（Single-Molecule Real-Time Sequencing）原理，通过将DNA聚合酶与荧光标记的碱基一起加入到DNA模板上，通过测量聚合酶引发的荧光信号来确定碱基的序列。

第二代测序数据分析原理

第二代测序数据分析原理第二代测序技术是近年来迅速发展起来的高通量测序技术，能够产生大量的DNA序列数据。

与第一代测序技术相比，第二代测序技术具有更高的产量、更快的速度和更低的成本，成为当前基因组学研究和医学诊断的重要工具之一第二代测序数据分析原理是指对产生的高通量测序数据进行处理和解读的过程。

该过程涉及到数据的质控、序列比对、变异检测和功能注释等多个步骤，以获取对生物学问题回答所需的信息。

下面将详细介绍第二代测序数据分析的原理。

1.数据质控数据质控是第二代测序数据分析的第一步，其目的是剔除低质量的序列，保证后续分析得到的结果的准确性。

主要的质控步骤包括去除低质量碱基、去除接头序列和过滤冗余数据。

这些步骤可以通过使用不同的软件工具来实现，如Trimmomatic、FastQC等。

2.序列比对序列比对是将测序数据与参考基因组进行比对的过程。

参考基因组可以是已知的基因组序列，也可以是人工合成的探针序列。

序列比对主要采用两种方法：短序列比对和长序列比对。

短序列比对常用的算法有Bowtie、BWA等，长序列比对常用的算法有BLAST、GSNAP等。

3.变异检测变异检测是根据测序数据中的变异信息来鉴定样本中存在的单核苷酸多态性（SNP）、插入缺失（indel）等变异类型。

变异检测的过程主要包括变异鉴定、变异筛选和变异注释。

变异鉴定的方法包括泛素缺失、泛素纯化和下一代序列法。

变异筛选使用一系列的过滤条件来减少假阳性的产生，如频率过滤、质量过滤和功能过滤等。

变异注释是将检测到的变异与已有的数据库进行比对，以获取变异的生物学功能信息，如GEMINI、ANNOVAR等。

4.功能注释功能注释是将检测到的变异与基因、通路等功能元件进行关联，从而了解变异对生物学功能的影响。

功能注释的方法包括基因本体论（GO）、通路分析、蛋白质相互作用网络分析等。

这些方法可以帮助研究者理解变异的生物学意义以及变异在特定疾病中的作用机制。

综上所述，第二代测序数据分析原理包括数据质控、序列比对、变异检测和功能注释等多个步骤。

第二代测序中的数据分析-转录组

$ Tophat -p 8 -G genes.gtf -o C1_R1_thout genome C1_R1_1.fq C1_R1_2.fq $ Tophat -p 8 -G genes.gtf -o C1_R2_thout genome C1_R2_1.fq C1_R2_2.fq $ Tophat -p 8 -G genes.gtf -o C1_R3_thout genome C1_R3_1.fq C1_R3_2.fq $ Tophat -p 8 -G genes.gtf -o C2_R1_thout genome C2_R1_1.fq C2es.gtf -o C2_R2_thout genome C2_R2_1.fq C2_R2_2.fq $ Tophat -p 8 -G genes.gtf -o C2_R3_thout genome C2_R3_1.fq C2_R3_2.fq
Step2: create a file called assemblies.txt that lists the assembly file for each sample.
Step3: $ cuffmerge -g genes.gtf -s genome.fa -p 8 assemblies.txt
• SAM tools
–
• TopHat software
–
• Cufflinks software
–
• CummeRbund software
–
*Linux, 64bit CPU, 16G memory
6.3 分析准备
6.3.1 Read alignment with TopHat
6.3.1 Read alignment with TopHat
3. Identify differentially expressed genes and transcript s

三代测序技术的应用以及与二代技术的比较

表观组
微生物组
无需打断、无需组装，转录本直接反转录得全长cDNA
平均读长15K，无需PCR，均匀覆盖基因组
测序同时直接检测各种碱基修饰、脉冲间隔持续时间IPD不同来识别
快速获得基因组完成图
根据长度不同，会建600bp（Hiseq测））如DNA甲基化，检测同、同源基因、超家族基因或等位基因表达的转录本
解决高GC、高重复和海量段序列组装困扰
25中碱基修饰，如5-mC,N6-mA、DNA损伤
目前主要应用领域，解决GC异常、高重复区
SMRT-Analysis、Gmap、
Hiseq、Miseq
基因组组装
二代补洞、三代辅助组装提升contig N50；IRYS光学图谱，提升Scaffold N50到染色体水平【将Scaffold N50再浓缩提升延长】
读长较短，只能组装到Scaffold水平
特点
做结构鉴定isoform
做表达鉴定（可以检测低丰度的）
PE150、PE300
测序准确率
单次测序准确率87.5%，测序深度15X准确度达到Q40，30Xun(8个SMRT cell) 8G
一个Lane 60G [Hiseq PE150]
一个Lane 15G[Miseq PE300]
代表
PacBio、Oxford Nanopore
SMRT-Analysis、组装【HGAP、MHAP、Falcon】
Params.xml
二代、三代测序平台比较
三代测序技术
二代测序技术
A经PCR扩增后形成分子簇，变合成边测序
测序对象
单分子DNA
PCR扩增后的DNA分子簇
测序读长
平均15K，最长45K
三代测序也叫单分子实时测序（SMRT），PacBio SMRT技术，不需要进行PCR扩增，具备超长读长、高准确率、高敏感性、无GC偏向性和直接检测修饰碱基等特点，能解决二代测序的海量数据拼接困难、稀有突变被淹没、高GC区域无法跨越、高重复片段无法准确测定的困扰。

三代测序技术的应用以及与二代技术的比较

表观组
微生物组
无需打断、无需组装，转录本直接反转录得全长cDNA
平均读长15K，无需PCR，均匀覆盖基因组
测序同时直接检测各种碱基修饰、脉冲间隔持续时间IPD不同来识别
快速获得基因组完成图
根据长度不同，会建600bp（Hiseq测）【HGAP、MHAP、Falcon】
Params.xml
二代、三代测序平台比较
三代测序技术
二代测序技术
A经PCR扩增后形成分子簇，变合成边测序
测序对象
单分子DNA
PCR扩增后的DNA分子簇
测序读长
平均15K，最长45K
PE150、PE300
测序准确率
单次测序准确率87.5%，测序深度15X准确度达到Q40，30X达到Q50
通常Q30
通量
一个run(8个SMRT cell) 8G
一个Lane 60G [Hiseq PE150]
一个Lane 15G[Miseq PE300]
代表
PacBio、Oxford Nanopore
三代测序也叫单分子实时测序（SMRT），PacBio SMRT技术，不需要进行PCR扩增，具备超长读长、高准确率、高敏感性、无GC偏向性和直接检测修饰碱基等特点，能解决二代测序的海量数据拼接困难、稀有突变被淹没、高GC区域无法跨越、高重复片段无法准确测定的困扰。
三代测序应用范围
全长转录组
全基因组De novo
Hiseq、Miseq
基因组组装
二代补洞、三代辅助组装提升contig N50；IRYS光学图谱，提升Scaffold N50到染色体水平【将Scaffold N50再浓缩提升延长】
读长较短，只能组做表达鉴定（可以检测低丰度、同源基因、超家族基因或等位基因表达的转录本

第二代测序的基本数据处理

de novo assembly
reads
contigs
―基因组科学与信息”培训研习班
Scaffolding
Contigs A
B
C
Solid MP reads
ContigID ContigA ContigA …
ContigID ContigB ContigC …
#Links 1000 200 …
biobwasourceforgenetbwashtml基因组科学与信息培训研习班32solexareadsmappingsoap2indexreferencesequences2bwtbuilderreffasinglesoappairendsoappeoutput2seoutputmaxinsertsize基因组科学与信息培训研习班32solexareadsmappingsoap2基因组科学与信息培训研习班基因组科学与信息培训研习班33solidreadsmappingbioscope基因组科学与信息培训研习班33solidreadsmapping基因组科学与信息培训研习班33solidreadsmapping基因组科学与信息培训研习班34454readsmappingnewbleroutputdirreffa1sff454readstatustxt基因组科学与信息培训研习班denovosequencingreadscorrectionshortreads
―基因组科学与信息”培训研习班
4.2 Solexa assembly
Soapdenovo output
• *.contig Contigs file • *.scafSeq Scaffolds file
―基因组科学与信息”培训研习班
―基因组科学与信息”培训研习班

第二代测序技术——新一代基因组测序技术原理及应用

第二代测序技术——新一代基因组测序技术原理及应用第二代测序技术是基于Sanger测序技术的改进和发展而来的，也是新一代基因组测序技术。

它具有高通量、高效率和低成本的特点，能够快速而准确地测序大量的DNA或RNA分子。

本文将介绍第二代测序技术的原理以及在基因组测序领域的应用。

首先，DNA样本需要经过PCR扩增，将其复制成足够数量的DNA分子，以便后续的测序过程。

扩增完成后，样本会转化为一个DNA库。

接下来，DNA库会被片段化。

传统的第二代测序技术中，会将DNA库分为较小的片段，通常长度为几百到几千碱基。

这些片段可以通过物理方法进行片段化，如超声波等。

而在一些新兴的第二代测序技术中，如Nanopore测序和单细胞测序等，可以直接对DNA进行测序，无需片段化。

然后，在片段化后的DNA片段上进行连接处理。

连接可以用于将适配体引入到DNA片段的两端，以便进行后续的测序反应。

接着，需要对连接后的DNA片段进行定量处理，以确保在后续的测序反应中能够控制好DNA的浓度。

最后，进行测序反应。

第二代测序技术包括很多种不同的测序方法，如Illumina测序、454测序、Ion Torrent测序等。

这些方法基本都是通过测量DNA分子释放的荧光信号或其它信号，来确定碱基的顺序。

此外，第二代测序技术还可以应用于转录组测序。

转录组测序可以检测特定组织或细胞中所表达的所有基因。

通过转录组测序，可以了解在不同生理状态下基因的表达水平变化，以及不同基因之间的调控网络等。

除了全基因组测序和转录组测序，第二代测序技术还可以应用于表观基因组测序。

表观基因组测序可以检测DNA上的化学修饰，如甲基化和羟甲基化等。

这些化学修饰可以影响基因的表达和调控，从而对生物体的发育和疾病等起到重要作用。

此外，第二代测序技术还可以应用于单细胞测序、宏基因组测序、博弈测序、环境样品的测序等。

这些应用领域的发展和成熟，进一步拓宽了第二代测序技术的应用范围。

总结起来，第二代测序技术是一种高通量、高效率和低成本的基因组测序技术。

第二代测序转录组的定量指标

第二代测序转录组的定量指标第二代测序技术的出现使得转录组学研究能够更加全面和准确地定量基因表达水平。

转录组是指一个生物体在特定生理或环境条件下的所有转录RNA的总体。

通过测序技术，可以对转录组进行全面的分析，以了解基因表达的动态变化。

第二代测序技术主要包括Illumina的RNA-seq和Ion Torrent的RNA-seq等。

这些技术可以对RNA分子进行高通量测序，并通过计算机算法将测序结果转化为定量指标。

这些定量指标可以用于比较不同样本之间的基因表达差异，以及在同一样本中不同基因的表达水平。

其中，常用的定量指标包括基因表达水平（RPKM或FPKM）和基因差异表达比较（Fold Change）等。

基因表达水平是指在给定的条件下，一个基因所产生的转录本数量。

RPKM（Reads Per Kilobase of transcript per Million mapped reads）或FPKM（Fragments Per Kilobase of transcript per Million mapped reads）是常用的基因表达水平的定量指标。

它们通过计算每个基因的转录本数量与总转录本数量的比例，校正了基因长度和测序深度的影响，从而使不同样本之间的基因表达水平可以进行比较。

基因差异表达比较是指在不同条件下，一个基因的表达水平是否有显著差异。

通过计算不同样本之间的基因表达水平的比值，可以确定哪些基因在不同条件下表达水平发生了变化。

常用的差异表达比较指标是Fold Change，它是两个样本之间基因表达水平的比值。

一般来说，Fold Change大于2或小于0.5的基因被认为是显著差异表达的基因。

除了基因表达水平和差异表达比较，第二代测序技术还可以提供其他定量指标，如基因的外显子覆盖率、剪接变异的检测、非编码RNA的表达量等。

这些定量指标可以进一步深入研究基因的功能和调控机制。

总之，第二代测序技术为转录组学研究提供了全面和准确的定量指标，使得我们能够更好地了解基因的表达调控和功能。

二代测序原理及报告解读

二代测序报告详细解读
二代测序原理
边复制边测序
扩
复
增
制
二代测序原理
制复
增扩
边复
制
边测序DNA的建立捕获目标片段二代测序
安捷伦捕获试剂盒
illumima 测序平台
二代测序流程复杂，参数繁多
需要检测的基因序列所有碱基数量之和
现在报告中使用的参数
目标区覆目标区平
测序质量
盖度
均深度
2.1 基因变异所致疾病及遗传方式
使用孟德尔遗传数据库查找基因所致疾病及遗传方式
显性与隐性遗传共存在
多种遗传方式
不完全显性
2.结果具体分析
1）该基因突变致病疾病类型及遗传方式 2）该样本的此处突变是否为致病性突变明确致病和可疑致病 3）该样本的突变型最终是否患病
2.2 查找突变位点的致病性
2.3 总结突变与患病的关系
• 从遗传方式看有没有患病的可能性 • 从突变类型看有没有患病的可能性
ACMG突变解析指南
未报道致病位点，致病可能性的评估指南，节选其中可能致病性很强列表如下：
3.基因与疾病背景介绍
• 基因介绍来自于Gene数据库 • 疾病介绍来自于OMIM、罕见病数据库或其他外文权威
99.8% 274.67
目标区平均深度 >20X比例
99.7%
报告结果中的数据意义
检测到与临床相关发生突变的基因
转录本编号
Exon 编号
CLCN2
NM_0011710 Exon
88
21
同一个基因可有不同的别名，使用Gene数据库统一名称
同一基因可有外显不同的转录本，子通过Gene数据库查突变类型时必须使用或换算到同一转录本的突变点

高通量测序：第二代测序技术详细介绍

在过去几年里，新一代DNA 测序技术平台在那些大型测序实验室中迅猛发展，各种新技术犹如雨后春笋般涌现。

之所以将它们称之为新一代测序技术（next-generation sequencing），是相对于传统Sanger 测序而言的。

Sanger 测序法一直以来因可靠、准确，可以产生长的读长而被广泛应用，但是它的致命缺陷是相当慢。

十三年，一个人类基因组，这显然不是理想的速度，我们需要更高通量的测序平台。

此时，新一代测序技术应运而生，它们利用大量并行处理的能力读取多个短DNA 片段，然后拼接成一幅完整的图画。

Sanger 测序大家都比较了解，是先将基因组DNA 片断化，然后克隆到质粒载体上，再转化大肠杆菌。

对于每个测序反应，挑出单克隆，并纯化质粒DNA。

每个循环测序反应产生以ddNTP 终止的，荧光标记的产物梯度，在测序仪的96 或384 毛细管中进行高分辨率的电泳分离。

当不同分子量的荧光标记片断通过检测器时，四通道发射光谱就构成了测序轨迹。

在新一代测序技术中，片断化的基因组DNA 两侧连上接头，随后运用不同的步骤来产生几百万个空间固定的PCR 克隆阵列（polony）。

每个克隆由单个文库片段的多个拷贝组成。

之后进行引物杂交和酶延伸反应。

由于所有的克隆都是系在同一平面上，这些反应就能够大规模平行进行。

同样地，每个延伸所掺入的荧光标记的成像检测也能同时进行，来获取测序数据。

酶拷问和成像的持续反复构成了相邻的测序阅读片段。

Solexa 高通量测序原理--采用大规模并行合成测序法(SBS, Sequencing-By-Synthesis)和可逆性末端终结技术（Reversible Terminator Chemistry）--可减少因二级结构造成的一段区域的缺失。

--具有高精确度、高通量、高灵敏度和低成本等突出优势--可以同时完成传统基因组学研究（测序和注释）以及功能基因组学（基因表达及调控，基因功能，蛋白/核酸相互作用）研究----将接头连接到片段上，经PCR 扩增后制成Library 。

二代测序法

二代测序法介绍二代测序法（second generation sequencing），也称为高通量测序，是一种用于测定DNA或RNA序列的方法。

相比于传统的Sanger测序方法，二代测序法具有更高的通量和更快的测序速度，因此被广泛应用于基因组学研究、生物医学研究和临床应用等领域。

二代测序技术原理二代测序技术通过将DNA片段进行大规模并行测序，来实现高通量测序。

整个测序过程可以分为DNA片段制备、文库构建、芯片上测序、图像分析和数据处理等步骤。

DNA片段制备首先，从待测样品的DNA中提取所需片段。

常用的DNA片段制备方法有PCR扩增、酶切和构建文库等。

文库构建将DNA片段连接到适当的文库载体上。

文库是DNA片段的集合，用于在后续步骤中进行测序。

构建文库的方法包括PCR扩增文库、切割文库和合成文库等。

芯片上测序将文库中的DNA样品倒置到芯片上，每个DNA片段会与芯片上的固定DNA序列匹配。

然后，使用荧光染料或其他方法来标记每个DNA片段的序列。

通过读取芯片上的荧光信号，可以获得DNA片段的序列信息。

图像分析和数据处理将芯片上的图像转换为原始数据，然后对数据进行处理和分析。

这包括配对序列的拼接、错误校正和序列比对等步骤。

最终，可以根据处理后的数据获得DNA片段的准确序列信息。

二代测序技术的优势相比传统的Sanger测序方法，二代测序技术具有以下几个优势：1.高通量：二代测序技术可以并行测序大量的DNA片段，从而大大提高了测序效率。

2.速度快：二代测序技术的测序速度很快，可以在较短的时间内完成大量的测序工作。

3.低成本：由于高通量和快速测序速度，二代测序技术的测序成本相对较低。

4.应用广泛：二代测序技术可以应用于基因组学研究、转录组学研究、表观遗传学研究和临床应用等各个领域。

二代测序技术的应用二代测序技术在科学研究和临床应用中有着广泛的应用。

基因组学研究二代测序技术在基因组学研究中发挥了重要作用。

通过对不同生物体的基因组进行测序，可以揭示其基因组的组成和结构。

上机-第二代测序中的数据分析-转录组

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TopHat
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Cufflinks
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2.1 安装 Bowtie
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解压缩
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$ cd ~/tools/bowtie/ $ unzip bowtie2-2.0.5-linux-x86_64.zip $ cd bowtie2-2.0.5/ $ cp bowtie2* ~/bin/ $ cd $ bowtie2
example2-1.L.fq_fastqc 的输出结果
4. 建立参考基因组索引
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拷贝参考基因组数据
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$ cp /home/training/data/RNA-Seq/ref2.fa ~/proj2/ref/ $ cp /home/training/data/RNA-Seq/ann2.gtf ~/proj2/ref/ $ cd ~/proj2/ref/ $ bowtie2-build ref2.fa ref2
2.2 安装 TopHat
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解压缩
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$ cd ~/tools/tophat/ $ tar -zxvf tophat-2.0.8.Linux_x86_64.tar.gz $ cd tophat-2.0.8.Linux_x86_64/ $ cp * ~/bin/ $ cd $ tophat2
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建立执行路径
注意事项
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根据质量评估进行 trimming 注意 duplication level 查看 unmapped.bam 文件注释文件的选择
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谢谢 !
GTF/GFF 格式
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GTF – General Transfer Format GFF – General Feature Format GTF 格式中主要的参数

三代二代----全长转录组研究思路解析

三代二代----全长转录组研究思路解析第三代测序技术Pacbio利用单分子实时测序(SMRT, single molecular real time sequencing)技术，无需组装即可直接获取5’端到3’端完整的全长转录本，具有超长的读长，因此可得到更高质量的转录本，有利于mRNA结构的研究，如可变剪切、融合基因、等位基因表达等。

全长转录组的研究越来越热门，联合二代转录组测序更是成为热门中的热门，基迪奥生物除了提供标准的三代全长转录组和二代转录组测序分析外，还可以利用二代转录组测序数据校正三代全长转录组数据，提高三代数据利用率；同时利用三代全长转录组数据优化二代参考基因组，提高二代定量结果的准确性。

小编通过综合三代经典文献思路和已有的项目经验，总结了较全面的三代研究设计方案，供大家参考。

三代测序利用三代测序，得到某物种的全长转录本集合，研究转录本结构时，比基于参考基因组预测到的转录组信息更准确，可准确鉴定基因的可变剪接、融合基因、基因家族和lncRNA等信息。

A.单个组织取样：研究特定组织的全长转录组；B.多个组织进行混样：等量RNA混合测序，获得物种完整的全长转录组；C.多个组织分别取样：比较不同组织或不同处理的全长转录组；案例（微信文章链接）：全长转录组应用系列一：可变polyA检测Iso-Seq应用系列(二):可变剪切分析全长转录组应用系列(三):融合基因检测三代+二代测序二代数据可以进行基因差异表达分析，也可以对三代数据的结果进行校正；同时三代数据可以辅助参考基因组优化，使定量结果更准确。

A.利用二代数据对三代数据的结果进行校正，以三代数据结果为重点，分析讨论基因结构相关研究[1]；微信文章链接：三代全长转录组的研究思路（毛竹全长转录组）B.三代数据分析基因结构，同时还可以深入研究某基因可变剪接形成的不同转录本的表达差异，分析转录组动态变化；全长转录组发现新的前列腺癌生物标志物[2]发表期刊：ClinicalCancer Research；影响因子：13.214（2017）雄性激素受体（Androgenreceptor，AR）是正常前列腺细胞和前列腺癌细胞中最主要的转录调节因子，前列腺癌患者中表达多个AR 变异体（AR-V），其中AR-v7可以提高前列腺癌对AR靶向治疗的抗性。