实验 蛋白质标准曲线的制作

Coomassie Dye-Based 蛋白质定量
PROTEIN
O CH2CH3
Coomassie G-250
NH
+
CH3 C
CH3
+ CH3CH2 N
CH2
N CH2CH3 CH2
SO3-
SO3Na
Acid
BLUE
Amax = 595nm
Protein - Dye Complex
蛋白质和染料结合是一个很快的过程，约2min 即可反应完全，呈现最大光吸收，并可稳定1h， 之后，蛋白质―染料复合物发生聚合并沉淀出 来。
1. 利用标准曲线查出回归方程。
2. 用Excel作图，测出回归线性方程。即 A595nm=a×X。相关系数一般大于0.9。
3. 未知样品蛋白质浓度的测定：
测定方பைடு நூலகம்同上，取合适体积的未知样品(奶粉， 1g奶粉溶于30mL 0.15mol/L NaCl，3000rpm 离心5分钟，取上清待用 )，使其测定值在标准
2. 标准蛋白质溶液：
纯的牛血清血蛋白(BSA)，预先经微量凯氏定氮 法测定蛋白氮含量，根据其纯度同0.15mol/L NaCl配制成1mg/mL蛋白溶液。
（二）器材
721型分光光度计、移液管（1mL，5mL）、试 管及试管架
四、实验步骤
试管编号 1mg/mL标准蛋白（mL） 0.15mol/L NaCl （mL）
五、注意事项：
（一）蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合的反应十分迅速，在2min左 右反应达到平衡；其结合物在室温下1h内基本稳定。如果测定要求 很严格，可以在试剂加入后的5－20min内测定光吸收，因为在这段 时间内颜色是最稳定的。
（二）测定中，蛋白－染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁上， 实验证明此复合物的吸附量是可以忽略的。测定完后可用乙醇将蓝 色的比色杯洗干净。
实验一 蛋白质标准曲线的制作
一、实验目的
学习考马斯亮蓝（Coomassie Brilliant Blue）法测定蛋白质浓度的原理和方 法
二、实验原理
一般用分光光度法测物质的含量，先要制作标 准曲线，然后根据标准曲线查出所测物质的含 量。
考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质 ―染料结合的原理，定量的测定微量蛋白浓度 的快速、灵敏的方法。
曲线的直线范围内（0～1000µg），根据所测 定的A595nm，利用标准曲线或回归方程求出相 当于标准蛋白质的量（µg），从而计算出未知 样品的蛋白质浓度（mg/mL）。
一般被测样品的A595nm值在0.1—0.5之间，所以 上述样品如果A595nm值太大，可以减少取样量， 如果仍然很大，可以定量稀释后再进行测定。
定。中间不要用蒸馏水润洗比色杯，仅用待测液润洗2～3次即可。 另外，还要注意，玻璃仪器要洗涤干净并保持干燥，避免温度变化；
取量要准确；分光光度计十分灵敏，测定时要认真仔细。
六、问题与思考
1．为何制作蛋白质标准曲线？ 2．酶活的一般定义？在提取过程，为何要测
定蛋白质浓度？
1．Bradford法由于染色方法简单迅速，干扰物质少，灵敏度高，现 已广泛应用于蛋白质含量的测定。
2扰．测有定些，阳但离大子量，的如去K污+、剂N如a+T、ritMongX2+-、10(0N、HS4D)2SS等O严4、重乙干醇扰等测物定质。不干 3．测定时仅使用一套比色杯（2个），并从低浓度到高浓度依次测
三、实验仪器和试剂
（一）试剂
1. 考马斯亮蓝试剂：
考马斯亮蓝G－250 100mg溶于50mL 95%乙醇， 加入100mL 85% H3PO4，用蒸馏水稀释至 1000mL,滤纸过滤。最终试剂中含0.01% （W/V）考马斯亮蓝G—250,4.7%（W/V）乙 醇，8.5%（W/V）H3PO4。
01234 5 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0
考马斯亮蓝试剂 （mL）
55555 5
充分摇匀，20min内以0号管为空白对照,在595nm测定
A595nm
－
以A595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标 （六个点为200µg、400 µg、600µg、800 µg、 1000 µg），在坐标轴上绘制标准曲线。
考马斯亮蓝G－250存在着两种不同的颜色形式， 红色和蓝色。它和蛋白质通过范德华力结合， 在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合 符合比尔定律（Beer’s law）。此染料与蛋白 质的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨 基酸残结合，通过测定595nm吸光度可测定蛋 白质的含量。另外，反应体系中呈现的颜色变 化主要是G-250分子间疏水相互作用形成的聚集 体聚集程度不同引起的。单体形式表现为蓝色， 单体和聚集体共存时表现为绿色，全为聚集体 形式呈现为棕红色。影响因素主要为溶液体系 中磷酸、乙醇、NaCl的含量。