玉米ZmCIPK23基因Mutator插入突变体的鉴定
玉米中转基因成分的筛查检测策略
玉米中转基因成分的筛查检测策略王培珍N o n g j i t u i g u a n g 玉米作为禾本科一年生的草本植物，其营养成分丰富，提供大量的碳水化合物。
转基因的玉米具有较强的耐寒性、耐旱性、耐贫瘠性等优良性质，容易种植。
但转基因玉米也存在着一定安全隐患，转基因检验受到广大消费者的重视。
基于此，本文将主要论述玉米中转基因成分的筛查检验策略。
一、玉米中转基因成分的筛查检测的重要性转基因成分检验技术是转基因生物研究和安全管理的基础，检验人员通过技术手段判断目的基因导入到玉米受体细胞中，并检验玉米受体细胞是否成功表达相关性状。
目前已经有65个国家和地区对转基因产品采取强制的标志性管理，2015年10月开始实行的中华人民共和国安全法第69条中明确规定了转基因食品应该明确标注。
转基因检验行业快速发展，因此建立一个迅速准确的基因检验方法，是当前检测技术所面临的关键问题。
截止到2018年中国玉米产量25733万吨，中国的转基因玉米转化事件有16个，转基因玉米种类过多，同时存在变异亚种，检验人员应该综合DNA 序列分析，选取合适的基因元件，确定转基因玉米的筛查方法。
二、玉米中转基因成分的筛查检测技术1、PCR 检验技术PCR 检验技术是一种灵敏度高，目前发展较为成熟的转基因检验方法，根据特异性主要分为筛查基因特异性、翻译产物特异性等。
PCR 检验的主要基因包括调控基因、标记基因、及导入到玉米细胞中的目的基因。
其中调控基因主要包括基因中前端和后端的启动子与终止子，标记基因主要包括抗草丁膦基因、抗卡那霉素基因。
PCR 技术在玉米转基因成分检验中有很大的应用，但由于转基因玉米中含有多个目的基因，往往需要多重PCR 进行检验，其快速提高检验效率，同时保证玉米中转基因成分的特异性。
2、环介导等温扩增检验技术环介导等温扩增检验技术作为一种新兴的DNA 扩增方法，这种技术主要利用了特异性的核糖核苷酸引物，综合应用DNA 聚合酶，促进DNA 在常温下快速增殖，完成核酸的快速扩增。
全基因组分析玉米MuDR转座因子插入突变体库
作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2011, 37(5): 772−777 /zwxb/ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9E-mail: xbzw@This work was supported by the grants of “863” High-tech Program (No. 2006AA10A106), the China National Fundamental Fund of Personnel Training (No. J0730649) and partly supported by the open funds of the National Key Laboratory of Crop Genetic Improvement. Corresponding author: ZHENG Yong-Lian, E-mail: zhyl@ Received(收稿日期): 2010-10-23; Accepted(接受日期): 2011-03-08.DOI: 10.3724/SP.J.1006.2011.00772Genome-wide Analysis of MuDR -related Transposable Elements Insertion Population in MaizeFENG Jing 1, FU Xue-Qian 1, WANG Ting-Ting 2, TAO Yong-Sheng 2, GAO You-Jun 1, and ZHENG Yong-Lian 1,*1National Key Laboratory of Crop Genetic Improvement, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China; 2 Hebei Research Station ofNational Key Laboratory of Crop Genetic Improvement, Agricultural University of Hebei, Baoding 071000, ChinaAbstract: Insertional mutagenesis has now been widely used to knockout genes for functional genomics. The maize Mutator transposons hold an advantage of high activity to construct large mutant libraries. In this study, a MuDR line was used to cross with an elite Chinese maize inbred line Z31. A total of 1 000 M 1 individuals were planted and self-pollinated to generate their M 2 fami-lies. Experiments were conducted to investigate the insertion specificity of MuDR related transposable elements. Six hundred and ninety-five MuDR inserted flanking sequences were isolated with a modified MuTAIL-PCR method and analyzed with bioinfor-matics. Three hundred and seventy-four non-redundant insertion sites were identified and 298 of them were mapped to a single locus on the integrated maize map. The results revealed some prominent features of the MuDR -related insertions of maize: random dis-tribution across the 10 chromosomes, preferential insertion into genic sequence and favoring some classes of functional genes. Keywords: Zea mays ; Mutator (Mu ) transposons; MuDR elements; Flanking sequence; Insertion sites; Mu TAIL-PCR全基因组分析玉米MuDR 转座因子插入突变体库冯 静1 傅学乾1 王婷婷2 陶勇生2 高友军1 郑用琏1,*1华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室, 湖北武汉430070; 2河北农业大学作物遗传改良国家重点实验室河北实验基地, 河北保定071000摘 要: 在功能基因组研究中, 插入诱变被广泛用于基因敲除。
突变体鉴定技术在植物育种中的应用
突变体鉴定技术在植物育种中的应用一、突变体鉴定技术概述突变体鉴定技术是指利用基因突变或染色体突变等突变现象，在生物体的基因组或染色体组中寻找变异体，并对其进行鉴定和评价的技术。
突变体鉴定技术在植物育种中的应用相对来说较为广泛，主要有随机突变体筛选、化学、物理诱变体筛选、转座子插入突变体筛选、RNAi抑制体筛选等。
二、随机突变体筛选技术随机突变体筛选技术是一种利用不同筛选策略来寻找植物新突变体的技术。
该技术主要包括自然突变体分离、EMS诱导突变体筛选、紫花苜蓿随机突变体筛选以及T-DNA插入突变体筛选等。
1. 自然突变体分离：自然突变体分离的原则是利用悬垂小球法获取悬浮球培养物，然后在培养物中筛选出不同的突变体。
自然突变体分离通常需要耗费一定的时间和人力成本，在实际应用中不太常用。
2. EMS诱导突变体筛选：EMS（乙基甲磺酸）是一种化学诱变剂，可以引起基因的点突变和染色体的断裂重组等现象。
EMS诱导突变体筛选的原理是将EMS作用于植物组织中，再根据所需特性筛选出目标突变体。
这种方法可以较为快速地诱导出培养物中的突变体，被广泛用于获得与生物体形态、生长等方面有关突变体的筛选。
3. 紫花苜蓿随机突变体筛选：紫花苜蓿随机突变体筛选主要是利用基于DNA甲基化的遗传活性指数技术，来评估苜蓿中的DNA甲基化水平差异所诱导的突变体。
该方法目前主要用于识别与生物体对环境胁迫或致病因素的响应相关的突变体。
4. T-DNA插入突变体筛选：T-DNA插入突变体筛选主要是通过构建T-DNA插入文库，将T-DNA插入到目标基因流区域，然后通过PCR扫描或其他遗传操作方法，鉴定得到的突变体，并进行筛选。
三、化学、物理诱变技术化学、物理诱变技术是指利用化学剂或物理因素对生物体进行诱变，产生一定比例的突变体，并对其进行筛选。
1. 化学诱变技术：化学诱变技术主要是利用一些化学剂，如硫酸亚铁等在处理过程中对目标植物进行诱变。
该方法操作简单，结果稳定可靠。
玉米总DNA导入水稻突变后代的分析的开题报告
玉米总DNA导入水稻突变后代的分析的开题报告题目：玉米总DNA导入水稻突变后代的分析研究背景：植物基因工程技术的发展促进了人类对于农作物品种的改良，不同作物之间的基因交叉、导入和组合也变得越来越普遍。
目前，许多研究已经证明了在不同种类的农作物中进行杂交、导入外源DNA或导入基因元件等技术的可行性。
作为全球最为重要的农作物，水稻已经成为了人们研究时的重点，通过外源DNA导入可实现水稻栽培品种特征的快速调整与改进。
尽管如此，对于导入目的基因在受体植物中的表达情况以及遗传变异情况等问题仍需进行深入的探究和验证。
研究目的：本论文将以玉米DNA和水稻杂交异源株为研究对象，旨在分析玉米总DNA导入水稻后代中所引起的遗传变异原因及可能的影响。
同时，我们将探究在水稻中导入外源DNA与目标水稻品种基因表达的相互关系以及遗传特性。
研究方法：首先，依据实验要求选取玉米作为外源植物，并通过体外染色体移植技术将玉米总DNA导入水稻异源株，根据基因组序列分析方法展开DNA测序工作，借助相应的生物信息学软件对所得测序结果进行定量和定性的分析。
同时，我们将通过组学技术在水稻后代中对导入材料和非导入材料的基因表达和多态性进行比较，对样本进行深度分析和建模，探索其潜在的遗传变异规律。
研究意义：本论文将为人们深入研究水稻栽培品种基因修复和遗传改良，提供了新的思路和途径。
同时，它将从多个角度探讨农作物品种改良过程中的基因表达变异式，以期为农业生产提供更好的保障。
研究进度：目前，我们已经完成实验的样品采集、基因组DNA扩增、测序以及序列分析等重要步骤。
下一步，我们将进入数据分析和建模阶段，并及时汇报研究进展和成果，期望尽早达成预期的研究目标。
玉米雄性不育突变体mi-ms-3的遗传分析及分子鉴定
作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2020, 46(12): 1991 1996 / ISSN 0496-3490; CN 11-1809/S; CODEN TSHPA9 E-mail: zwxb301@本研究由国家重点研发计划项目(2016YFD0100804)资助。
This study was supported by the National Key Research and Development Program of China (2016YFD0100804).*通信作者(Corresponding author): 岳兵, E-mail: yuebing@第一作者联系方式: E-mail: tianshike1996@Received (收稿日期): 2020-05-07; Accepted (接受日期): 2020-08-19; Published online (网络出版日期): 2020-08-31. URL: https:///kcms/detail/11.1809.S.20200828.1751.009.htmlDOI: 10.3724/SP.J.1006.2020.03025玉米雄性不育突变体mi-ms-3的遗传分析及分子鉴定田士可 秦心儿 张文亮 董 雪 代明球 岳 兵*华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室, 湖北武汉 430070摘 要: 玉米是杂种优势利用的最好的作物之一, 雄性不育材料作为一种宝贵的种质资源, 对杂种优势的利用具有十分重要的价值。
前期筛选得到1个雄性不育突变体, 并将其命名为mi-ms-3。
该突变体表现为: 雄穗花药数目减少且不外露, 每个花药只有2个药室, 部分花药退化为膜状并在其末端形成丝状物; 1% I 2-KI 染色发现花药中含有能正常着色的花粉粒, 与野生型花粉镜检不同之处在于总花粉粒数目的减少; 突变体雌穗花丝增多, 成熟果穗的籽粒两侧各有1个败育的籽粒。
Mutator转座子介导的玉米胚大小突变体的遗传分析
Mutator转座子介导的玉米胚大小突变体的遗传分析王荣纳;李映辉;杨伟峰;陶勇生【期刊名称】《河北农业大学学报》【年(卷),期】2013(36)4【摘要】玉米胚大小是由多基因控制的数量性状.本研究以Mutator(Mu)转座子诱变的M5和BC2F2群体为材料,采用数码成像和Photoshop(R)软件相结合的方法测定胚大小,计算胚面积与籽粒面积；以胚面积和籽粒面积的比值(SST)作为胚性状评价标准,对M5和BC2F2诱变材料进行遗传分析.结果表明:在2种世代的诱变群体中共获得了8个胚大小突变体；用MuTail-PCR方法分析突变体材料Mu插入位点的侧翼序列,获得了Mu因子真实性插入的2个靶位点；经Blastn功能分析,该2个靶位点可能与编码鸟嘌呤核苷酸结合蛋白和一种泛素连接酶有关.这些突变体为进一步克隆控制胚大小的基因提供了宝贵的材料.【总页数】5页(P7-11)【作者】王荣纳;李映辉;杨伟峰;陶勇生【作者单位】河北农业大学农学院,河北保定071000;河北农业大学农学院,河北保定071000;河北农业大学农学院,河北保定071000;河北农业大学农学院,河北保定071000【正文语种】中文【中图分类】S513【相关文献】1.Mutator 转座子介导的玉米甜质突变体侧翼序列克隆 [J], 成业;么大轩;刘云婷;胡文静;段会军2.Mutator诱导的玉米白化突变体插入位点的遗传分析及代谢途径的构建 [J], 王婷婷;翟立红;苏旭;冯静;李娟;高友军;陶勇生;张祖新;郑用琏3.水稻转座子突变体库的构建及突变类型的遗传分析 [J], 朱正歌;肖晗;傅亚萍;胡国成;于永红;斯华敏;张景六;孙宗修4.Mutator转座子介导的PPR插入位点分离与遗传分析 [J], 杨伟峰;王荣纳;曹晓良;张祖新;陶勇生;陈景堂;郑用琏5.玉米Mutator转座子突变体库研究进展 [J], 李见坤;郑军因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
玉米叶色突变体遗传分析及基因定位
植物遗传资源学报2018,19(6):1205⁃1209Journal of Plant Genetic ResourcesDOI:10.13430/ki.jpgr.20180326001玉米叶色突变体遗传分析及基因定位王 飞,段世名,李 彤,王荣纳,陶勇生(河北农业大学农学院/国家玉米改良中心河北分中心/华北作物种质资源教育部重点实验室,保定071001)收稿日期:2016⁃03⁃26 修回日期:2018⁃04⁃09 网络出版日期:2018⁃09⁃20URL :http :// /kcms /detail /11.4996.S.20180920.1435.001.html 基金项目:河北农业大学创新创业项目(2017096);国家粮食丰收增收科技创新专项(2017YFD0300901⁃04)第一作者研究方向为玉米遗传育种㊂E⁃mail :462188997@通信作者:陶勇生,研究方向为玉米遗传育种㊂E⁃mail :yshtao2016@ 摘要:玉米叶色与叶绿体及结构相关,调控光合产量,因而对调控叶色基因的遗传研究或克隆将有助于玉米光合产量的遗传改良和植物光合作用理论机制的解析㊂本研究以玉米W22::Mu 介导的综31为遗传背景的导入系群体为材料,获得了细胞核单隐性基因控制㊁叶绿体结构和数目异常㊁色素缺失和PSII 显著降低的叶色突变体㊂使用覆盖B73基因组的SSR 标记将突变位点定位于约2.95Mb 区间(bnlg1863~umc2075)㊂基于区段标记开发和1200单株分离群体将突变位点精细定位于约900kb 区间(B73RefGen_V4;S1~S7区间),经区段内基因表达和功能分析获得了候选基因Zm00001d010000,该基因编码硫氧还蛋白,与突变体表型形成相关㊂该研究将为光合产量的遗传改良和植物光合作用理论机制解析提供重要的基因或标记资源㊂关键词:玉米;叶色;突变体;基因定位Fine Mapping and Candidate Gene Analysis ofLeaf Color Mutant in MaizeWANG Fei,DUAN Shi⁃ming,LI Tong,WANG Rong⁃na,TAO Yong⁃sheng(College of Agronomy ,Hebei Agricultural University /Hebei Sub⁃center of National Maize Improvement Center /North China Key Laboratory for Crop Germplasm Resources of Education Ministry ,Baoding 071001)Abstract :The leaf color of maize is associated to the content and structure of chloroplast,which is the com⁃partment and of importance in photosynthesis.Genetic analysis and isolation of genes that control the leaf color will provide insights in the genetic improvement for photosynthetic yield and exploration of the theoretical mechanism.In this study,by screening for maize mutants generated by W22::Mu in introgression lines with genetic back⁃ground of Z31,we obtained a leaf color mutant with the abnormal chloroplast,lack of pigment and the reduction of PSII,which was controlled by a single recessive locus.By the low⁃resolution genetic mapping using the SSR mark⁃ers,this mutation locus was mapped to a 2.95Mb interval(B73RefGen_V4;bnlg1863⁃umc2075).Furthermore,this locus was finely mapped to a ~900kb interval(B73RefGen_V4;S1⁃S7)by 1200individuals plants fromBC 6F 2and developed SSR.Taking advantage of gene annotation and expression analysis,we identified a strong candidate gene Zm00001d010000that encodes for thioredoxin.Thus,the study could provide genetic materialand the selection markers that become valuable in theoretical and applied research for increasing photosyntheticyield.Key words :maize;leaf color;mutant;fine mapping 玉米是重要的粮食和饲料作物,也是遗传学和育种学理论与实践应用的模式作物,因而对玉米叶色突变体进行遗传研究或基因克隆将为禾谷类作物光合产量的提高和遗传改良提供有益信息㊂叶色变植 物 遗 传 资 源 学 报19卷异决定于色素(主要包括:叶绿素和胡萝卜素)含量及比率[1],而叶绿素决定植物功能叶片对光的吸收㊁传递和能量转换[2],因而叶色变异调控光合效率㊂类胡萝卜素是一种辅助色素,能促进叶片光形态建成,调控PSII系统效率[3]㊂叶绿体是植物光合作用器官,其数目和结构变异将直接影响光合作用效率㊂因而对叶肉细胞的叶绿体数目及结构㊁色素含量和PSII效率的检测和评价,将为本研究叶色突变体遗传和突变位点候选基因预测提供帮助㊂叶色突变是植物发生频率较高的变异,是由细胞核基因或叶绿体基因或者二者互作共同控制的遗传[4]㊂研究表明,叶色变异受原质体分化㊁编码光系统蛋白的基因㊁叶绿体基因㊁蛋白质转运转录因子和多亚基复合物装配调控因子等相关基因调控[5],预示了植物叶色遗传研究的复杂性和艰巨性㊂叶绿素途径和类胡萝卜素途径的基因全部被克隆[6⁃11],而且已分离和克隆了至少210个与玉米叶色相关基因或QTL位点,其中18个与本研究突变体表型类似的叶色突变位点/基因被克隆(https:///)㊂尽管这些为玉米叶色变异遗传研究提供指导,但可能还不完全,或许本研究将作为叶色变异遗传和生物学研究的一个重要补充㊂本研究基于本课题组前期创制的叶色突变体[12],属于细胞核单隐性基因控制,以及叶绿体结构异常㊁色素缺失和PSII显著降低的性状变异类型,与报道相似突变体存在差异,开展了该叶色突变体位点的精细定位,旨在为玉米叶色变异研究和作物光合作用理论机制提供有益信息㊂1 材料与方法1.1 植物材料以玉米自交系综31(Z31)与W22::Mu杂交经M2表型鉴定获得叶色突变体(2008年,保定),突变体家系野生型与Z31连续回交到BC6F1,将其自交获得BC6F2用于突变体的遗传分析(2011⁃2015年,保定),以及生理生化指标㊁叶片亚细胞结构鉴定和观察㊂使用BC6F2及其自交果穗后代用于突变位点定位(2015⁃2016年,保定)㊂1.2 叶肉细胞叶绿体数目和亚细胞结构观察及叶片色素含量鉴定将BC6F2室内种植取3叶期叶片,将清洗干净的叶片置于载玻片上,使用解剖刀片切割叶横切面,切割叶片于光学显微镜下观察叶肉细胞的叶绿体数目;取3叶期叶片切成1mm×2mm,叶片使用戊二醛处理㊁1%锇酸/Pipes缓冲液固定㊁5梯度乙醇脱水和Epon812包埋剂处理,全部流程和试剂配制按Zavaleta⁃Mancera[13]的方法进行㊂LKB⁃V型切片机(莱卡公司,德国)进行包埋叶片超薄切片,铀铅染色后置于日立H⁃600型电子显微镜(日立公司,日本)观察和成像㊂取3叶期叶片使用Biochemicals叶绿素荧光仪(英国汉莎科学仪器公司,英国)测定光合系统II (PSⅡ)原初光能转化效率比值(Fv/Fm)㊂每个基因型测定20株,而且测定叶片位置保持处于相同或相近部位㊂测定前叶片暗处理20~40min㊂取3叶期叶片各3株,分别为0.1g/株㊂叶片处理和提取液定容参照Arnon[14]的流程㊂将提取液置于比色杯,以95%乙醇为参比液,使用Beekman DU800型分光光度计(Beckman公司,美国)分别读取665nm㊁649nm和470nm的OD值㊂按Arnon[14]的Lichtenihaler法计算叶绿素a含量[A=(13.95×OD665-6.88×OD649)×v/(1000×w)]㊁叶绿素b含量[B=(24.96×OD649-7.32×OD665)×v/(1000×w)]和类胡萝卜素含量[(1000×OD470-2.05×A-114×B)/245],其中,OD㊁v和w分别为光密度值㊁提取液总体积和鲜重㊂以上野生型和突变型株叶片均来自同一BC6F2,而且每个单株取样部位均位于第2叶相同部位㊂1.3 叶色突变位点定位及候选基因预测采用CTAB法[15]提取BC6F2单株DNA㊂利用均匀覆盖B73基因组的963对SSR(SSR,simple sequence repeat)标记筛选突变型与Z31间差异标记,以BC6F2野生型为对照,使用6.00%聚丙烯酰胺凝胶电泳和0.33%硝酸银染检测PCR产物[16]㊂基于突变型与Z31间差异标记,参照基因组B73Ref⁃Gen_V4开发新的SSR标记获得突变位点的标记区间㊂SSR位点寻找使用SSR Hunter软件[17],引物设计使用Primer Premier5.0(http://www.premierbio⁃/),使用这些SSR标记检测目标区段染色体交换系用于突变位点的精细定位㊂基于精细定位区间B73RefGen_V4的基因注释㊁突变体光合作用参数评价和它们在叶片表达数据确认候选基因㊂基因表达数据来源maizeGDB(http://www.maizegdb. org/)㊂区间具有编码基因和叶片中表达基因被视为候选基因㊂使用BLAST(https://blast.ncbi.nlm. /)分析候选基因功能㊂6021 6期王 飞等:玉米叶色突变体遗传分析及基因定位2 结果与分析2.1 突变体遗传分析㊁叶绿体及结构观察㊁叶片色素含量及PSII 值利用分离群体苗期叶片表型遗传分析说明突变性状属于细胞核隐性单基因控制(表1和图1A)㊂叶肉细胞切片显微镜检测显示:突变型相对野生型具有较少数量的叶绿体(图1B㊁C)㊂叶肉细胞亚细胞结构观察表明:突变型相对于野生型的叶绿体较小且数量少,类囊体片层排列紊乱㊁基粒较少(图1D㊁G),因而该突变体属于叶绿体结构变异类型㊂叶片色素含量检测表明:突变型与野生型叶片中叶绿素a㊁叶绿素b㊁类胡萝卜素㊁总叶绿素含量存在极显著差异(P <0.01,图1H),说明该突变体属色素合成缺陷类型;叶绿素荧光仪检测突变型的PSII 值相对野生型较低(P <0.01,图1I),说明突变型叶片PSⅡ系统光能转换和捕光效率较低㊂表1 分离群体的遗传分析Table 1 The genetic analysis in segregation population群体Population 年份Years 野生型/突变型Wild /mutant 卡方值χ2⁃value BC 3F 22012180/550.32BC 6F 22015246/800.04χ21,0.05阈值=3.84A:自左到右分别为W22::Mu ,Z31,以及同一个BC 6F 2的野生型和突变型;B㊁C:分别为野生型和突变型的叶肉细胞(500μm);D㊁E:野生型叶片亚细胞结构(1μm 和200μm);F㊁G:突变型叶片亚细胞结构(1μm 和200μm);H㊁I:**极显著差异A:from left to right⁃W22::Mu ,Z31,wild and mutant type from a same BC 6F 2,respectively,B and C:mesophyll cells for wild and mutant type(500μm),D and E:the leaf subcellular structure for wild type(1μm and 200μm),F and G:the subcellular structure for mutant type(1μm and 200μm),H and I:**significant difference图1 突变体表型㊁叶绿体及结构和色素含量检测Fig.1 The phenotypic variation of chloroplast⁃abnormal mutant2.2 叶色突变位点定位利用覆盖B73基因组的963对SSR 标记检测突变型(BC 6F 2)与Z31间差异,获得了它们基因组间差异位于bnlg1863~umc2075区间,物理距离为2.95Mb(B73RefGen_V4)(图2A)㊂基于B73基因组序列设计SSR 引物筛选获得了4个多态性标记(表2)㊂与此同时,使用6个多态性标记检测约1200单株BC 6F 2群体,获得了6个染色体交换事件,将突变位点定位于S1~S7间,物理距离为900kb(B73RefGen_V4)(图2A),含有9个编码基因㊂其中4个基因是在苗期叶片中表达(图2B ),Zm00001d010000在苗期的叶片中高表达,其他3个基因在苗期叶片中的表达量均较低(图2C),因此将Zm00001d010000作为玉米叶色突变位点的候选基因,具有硫氧还蛋白超家族功能(图2B),与突变体表型形成密切相关㊂表2 用于精细定位开发的SSR 标记Table 2 Thenewly⁃generated SSR primers for fine map⁃ping名称Names 正向/反向Forward /ReverseS1CCAGTGTATTTGTCGTGCG /AAGGCAGGGAGAGTAGGAGA S7AGGGCTATTTGTATTCCGC /ATTGTTGGCTAACCGAGGS9GCAGTTTCTCACAGCCTTACA /GATTCTTCGCATCCACACAT S31AAATCAGTAGCCCGTATCTCC /GGTCGCAAGTAAGTGACGA7021植 物 遗 传 资 源 学 报19卷A:L1~L6分别表示6个染色体重组事件㊂黑框和白框分别表示来自突变型和Z31的基因型㊂No.表示群体数量;B:黑框表示精细定位区段内的编码基因,白框表示候选基因;C:精细定位区段编码基因在叶片中的表达A:L1~L6represent the genotype of recombination events,black and white boxes represent from mutant type and Z31,respectively.No .represent numbers of population,B:black and white boxes represent the genes inside fine mapping interval and structureof candidate gene,C:expression of all encoding genes inside fine mapping interval in leaves at the seedling stage 图2 叶色突变体位点的精细定位及候选基因结构和表达Fig.2 Fine mapping and cloning of the chloroplast⁃abnormal mutant3 讨论3.1 叶色突变位点定位的科学性本研究获得细胞核单隐性基因控制的叶色突变,表型变异与野生型差异显著,而且课题组又使用Z31作为轮回亲本构建了含突变位点的W22::Mu介导导入系BC 6,为突变表型准确鉴定和群体单株遗传背景 噪音”降低奠定了基础,因而可显著提高突变位点定位的准确性和灵敏度[18]㊂导入系与Z31间的基因组差异评价使用了来源于共享B73数据库( /)的SSR 标记,而且广泛应用于QTL 位点定位[19]㊂与此同时,我们用于精细定位区间的SSR 标记开发㊁表型鉴定和精细定位区段内跨叠系构建方法也是被广泛应用的,而且是科学的和有效的方法[20⁃21]㊂所以,本研究结果具有准确性和科学性㊂3.2 候选基因Zm00001d010000与突变体叶色变异的关联经连锁分析我们获得了控制叶色突变体的候选基因Zm00001d010000,编码硫氧还蛋白㊂硫氧还蛋白属于约220个氨基酸的小分子蛋白㊂植物叶绿体含有包括硫氧还蛋白的多种硫氧还蛋白酶系统[22]㊂硫氧还蛋白能与Mg 2+螯合酶CHLI 亚基互作,而Mg 2+螯合酶调控Mg 2+与叶绿素合成前体原卟啉IX 的螯合[23⁃24],因而Zm00001d010000变异影响了叶绿素合成,进而出现突变体色素含量降低的表型;硫氧还蛋白经PLN1蛋白调控叶绿体基因转录和叶绿体发育[25],因而Zm00001d010000变异可能出现突变体PSII 值降低和叶绿体结构异常㊂我们推测Zm00001d010000是调控光合作用的多功能复合体,更精确功能机制需要进一步验证㊂参考文献[1] Mochizuki N,Tanaka R,Grimm B,Masuda T,Moulin M,Smith A G,Tanaka A,Terry M J.The cell biology of tetrapyrroles:a life and death struggle.Trends in Plant Science,2010,15(9):488⁃498[2] 刘贞琦,刘振业,马达鹏,曾淑芬.水稻叶绿素含量及其与光合速率关系的研究.作物学报,1984,10(1):57⁃64[3] Franco A C,Matsubara S,Orthen B.Photoinhibition,carotenoidcomposition and the co⁃regulation of photochemical and non⁃pho⁃tochemical quenching in neotropical savanna trees.Tree Physiology,2007,27(5):717⁃725[4] 吴军,陈佳颖,赵剑,林冬枝,董彦君.2个水稻温敏感叶色突变体的光合特性研究.中国农学通报,2012,28(21):16⁃21[5] 徐培洲,李云,袁澍,张红宇,彭海,林宏辉,汪旭东,吴先军.叶绿素缺乏水稻突变体中光系统蛋白和叶绿素合成特性的研究.中国农业科学,2006,39(7):1299⁃1305[6] 史典义,刘忠香,金危危.植物叶绿素合成㊁分解代谢及信号调控.遗传,2009,31(7):698⁃704[7] 杨伟峰.Mutator 转座子介导的玉米叶色突变体侧翼序列的克隆及遗传分析.保定:河北农业大学,2012[8] Xing S,Miao J,Li S,Qin G,Tang S,Li H,Gu H,Qu L J.Disrup⁃tion of the 1⁃deoxy⁃D⁃xylulose⁃5⁃phosphate reductoisomerase (DXR )gene results in albino,dwarf and defects in trichome initi⁃ation and stomata closure in Arabidopsis .Cell Research,2010,20(6):688⁃700[9] Tripathy B C Pattanayak G K Chlorophyll biosynthesis in higherplants.Advances in Photosynthesis and Respiration,2012,34:63⁃94[10] Bollivar D W.Recent advances in chlorophyll biosynthesis.Photo⁃synthesis Research,2006,90(2):173⁃194[11] 王平荣,张帆涛,高家旭,孙小秋,邓晓建.高等植物叶绿素生物合成的研究进展.西北植物学报,2009,29(3):629⁃636[12] Yang W F,Tian Y H,Wang T T,Wang R N,Tao Y S.Isolating8021 6期王 飞等:玉米叶色突变体遗传分析及基因定位and confirming the MuDR⁃inserted flanking sequences of maize.Cytology&Genetics,2017,51(2):142⁃148[13] Zavaleta⁃Mancera H A,Ortega⁃Ramíreza L G,Jiménez⁃Garcíaa LF,Sánchez⁃Viverosa G,Alarcóna A.Effect of arsenic on chloro⁃plast ultrastructure in Azolla filliculoides Lam.Microscopy andMicroanalysis,2016,22(S3):1206⁃1207[14] Arnon D I.Copper enzymes in isolated chloroplasts.polyphenolox⁃idase in beta vulgaris.Plant Physiology,1949,24(1):1⁃15 [15] Murray M G,Thompson W F.Rapid isolation of high molecularweight plant DNA.Nucleic Acids Research,1980,8(19):4321⁃4325[16] Santos F R,Pena S D,Epplen J T.Genetic and population studyof a Y⁃linked tetranucleotide repeat DNA polymorphism with asimple non⁃isotopic technique.Human Genetics,1993,90(6):655⁃656[17] Kanto T,Takehara T,Katayama K,Ito A,Mochizuki K,KuzushitaN,Tatsumi T,Sasaki Y,Kasahara A,Hayashi putationaland experimental analysis of microsatellites in rice(Oryza sativaL.):Frequency,length variation,transposon associations,andgenetic marker potential.Genome Research,2001,11(8):1441⁃1452[18] Wang L,Zhang Z,Wei L,Zhang D F,Teng F,Tao Y S,Zheng YL.The residual background genome from a donor within animproved line selected by marker⁃assisted selection:impact onphenotype and combining ability.Plant Breeding,2009,128(5):429⁃435[19] Lander E S,Botslein D.Mapping mendelian factors underlyingquantitative traits using RFLP linkage maps.Genetics,1989,121(1):185⁃199[20] 詹晶晶,邢文慧,田玉焕,范子洋,陶勇生.基于掖478导入系的玉米百粒重QTL鉴定.植物遗传资源学报,2015,16(5):955⁃960[21] Zhan J J,Wang F,Xing W,Liu J,Fan Z,Tao Y S.Fine mappingand candidate gene prediction of a major QTL for kernel numberper ear in maize.Molecular Breeding,2018,38(3):27.doi:org/10.1007/s11032⁃018⁃0787⁃0[22] Schürmann P,Buchanan B B.The ferredoxin/thioredoxin systemof oxygenic photosynthesis.Antioxidants&Redox Signaling,2008,10(7):1235⁃1274[23] Balmer Y,Koller A,Del V G,Manieri W,Schürmann P,BuchananB B.Proteomics gives insight into the regulatory function of chloro⁃plast thioredoxins.PNAS,2003,100(1):370⁃375 [24] Luo T,Fan T,Liu Y,Rothbart M,Yu J,Zhou S,Grimm B,LuoM.Thioredoxin redox regulates ATPase activity of magnesiumchelatase CHLI subunit and modulates redox⁃mediated signalingin tetrapyrrole biosynthesis and homeostasis of reactive oxygenspecies in pea plants.Plant Physiology,2012,159(1):118⁃130[25] Arsova B,Hoja U,Wimmelbacher M,Greiner E,Ustün S,MelzerM,Petersen K,Lein W,Börnke F.Plastidial thioredoxin z inter⁃acts with two fructokinase⁃like proteins in a thiol⁃dependent man⁃ner:evidence for an essential role in chloroplast development inArabidopsis and Nicotiana benthamiana.Plant Cell,2010,22(5):1498⁃15159021。
玉米ZmCIPK基因的克隆及表达分析
江苏农业科学 2014 年第 42 卷第 5 期
— 53 —
同源性分析发现，ZmCIPK 蛋白与高粱、谷子、水稻、大麦 中的 CIPK 蛋白高度同源，一致性为 76． 4% ～ 85% ，其中与高 粱 CIPK 蛋白的一致性达到 85% （ 图 3） 。
2． 2 ZmCIPK 基因的表达模式 为了分析 ZmCIPK 基因的功能，采用实时定量 PCＲ 方法
2 结果与分析
2． 1 ZmCIPK 基因的克隆及分析 根据拼接序列，设计 1 对引物，采用 ＲT － PCＲ 方法从玉
米叶片中克隆了 1 个 ZmCIPK 基因。ZmCIPK 全长 cDNA 长 1 748 bp，5' － 非编码（ UTＲ） 区长 115 bp，3' － UTＲ 长 508 bp， 编码区长 1 125 bp，编码 374 个氨基酸（ 图 1） 。ZmCIPK 推测 的氨基 酸 序 列 预 测 分 子 量 为 41． 72 ku，等 电 点 为 6． 96。 ZmCIPK 蛋白的 N 端区包含 1 个激酶结构域，在 C 端包含 1 个 CIPK 家族中保守的 NAF 调节结构域（ 图 2） 。
experimental conditions in practical molecular biology： isolation of
［10］雷开荣，石春焱，李明顺，等． 一种玉米叶片基因组 DNA 快速提
plant DNA［J］． Biochemistry and Molecular Biology Education，
收稿日期： 2014 － 01 － 07 基金项目： 淄博职业学院科技基金（ 编号： KJ13306） 。 作者简介： 徐俊华 （ 1968—） ，女，山东人，硕士，讲师，主要从事生物
突变体鉴定
作物突变体的细胞学研究一、突变体的初步观察和遗传分析在某品系材料A中发现一株突变体，将其命名为M，优先将M自交，得到具有突变性状的纯系，如果为不育等特殊性状则可以采取不断回交的方式得到相应纯系；再将M与A和另外一品系Y分别正交和反交，得到F1世代；将得到的F1自交得到各个的F2世代；将F1与M进行回交，分别得到对应的BC1世代；如果需要，还可以继续回交得BC2等世代。
观察M的突变性状在自交过程中是否始终存在，则能初步判别此突变性状是否为可遗传性状；分别统计M与A，M与Y的正反交的表型数据，分析所有正交与反交的差异，可以判别此性状是由核基因控制或者细胞质基因控制，甚至为核质互作控制；结合M自交过程中的突变性状的遗传特性和所有F1突变性状，可判别突变性状为隐性或显性；统计分析F2和BC1世代的突变表型数据，可判别控制突变性状为质量性状或者数量性状，以及质量性状中的的基因的对数。
在数据的分析过程中要充分应用生物统计的方法，如方差分析，Χ2检验等。
二、突变体的细胞学观察核型分析原理与步骤核型分析是指在一个物种内，对其染色体数目。
结构及其它特征进行描述性分析，从而对单一染色体进行初步分析的过程。
在突变基因确定为核基因后，则可以进行核型分析。
不同物种的染色体都有各自特定的形态结构（包括染色体的长度、着丝点位置、臂比、随体大小等）特征，而且这种形态特征是相对稳定的。
因此，染色体核型分析是植物遗传性研究的重要内容。
染色体核型分析主要包括染色体长度、染色体臂比、着丝点位置、次缢痕等。
染色体的长度差异有两种，一种是不同种、属间染色体组间相对应的染色体的绝对长度差异，一种是同一套染色体组内不同染色体的相对长度差异。
染色体数目以该植物的体细胞为准，计数30个以上染色体分散良好的细胞，85%以上的细胞中染色体数目稳定在一个数目上，则这个数就是该植物的染色体数。
染色体形态作为核型分析的染色体,一般以体细胞分裂中期的染色体作为基本形态。
新的玉米矮秆突变基因的鉴定与遗传分析的开题报告
新的玉米矮秆突变基因的鉴定与遗传分析的开题报告题目：新的玉米矮秆突变基因的鉴定与遗传分析一、研究背景和意义玉米（Zea mays L.）是一种重要的粮食作物，其高度的控制是影响产量的重要因素之一。
目前，玉米高度的控制主要通过育种方法实现。
然而，育种方法的效率低、时间长、成本高，因此需要寻找更为有效的方法。
突变体的发现对遗传研究和杂交育种具有重要的意义。
目前，已经发现了一些玉米矮秆突变体，如dwarf3、dwarf4、dwarf6和dwarf8等。
然而，这些矮秆基因的功能和调控机制远未完全明确。
因此，寻找新型的玉米矮秆突变基因并探究其遗传机制，将有助于深入了解植物生长和发育的调控机制，同时也具有很高的实用价值。
二、研究内容和方法1.研究内容本研究旨在寻找新的玉米矮秆突变基因并探究其遗传机制。
具体内容如下：（1）筛选矮秆突变体。
在玉米品种齐多303种子中，通过EMS处理、自交和选择，筛选出矮秆突变体。
（2）矮秆突变体的鉴定。
利用生长期、茎秆高度、穗位等性状对矮秆植株进行鉴定。
（3）基因定位和克隆。
利用分子标记和比较基因组学方法，对突变基因进行定位和克隆。
（4）基因功能分析。
利用基因表达和转基因技术，探究突变基因的功能和调控机制。
2.研究方法本研究采用以下方法：（1）材料准备：选择玉米品种齐多303，进行EMS处理。
（2）筛选矮秆突变体：选择外观健康、生长正常的幼苗，分别进行移栽、自交和选择。
（3）性状鉴定：测量矮秆突变体的生长期、茎秆高度、穗位等性状。
（4）分子标记：利用SSR和SNP等分子标记对突变基因进行定位。
（5）基因克隆：利用TALEN、CRISPR/Cas等技术对突变基因进行克隆。
（6）基因功能分析：利用Northern blot、Western blot和RT-PCR等技术，对突变基因进行表达和定量分析。
同时，利用转基因技术研究突变基因在玉米中的生物学功能。
三、预期结果本研究将寻找到新的玉米矮秆突变基因，并确定其遗传机制。
玉米矮杆突变体的筛选与候选基因鉴定
在 第 9 号 染 色 体 bin9.03〜bin9.04区间内;伙在第 1 0 染 色 体 上 。在 Maize GDB上公布的玉米半矮
收 稿 日 期 ：2 0 1 9 - 0 3 - M ; 接 受 日 期 ：2019-03-13 基 金 项 目 ：国家转基因生物新品种培育重大专项（2〇16ZX〇8〇0 3 0 0 2 ) ;中国农业科学院创新工程项目。 联系方式:王文秀 E-mail:wenbrwang@ ; * 通 信 作 者 王 磊 E-mail:wanglei01@
玉米不仅可作为粮食和饲料，同时还是重要 的工业原料m ，已成为我国种植面积最大的农作 物 。株高对玉米的种植密度、抗倒伏性、群体通透 性及光合利用率都有重要的影响，因此合理的株 高 是 影 响 玉 米 高 产 与 稳 产 的 一 个 重 要 因 素 ，筛选 合理株型是提高玉米单产的重要途径。
目前，在 Maize GDB ( h ttp s://www.maizegdb.
中国农业科技导报，2019, 21( 11) :27-34 Journal of Agricultural Science and Technology
玉米矮杆突变体的筛选与候选基因鉴定
王文秀， 郑红艳， 徐妙云， 邹俊杰， 张兰， 王磊*
(中国农业科学院生物技术研究所，北 京 100081)
摘 要:挖掘矮杆基因对玉米耐密植品种选育具有重要意义。利 用 甲 基 磺 酸 乙 酯 （EMS)诱 变 郑 5 8 自交系获
变 体 构 建 了 匕 分 离 群 体 ，采 取 B S R 高 通 量 测 序 结 合 生 物 信 息 学 分 析 ，获 得 了 多 个 玉 米 矮 杆 突 变 体 的 候 选 基
玉米Mutator转座子系统的应用及展望
玉米Mutator转座子系统的应用及展望高志勇;谢恒星;李吉锋;刘史力【摘要】The transposon tagging is a very effective molecular biology technology developed in recent years.It causes gene mutation through TEs insertion into the genomes of higher plants , and then the mutanted genes can be cloned by isolating the flanking sequence of TEs .This strategy is very useful in the study of the functional genomics of higher plants .The main systems of maize transposon are En/Spm, Ac/Ds and Mutator ones.Among them, the Mutator transposon was prone to inserting within or around the gene ; the positive mu-tation frequency was 10-5 ～10 -4 , which was nearly 30 times higher than that of the wild corn; and most of the mutations were recessive.The mutation can also be cloned by TAIL -PCR.Now by this method, some important genes have been cloned.In this paper, we mainly introduced the application of Mutator system, and discussed the research prospect of Mutator transposon system.%转座子标签法是近年来发展起来的一种非常有效的分子生物技术,是一种利用TEs插入高等植物基因组中造成基因突变,然后通过分离TEs插入的旁邻序列,克隆出突变基因的策略.这种策略在高等植物的功能基因组学研究中十分有用.玉米转座子系统主要有En/Spm系统、Ac/Ds系统和Mutator系统三大类.其中Mutator转座子易于插入到基因内部及基因周围,引起的正向突变频率为10-5～10-4,比野生玉米高出近30倍,所引起的突变大部分为隐性突变.由Mutator转座子引起的突变,可以通过TAIL-PCR的方法,对相关的突变基因进行克隆.当前通过这种方法,已经克隆出一些重要的基因.本文主要介绍了Mutator转座子的应用,并对Mutator转座子系统的研究前景进行了展望.【期刊名称】《山东农业科学》【年(卷),期】2018(050)005【总页数】5页(P168-172)【关键词】玉米;Mutator转座子;应用;展望【作者】高志勇;谢恒星;李吉锋;刘史力【作者单位】渭南师范学院化学与环境学院,陕西渭南 714099;陕西省河流湿地生态与环境重点实验室,陕西渭南 714099;渭南师范学院化学与环境学院,陕西渭南714099;陕西省河流湿地生态与环境重点实验室,陕西渭南 714099;渭南师范学院化学与环境学院,陕西渭南 714099;陕西省河流湿地生态与环境重点实验室,陕西渭南 714099;渭南师范学院化学与环境学院,陕西渭南 714099【正文语种】中文【中图分类】S513.035.31951年，McClintock发现了玉米中的控制元件，后被命名为转座元件或转座子(transposon)，在化学本质上，转座子是基因组中的一段DNA序列[1]。
玉米蛋白激酶基因ZmCIPK的序列及表达特性分析
ｔ ｎｏ ｅＣ Ｌ ｉｔｒｃｉｇｐｏｅｎｋｎ ｓ ｒｍ ｉ ＺｍＣ Ｐ ．Ｆ ｏ ｔｅｒｓ ｌ ｏ ｅ ｕ ｎ ｅ ａ ａｙ ｉ ｆｔ Ｂ － ｅａ ｔ ｒｔｉ ｉａｅｆｏ ｍａｚ ｏ ｈ ｎ ｎ ｅ（ Ｉ Ｋ） ｒｍ ｈ ｅ ｕｔ ｆｓｑ ｅ ｃ ｎ ｌ－
ｓｓ，ｉ ｉ ｐｅ ｕｌｔｄ ｔ ａ ， ＡＹ １ ４ ９， ＥＵ９ ４ ９ ｎｄ ＥＵ９ ８ ４１ ｌ ｂｅｏ ｇ ｔ ＰＫ ｒ ｔｉ ａ ｌ ． ｉ ｔ ｓｓ ｃ ａｅ ｈ ｔ ０ ８１ ７ ２ ０ ａ ６ ４ ａ ｌ ｌｎ ｏ ＣＩ ｐ ｏｅ ｎ ｆｍｉｙ Ｓ ｍｉｑ ｎ ｉ ｔ ｅ ＲＴ－ ｅ － ｕａ ｔｔ ｉ ａ ｖ ＰＣＲ ｎ ｌｓｓｉ ｄ ｃ ｔｄ ｔ ａ ， ｍａｚ ｅ ｅ ＡＹ ０ ９，ＥＵ９ ４ ９ ｎ ａ ａｙ ｉ ｎ ｉａ ｅ ｈ ｔ ｉｅ ｇ ｎ １ ４８１ ７ ２ ０ ａ ｄ ＥＵ９ ８ ６ ４４１
ｃ ｎ ｂ ａ ｉ ｌ ｎ ｃ ｄ ｂ Ｃ１ａ ｄ ＡＢＡ ． ａ ｅ ｒ ｐ ｄ ｙ ｉｄｕ ｅ ｙ Ｎａ ｎ
Ｋ ｅ ｒ ｓ： ｉｅ； ｙ ｗｏ ｄ ｍａｚ ＺｍＣＩ ＰＫ ； ｘ ｒ ｓ ｉｎ ｃ ｒ ｃｅ ｉｔｃ；ｅ ｕ ｎ ｅ ａ ａｙ ｉ ； ｅ ｉｑ ａ ｔ ａｉ ｅ ＲＴ－ ＣＲ ｅ ｐ ｅ ｓｏ ｈａａ ｔｒｓｉ ｓ ｑ ｅ ｃ ｎ ｌｓｓ ｓ ｍ — ｕ ｎ ｉ ｔｖ ｔ Ｐ
２ ５个 ＣＰ 水 稻 中有 ３ ＩＫ， Ｏ个 ＣＰ ； 米 中发 现 ＩＫ¨ 玉
了 一 种 水 分 胁 迫 诱 导 基 因 Ｚ ＣＰ ； 豆 中 已 ｍ ＩＫ１ 豌
克 隆得 到 了 Ｐ ＣＰ 基 因 ３； 生 胡 杨 （ ｏｕｕ ｓ ＩＫ １ 盐 ］ Ｐｐｌ ｓ
ｅｐ ｒｔ ａ ｕｈａｉ ）中 克 隆 得 到 了 Ｐ Ｓ Ｓ ¨ ｃ ＥＯ １ ．在 所 有
导的玉米突变体库的构建及表型评价
2. 从 146 个突变体的自交果穗上随机选取子粒，按穗行种植，统计可以遗传的 突变家系和回复突变频率，结果表明可遗传的突变家系有 129 个家系，遗传的性状有 以下 7 种表型变异：叶片红色条纹、叶片白色条纹、叶片黄色条纹、叶片裂生、叶片 卷生、叶脉红色和叶片皱缩，回复突变频率为 11.64%。
随机选取 M2 单株进行自交，得到 M3 果穗 3256 个，并统计果穗表型突变，突变 频率为 0.37%，M3 果穗花斑子粒数目占子粒数目的比例约为 4.7%。表现突变性状的 单株自交保种。
学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址：
电话： 邮编：
Mutator 转座子介导的玉米插入突变体库的构建及表型评价
1 引言
玉米(Zea mays L.)是当今世界最重要的粮食作物之一，也是重要的饲料和工业原 料作物，随着全球经济发展，对玉米的需求量持续增长，玉米在我国国民经济发展中 占有十分重要的地位。除了具有较高的经济意义，玉米也是很好的遗传研究材料。1947 年，McClintock在玉米中首先发现了一些具有转座能力的因子，能导致玉米基因组重 拍，把这种具有转座能力的因子叫做转座子[1]。转座子作为一种获得插入诱变的遗传 突变体和分离基因、研究功能的有效工具, 越来越受到广泛重视。
玉米Mu转座子插入突变体的筛选和穗行数相关基因片段的克隆的开题报告
玉米Mu转座子插入突变体的筛选和穗行数相关基因片段
的克隆的开题报告
研究背景：
玉米是全球重要的粮食作物之一，其品种改良是农业科技发展的重要方向。
转基因技术是现代分子生物学研究的重要手段之一，可以在短时间内通过基因工程手段构
建玉米的新品种，改善作物的产量、抗病能力等性状。
然而，随着转基因技术的发展，转基因作物的安全性、环境影响等问题也不断被提出，因此对转基因作物的相关问题
进行深入研究具有重要意义。
研究目的：
本研究通过将Mu转座子插入突变体导入玉米中实现基因的乱序插入，从而筛选出与穗行数相关的基因片段，并对其进行克隆和进一步深入研究，为玉米的品种改良
提供新的基础。
研究方法：
1.构建Mu转座子插入突变体向玉米中导入的基因片段；
2.通过筛选出穗行数的变异体，并对其进行测序，寻找与穗行数相关的基因片段；
3.对筛选出的基因片段进行PCR扩增和克隆，纯化重组质粒；
4.对克隆得到的基因片段进行基础研究，分析其功能和调控机制。
预期结果：
本研究预计能够筛选出与穗行数相关的基因片段，并对其进行克隆和深入研究，为玉米的品种改良提供新的基础。
通过本研究的开展，可以揭示玉米发育过程中与穗
行数相关的基因及其调控机制，为今后的玉米品种改良工作提供有力的支持。
中科院植生所巫永睿课题组通过测定非法重组频率挖掘优质蛋白玉米修饰基因
中科院植生所巫永睿课题组通过测定非法重组频率挖掘优质蛋白玉米修饰基因2019年12月10日，中国科学院分子植物科学卓越创新中心/植物生理生态研究所巫永睿课题组团队在Communications Biology 杂志上在线发表题为High frequency DNA rearrangement at qγ27 creates a novel allele for Quality Protein Maize breeding 的研究文章。
优质蛋白玉米胚乳修饰因子qγ27位点结构高度不稳定，该团队通过巧妙遗传设计深入解析了该位点发生非法重组的频率及基因重排的分子遗传机制。
基因拷贝数变异（Copy Number Variation, CNV）是驱动物种基因组动态变化的主要动力之一。
CNV可由基因复制，缺失及插入引起，它可直接导致基因表达的剂量差异，引起种内个体间表型不同程度的变异，或者新拷贝发生新的变异，从而演化出不同于原始拷贝的表达模式，甚至进化出新的功能。
人类基因组有3000 Mbp，4.8-9.5%是由CNV贡献的，在群体多态性形成中扮演重要作用。
玉米基因组有2200 Mbp, 大量基因存在基因复制，而CNV是影响不同自交系间表型差异的主要来源之一。
CNV主要通过基因同源重组发生。
在减数分裂时，如果同源染色体上的不同基因拷贝发生完全等位配对，任何染色体交换（crossover）都不会引起CNV；如果不同基因拷贝之间发生了非等位配对，这个区间的染色体交换就会导致基因重排：一条染色体失去一个或多个拷贝，另外一条得到相应数量的拷贝，这称之为非法重组。
正常的同源重组频率很容易通过发生交换两侧的标记算出，然而非法重组的频率很少有直接通过遗传学实验精确测定的报道。
30年前，美国罗格斯大学Joachim Messing实验室发现玉米27-kDa γ-醇溶蛋白编码基因（γ27）在不同玉米自交系间存在拷贝数变异，有些自交系含有两个拷贝，有些只含有一个。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
玉米ZmCIPK23基因Mutator插入突变体的鉴定陈果;陈勋基;李建平;郝晓燕;常晓春;足木热木;郑军;黄全生【摘要】[目的]玉米ZmCIPK23基因的候选突变体连续与玉米自交系B73回交并自交,最终得到以B73为背景的纯合突变体,为研究该基因的功能奠定材料基础.[方法]从玉米Mutator(Mu)突变体库中定向筛选到玉米ZmCIPK23基因的候选突变体.在田间种植候选突变体,利用巢式PCR对这些后代植株进行鉴定,选择阳性植株与B73杂交.通过连续的回交及自交,最终获得该基因的纯合突变体.[结果]通过PCR 鉴定,获得了以B73为背景的ZmCIPK23基因纯合的突变体zmcipk23.[结论]获得了玉米ZmCIPK23基因的Mu插入的纯合突变体zmcipk23,为研究该基因的功能奠定了基础.%[Objective] The candidate mutants of maize ZmCIPK23 gene were continuously backcrossed and self-pollinated with B73 in fields, and finally homozygous mutants with B73 background were obtained, which laid the material foundation for studying the function of thisgene.[Method]The candidate mutants of ZmCIPK23 were screened from a maize Mutant library.They were planted and analyzed by nested PCR.The positive plants with Mu-insertion in the ZmCIPK23 gene were self-pollinated and backcrossed with B73 in the field.Thus the homozygous mutants were obtained.[Result]The homozygous mutant of ZmCIPK23 gene was obtained by PCR.[Conclusion]The homozygous mutant (zmcipk23) of Mu insertion of ZmCIPK23 gene was obtained.This study has provided a foundation for the functional analysis of the ZmCIPK23 gene.【期刊名称】《新疆农业科学》【年(卷),期】2017(054)007【总页数】6页(P1185-1190)【关键词】玉米;Mutator转座子;ZmCIPK23;突变体【作者】陈果;陈勋基;李建平;郝晓燕;常晓春;足木热木;郑军;黄全生【作者单位】新疆农业科学院核技术生物技术研究所,乌鲁木齐 830091;新疆农业科学院核技术生物技术研究所,乌鲁木齐 830091;新疆农业科学院核技术生物技术研究所,乌鲁木齐 830091;新疆农业科学院核技术生物技术研究所,乌鲁木齐830091;新疆农业科学院核技术生物技术研究所,乌鲁木齐 830091;新疆农业科学院核技术生物技术研究所,乌鲁木齐 830091;中国农业科学院作物科学研究所,北京100081;新疆农业科学院核技术生物技术研究所,乌鲁木齐 830091【正文语种】中文【中图分类】S513【研究意义】类钙调磷酸酶B互作蛋白激酶(CIPK)是植物所特有的一类蛋白激酶，在植物逆境如干旱﹑高盐应答等非生物胁迫反应中起着重要的作用，而在重要农作物玉米中CIPK基因的功能研究还非常少。
研究从反向遗传学角度出发，利用玉米Mutator转座子，定向筛选ZmCIPK23基因Mu插入的突变体。
通过PCR等鉴定方法，最终获得玉米ZmCIPK23基因的纯合突变体，为研究该基因在逆境胁迫下的功能奠定基础。
【前人研究进展】Mutator转座子在玉米功能基因组学及突变体库构建中起着非常重要的作用，利用该转座子构建了许多玉米突变体库[1]。
随着Mutator突变体库的建立，许多方法如热不对称交错PCR(TAIL-PCR)、酶切-连接-扩增(DLA)等先后用于检测Mu转座子插入位点[2, 3]。
已有研究报道，利用Mutator转座子，鉴定了5个对干旱胁迫响应的玉米蛋白磷酸酶基因[4]。
类钙调磷酸酶B互作蛋白激酶(CIPK)是植物所特有的一类蛋白激酶，该基因家族在植物非生物逆境胁迫中发挥着重要的作用。
在拟南芥中，CIPK23能够磷酸化K+转运蛋白AKT1，从而在低钾胁迫下，植株能够正常生长发育[5](Xu, 2006#2440;Ragel, 2015 #2439)。
在玉米中，对CIPK基因的功能报道有限。
ZmCIPK16受ABA、干旱、NaCl等诱导表达；ZmCIPK16过表达后能部分消除拟南芥sos2突变体对盐敏感的表型[6]。
过表达的玉米ZmCIPK21能降低转基因拟南芥中Na+的含量，增强转基因拟南芥耐盐性；并且该基因过表达后，能够互补拟南芥突变体cipk1-2[7]。
在玉米基因组中，分布着至少43个CIPK基因[8]，然而其参与的调控通路，尤其在非生物胁迫逆境中的调控途径却知之甚少，并且在玉米功能基因组学研究中，利用Mutator转座子研究CIPK基因的功能还未见报道。
【本研究切入点】玉米基因组中至少有43个CIPK基因，然而迄今为止，只有极少数的基因有功能研究报道，并且还是借助模式植物拟南芥，通过异源表达的方式进行的。
而直接在玉米基因组中研究其功能还未见报道。
研究利用玉米Mutator转座子以及PCR鉴定的方法，在玉米中鉴定并得到ZmCIPK23基因的纯合突变体，期望为该基因的功能研究奠定基础。
【拟解决的关键问题】获得可稳定遗传并纯合的ZmCIPK23基因突变体，为研究该基因在逆境胁迫下的功能奠定基础。
1.1 材料玉米ZmCIPK23基因Mu插入的候选突变体材料，回交受体材料为自交系B73。
1.2 方法1.2.1 玉米ZmCIPK23基因候选突变体材料的种植及回交将ZmCIPK23基因候选突变体材料和自交系B73分别种植于安宁渠试验场，每个材料种植3行，每行定苗15株。
行长3 m，行距60 cm，株距20 cm。
待玉米长至5～6叶，单株提取玉米叶片基因组DNA，用于PCR鉴定。
鉴定完成后，保留含有Mu因子的玉米植株，并与B73回交。
以此方法类推，直到与B73回交5代后，并自交2代，得到BC5F2代候选突变体材料。
此时对候选突变体进行基因型鉴定，保留阳性植株，自交授粉得到BC5F3代材料，用于基因型鉴定，确定所得到BC5F3代材料为ZmCIPK23基因纯合突变体材料。
1.2.2 玉米叶片基因组DNA提取玉米叶片DNA提取采用CTAB法。
2%CTAB提取液的配制：4 g CTAB、16.4 g NaCl、8 mL 0.5 M EDTA(pH=8.0)、20 mLTris.HCL(pH=8.0)溶于150 mL蒸馏水中，定容至200 mL。
所提取的DNA稀释至大约50 μg/uL，用于PCR鉴定。
1.2.3 引物设计Mu-TIR引物根据Mutator末端反向重复序列设计Mu-TIR-AGA GAA GCC AAC GCC A(AT)C GCC TC(CT) ATT TCG TC[3]。
ZmCIPK23基因的特异引物采用primer3.0在线软件设计(http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/)。
在ZmCIPK23基因5’端设计引物ZmCIPK23-GS5’-ACCCTGCGACAAGAAGAGGT，在ZmCIPK23基因3’端设计特异引物ZmCIPK23-GS3’-GACGAGCTCCATGACGATGTA和巢式引物ZmCIPK23-GS3N-GGTCGAGATCTCTCGCTTGAT。
图11.2.4 ZmCIPK23基因候选突变体材料的PCR鉴定及Mu插入位点的确定以ZmCIPK23基因候选突变体材料的基因组DNA为模板，用Mu-TIR作为上游引物，基因特异性引物ZmCIPK23-GS3’和巢式引物ZmCIPK23-GS3N分别作为下游引物，PCR扩增含有Mu序列的目的基因片段。
PCR反应程序为94℃ 3 min；94℃ 30 S，58℃ 30 S，72℃ 45 S，循环35次；72℃延伸7 min。
电泳检测PCR产物，若能扩增出预期大小的目的条带，且巢式PCR的条带差异也为预期值，可判断为Mu插入的阳性植株。
用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(北京全式金生物技术有限公司)回收ZmCIPK23基因片段，将回收片段连接到pGWC-T载体上，转化大肠杆菌DH5a。
选取阳性单克隆菌落送北京华大基因公司测序，测序结果用DNAMAN软件分析，与该基因的基因组序列比对，确定Mu插入到该基因的具体位置。
基因片段的回收参照回收试剂盒说明进行。
1.2.5 Mu转座子插入ZmCIPK23基因纯合突变体的鉴定种植BC5F2代植株，每一份BC5F2材料种植15株，PCR鉴定每株Mu插入位点的基因型。
以每一单株DNA为模板，用引物组合Mu-TIR与ZmCIPK23-GS3'，Mu-TIR与ZmCIPK23-GS3N分别扩增含有Mu序列的ZmCIPK23基因；引物组合ZmCIPK23-GS5’与ZmCIPK23-GS3'，ZmCIPK23-GS5’与ZmCIPK23-GS3N 分别扩增不含有Mu序列的ZmCIPK23基因。
根据PCR扩增结果，鉴定每一株Mu插入位点的基因型。
如果Mu-TIR与ZmCIPK23-GS3'，Mu-TIR与ZmCIPK23-GS3N扩增出含有Mu序列的ZmCIPK23基因，而ZmCIPK23-GS5’与ZmCIPK23-GS3'，ZmCIPK23-GS5’与ZmCIPK23-GS3N不能扩增出不含有Mu序列的ZmCIPK23基因，则该单株为Mu插入的纯合体。
对鉴定为纯合体的植株自交，得到BC5F3代种子。
进一步，对BC5F3代的同一插入株系，随机选取10粒种子种于温室内，单株提取DNA，采用以上引物组合进行PCR鉴定，若PCR鉴定其全部为Mu插入纯合体，则可以确定已获得可遗传的纯合Mu插入纯合突变体。
PCR反应程序为94℃ 3 min；94℃ 30 S，58℃ 30 S，72℃ 45 S，循环35次；72℃延伸7 min。