冬虫夏草虫草素的提取及提取量的测定

冬虫夏草虫草素的提取及提取量的测定

刘栓栓;孙庆元;宫宏琨

【摘要】研究了冬虫夏草虫草素的提取和测定方法,确定了提取冬虫夏草菌株qsun-1菌丝体与甲醇料液比、虫草素的溶剂、超声波细胞破碎的功率和时间.依据单因素和正交试验提出了提取虫草素的最佳工艺:在菌丝体与甲醇料液比(g/mL)为1∶100、超声波功率为300 W条件下,超声波细胞破碎提取30 min,虫草素提取量可达9.275 mg/g.这些因素对提取虫草素的影响重要性排序为料液比＞溶剂＞超声波功率＞提取时间.717强碱性阴离子交换树脂纯化虫草素提取液,虫草素得率高达80％以上,纯度可达到14.200 mg/L.

【期刊名称】《大连工业大学学报》

【年(卷),期】2013(032)005

【总页数】5页(P320-324)

【关键词】虫草素;超声波提取;紫外分光光度法

【作者】刘栓栓;孙庆元;宫宏琨

【作者单位】大连工业大学生物工程学院,辽宁大连 116034;大连工业大学生物工程学院,辽宁大连 116034;大连工业大学生物工程学院,辽宁大连 116034

【正文语种】中文

【中图分类】TS218;Q939.93

0 引言

冬虫夏草为麦角菌科真菌冬虫夏草菌(Cordyceps sinensis(Berk.)Sacc.)寄生在蝙

蝠蛾科昆虫蝙蝠蛾(Hepialus armoricanus Oberthur)越冬幼虫上的子座及幼虫尸体的复合体。虫草素(cordycepin)是冬虫夏草菌中的活性成分。虫草素的结构与腺苷非常相似,所以又称为3′-脱氧腺苷,也是第一个从真菌中分离出来的核苷类抗菌

素[1-2],具有抗肿瘤[3]、抗菌抗病毒[4]、免疫调节、清除自由基[5]等多种药理作用。最早由Cunningham[6]等于1951年在Cordycepsmilitaris Link原浆液中

分离获得,该物质被证实为我国中药冬虫夏草的有效成分,是虫草特有的功能成分。

目前从蛹虫草中提取和纯化虫草素比较常见。对于虫草素的提取一般采用微波提取[7]、超声波提取[8]、回流[9]、索氏提取[10]、浸提等方法。虫草素的检测的方法也很多,例如高效液相色谱[11]、毛细管电泳[12]、紫外[13]等方法。然而,方法简单、操作较易、成本低廉的虫草素提取和测定方法报道不多,特别是关于超声波细

胞破碎提取方法条件的研究较少。因此,本试验采用超声波细胞破碎法进行提取,进

行了虫草素提取条件的分析和优化,并通过紫外分光光度法分析测定虫草素的含量。

1 试验材料

1.1 原料

无性型虫草qsun-1菌株[14],采集自四川省阿坝藏族羌族自治州黑水县,经分离纯

化后冰箱4 ℃保存。

1.2 试剂

虫草素(高纯试剂),中国药品生物制品鉴定所；甲醇、无水乙醇,山东禹王实业有限

公司化工分公司；717强碱性阴离子交换树脂,国药集团化学试剂有限公司；其他

试剂均为分析纯。

1.3 培养基

1%牛肉粉PDA培养基(g/L):马铃薯200(煮沸30 min,过滤取汁),葡萄糖20,牛肉粉10,维生素B1 0.1,KH2PO4 1,MgSO4 1,琼脂 20,pH 6.0,用于菌种的活化。

液体发酵培养基(g/L):葡萄糖20,牛肉粉10,维生素B1 0.1,KH2PO4 1,MgSO4 1,琼脂 20,pH 6.0,用于菌种的发酵。

2 方法

2.1 培养方法

菌种活化:将接种后的PDA平板培养基18 ℃ 培养7 d。

种子液:虫草菌株qsun-1接种在1%牛肉粉PDA液体培养基中,于18 ℃、120

r/min振荡培养3 d。

菌种发酵培养:在250 mL三角瓶中装入100 mL 发酵培养基,并将培养好的种子液按5%的接种量接种到发酵培养基中,于18 ℃、120 r/min振荡培养5～7 d。2.2 虫草菌株样品制备

取出在摇床培养好的虫草qsun-1菌株发酵液。3 000 r/min离心10 min。弃去上清液,将剩下的固体虫草菌丝体充分洗涤、抽滤,置于60 ℃烘箱烘干、粉碎,称干重。

2.3 虫草素提取的条件优化

2.3.1 超声波冰浴条件准备

在250 mL烧杯中装入2/3的冰块,在冰块中挖出可放进50 mL烧杯的空间,然后盖上泡沫环,放入小烧杯[15]。

2.3.2 单因素试验

精确称取0.145 0 g虫草菌丝体,于超声波细胞粉碎机中按提取基本条件(400 W、5 s、5 s)破碎提取20 min,分别考察提取溶剂、超声波功率、超声波提取时间、料液比对虫草素提取的影响。

其中要考察的试验条件具体为提取溶剂:蒸馏水、甲醇、无水乙醇；超声波功率:100、200、300、400、500、600 W；超声波提取时间:10、15、20、25、30、35 min；料液比(g/mL):1∶100、1∶130、1∶160、1∶190、1∶220、

1∶250。

2.3.3 正交试验

在单因素试验基础上,通过正交试验进一步考察提取溶剂、超声波功率、提取时间和料液比之间的相互影响,并确定超声波细胞破碎提取冬虫夏草菌丝体中虫草素的最佳工艺参数。

2.4 分析检测方法

2.4.1 紫外分光光度法检测虫草素含量

精密称取5 mg虫草素标准品,分别配制0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg/L的虫草素溶液,紫外分光光度法测量吸光度,并以吸光度(Y)对虫草素的质量浓度(X)进行线性回归,得虫草素的回归方程为:Y=0.061 23X+0.013 1,R=0.997 9。

2.4.2 虫草素提取量的计算

虫草素提取量=虫草素质量浓度×稀释体积/冬虫夏草菌丝体质量。

2.5 样品纯化

将超声波细胞破碎提取法最佳工艺提取的样液,分别量取1、2、3 mL各3份,同样条件下9份样液分别经717强碱性阴离子树脂纯化,紫外分光光度法检测虫草素提取量,计算虫草素纯化洗脱得率和纯度。

3 结果与分析

3.1 冬虫夏草虫草素的定性检测

将提取样在紫外分光光度计100～500 nm波长范围内扫描,结果如图1所示。图1 虫草素紫外光谱扫描曲线Fig.1 UV absorption spectra of cordycepin sample

由图1可知,样品在259 nm处有最大吸收峰,虫草素吸收光谱在259 nm[16],可判定样品中含有虫草素。

3.2 虫草素提取条件的确定优化