狂犬病毒致病机理：基于灭活及减毒疫苗免疫的发现

(此文是一篇专业论文的全文翻译，本来是作内部参考用，但因很多网友关心这方面的问题，而在网上对相关问题常有过时或错误的观点流传，所以在此全文发布，供感兴趣的网友参考。

因主要是供本专业人员阅读的文献，对其他专业或一般读者，其中有些内容可能不易理解，可先只看摘要。

我们以后争取能有时间作一些简化的解读。

)摘要虽然狂犬病疫苗的应用已经有一个多世纪的历史，但是狂犬病疫苗通过免疫接种或天然感染后引起机体免疫应答的具体机制仍不太清楚。

本研究通过减少灭活和减毒活疫苗剂量，分别采用常规、提前或延迟的处治方案来比较所产生的不同保护效果。

分别对2月龄叙利亚地鼠、4周龄ICR小鼠或成年猕猴接种犬狂犬病毒（RV）变种。

在暴露后6小时、1、2、3、4、5、6和7天开始处治。

应用单剂或多剂灭活疫苗（HDCV）、反向遗传技术构建的减毒活疫苗或γ射线灭活的ERAG333疫苗进行肌肉接种。

对病毒在这些啮齿类动物模型中的传播动力学进行监测。

结果发现，RV在感染4天后播散到脊髓，6天到达脑部。

在暴露后迟至5－6天才接种ERAG333活疫苗的地鼠全部死亡。

而在6小时、1、2、3和4天分别接种一个剂量的ERAG333活疫苗的存活率分别是78%，44%，56%，22%和22%。

与此相似，在暴露后24小时接种灭活ERAG333疫苗，地鼠存活率是67%。

如果标准预防方案――埃森(Essen)方案推迟3-6天才执行，则所有的地鼠全部死亡，而暴露后1-2天即开始进行预防的地鼠的存活率分别是67%和33%。

猕猴在暴露后24小时接种一剂减毒的ERAG333疫苗即可获得保护力。

即使预防延迟，高度减毒（活的）和灭活的ERAG333疫苗也可诱导强有力的保护性免疫反应。

按照埃森方案，采用2-5剂商品疫苗和人狂犬病免疫球蛋白（HRIG）进行预防，实验动物的存活率可达89-100%。

经缩减的疫苗接种程序仍可以提供有效的预防，接种疫苗的剂量总数不影响结果。

1. 引言狂犬病一旦发病就会致命，但是如果能够尽早采取适当的暴露后预防（PEP），完全可以避免疾病发生。

到目前为止，还没有单独的任何一种药物具有特异性的治疗效果，但是联合采用不同生物制剂的治疗方案可发挥协同作用，已成功地应用于实验性治疗。

目前，PEP仍是在暴露后唯一有效的预防人类狂犬病的方法。

现代的PEP主要包括被动免疫和主动免疫，被动免疫是早期输入针对狂犬病毒（RV）的中和性抗体，这些抗体是由病毒的有效成分刺激产生的；而经诱导产生的主动免疫则可进一步清除外周组织的病毒。

在接种的疫苗能产生主动免疫应答之前，被动输入免疫球蛋白所提供的病毒中和抗体(VNAs)可以填补机体抵抗力暂时的空缺，这是PEP的一个重要组成部分，特别是对于严重的暴露。

以往的实验表明，体液免疫对清除外周RV作用很大，而细胞免疫应答则作用有限。

PEP一方面可以快速诱导免疫应答，还可以使机体产生持续的免疫记忆，这是PEP的另一个重要作用。

在过去的一个世纪中，狂犬病疫苗生产所用的基质、减毒和灭活的水平和方式，以及接种途径都发生了巨大变化。

同时，由于疫苗免疫原性、有效性和安全性的提高，PEP经肌肉途径接种疫苗的剂量从原来的21剂以上逐渐减少到现在的4剂。

关于未来的疫苗产品，亚单位、DNA和重组活疫苗都正处在实验评估阶段。

尽管狂犬病生物制品的生产在全球已得到改进，对狂犬疫苗的免疫原性和有效性的认识也在不断进步，但其实际应用仍受到经济和技术的制约。

在21世纪，某些国家仍在生产神经组织疫苗，并用作暴露于疯动物后唯一的预防手段。

而且，尽管针对狂犬病的成功的疫苗接种已有一个多世纪的历史，但在自然感染或接种灭活或减毒活疫苗所引起早期的细胞和体液免疫的分子机制仍不清楚。

本研究目的是在不同动物模型中，对各种灭活和减毒狂犬病疫苗及PEP程序的预防效果进行实验比较。

2.材料与方法2.1.动物与病毒2 月龄雌性叙利亚地鼠（金仓鼠）、4 周龄雌性ICR小鼠，在实验前至少观察72小时。

1 岁龄雌性猕猴，实验前至少经2 个月检疫。

为了便于对比，选用两种不同的犬街毒株作为攻击毒株。

其中一株滴度为10(2.5 次方)MICLD50/50μl，分离自德克萨斯州一只自然感染狗的唾液腺；另一株滴度为10(2次方)MICLD50/50μl，分离自墨西哥一只自然感染狗的唾液腺。

所有的实验动物的处理及实验程序都是符合疾病预防与控制中心关于动物管理和操作委员会的指导方针。

2.2.生物制品对于啮齿类动物，根据实验设计方案一次性接种最低效价为2.5 IU/ml的50μl （非人灵长类动物1ml）HDCV ，Imovax®(sanofi pasteur)或50μl 纯化的鸡胚疫苗(PCEC)，Rabavert (Novartis)。

同样地，对于啮齿类动物，根据PEP的原则，在相应部位肌肉注射50μl未经稀释的HRIG，HyperRabtm S/D (Talecris Biotherapeutics, 150 IU/ml)或Imogam®Rabies-HT (sanofi pasteur, 150 IU/ml) 。

减毒疫苗ERAG333（通过定点突变的方法将病毒G蛋白333位点的精氨酸突变为谷氨酸）和ERA2G333（含有两个G基因，333位点都突变）通过反向遗传系统构建。

ERAG333株显示出高度的安全性，对3 周龄的成年小鼠及其他目标或非目标物种均无致病性，甚至经颅内注射也是如此。

经γ 射线灭活的ERAG333株，将灭活病毒样品在鼠神经瘤细胞（MNA）中连续传3代以验证完全灭活的病毒。

将减毒或灭活的ERAG333株50μl (10(9次方) TCID50/ml)肌肉接种于仓鼠或小鼠右腓肠肌或接种1ml于猕猴三角肌(10(9次方) TCID50/ml)。

2.3. 实验方法2.3.1.直接荧光抗体试验(DFA)采用异硫氰酸荧光素标记的单克隆抗体检测脑组织样本中的狂犬病毒抗原。

2.3.2 .逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)及半嵌套式RT-PCR (hnRT-PCR)采用RT-PCR和hnRT-PCR方法追踪检测RV从地鼠的接种部位到达脑部的过程。

采集腰部、胸部脊髓及脑部切片组织，应用无菌技术以防止交叉污染，按照TRIzol Reagent（Invitrogen）说明书进行操作提取组织总RNA。

逆转录的引物为1066fw （5’ GAG AGA AGA TTC TTC AGG GA 3’ ），引物根据RV PV 株基因组（登录号M13215）1136nt–1155nt处的序列设计，反应条件为42℃90 min。

第一次PCR采用引物1066fw和304rv（3’TTG ACA AAG ATC TTG CTC AT 5’）扩增病毒基因组从304nt–1066nt的一段序列。

另设计两条引物通过hnRT-PCR 检测微量的病毒RNA：(a) 1087fw (5’ GAG AAR GAA CTT CAR GA3'，1087–1104) 和304rv；(b) 504sfw（5’TCA TGA TGA ATG GAG GT 3’ ，504–521）和304rv。

两次PCR反应条件一致：94 ◦C预变性1 min，40 个循环：94 ◦C 30s，37◦C 30s，72◦C 1.5 min，最后72 ◦C 延伸7min，采用3.5%琼脂糖凝胶的方法检测扩增片段大小，然后通过序列分析鉴定病毒。

2.3.3.快速荧光灶抑制试验(RFFIT)采用RFFIT方法利用CVS-11作为攻击毒株检测病毒中和抗体（VNA）。

2.3.4 .统计学分析统计并绘制Kaplan–Meier生存曲线(SAS 9.2)，采用时序检验法(log-rank test)分析各个实验组的生存量差异。

同一生存函数的检验假设在P < 0.05时被否定。

2.4.应用灭活的商用HDCV和减毒活疫苗ERAG333或ERA2G333对地鼠进行PEP2.4.1 利用分离于德克萨斯狗的RV进行攻击实验将分离于德克萨斯狗的RV(10(2.5次方)MICLD50/50μl )肌肉接种于2 月龄雌性叙利亚地鼠(6只/组)左腓肠肌。

实验动物根据不同的PEP方案被分为若干组，每只地鼠经左腓肠肌注射50μl 灭活的HDCV或减毒疫苗ERAG333或ERA2G333。

接种HDCV的实验组，于0, 3, 7, 14和28天各接种一剂（同时注射或不注射HRIG）；接种减毒活疫苗ERAG333或ERA2G333的实验组，每只动物只接种一次，分别于暴露后1、3、5或7天；对照组6 只地鼠不做任何处理，发病后于1-6天执行安乐死并检测病毒的播散情况。

2.4.2. 利用分离于墨西哥狗RV进行攻击实验将2月龄雌性叙利亚地鼠分为13组（9只/组），每只地鼠经左腓肠肌注射50μl(10(2次方)MICLD50/50μl ) 分离于墨西哥的狗RV。

然后，应用减毒的ERAG333疫苗在6小时、24小时和2、3 、4、5、6天对地鼠进行PEP，每只地鼠只免疫一次。

埃森方案规定于暴露后0、3、7、14和28天各接种一剂HDCV疫苗或同时注射HRIG。

对照组9 只地鼠不做任何处理，发病后于1-6天执行安乐死并检测病毒的播散情况。

收集各个实验组动物腰部、胸部脊髓和脑组织并用hnRT-PCR检测病毒RNA。

同时，每日观察动物情况，连续观察4 个月，并对发病动物执行安乐死，做好记录。

2.5.应用减毒和灭活的ERAG333疫苗对地鼠进行PEP将2月龄雌性地鼠分为5组（6只/组），每只地鼠经左腓肠肌注射50μl （10(2次方)MIC LD50/50μl）分离于墨西哥狗的RV。

然后，应用减毒或灭活的ERAG333疫苗在24小时和3 天对地鼠进行PEP，每只地鼠只免疫一次。

每日观察动物情况，连续观察2 个月，并对发病动物执行安乐死，做好记录。

2.6.应用灭活的细胞培养疫苗或减毒的ERAG333疫苗对猕猴进行PEP将成年雌性猕猴分为3组（3只/组），每只猕猴经咀嚼肌注射0.5ml 滴度为10(2次方)MIC LD50/50μl分离于墨西哥狗的RV。

24小时后，第一组于三角肌接种1ml HDCV(根据埃森方案于0, 3, 7, 14和28天各一剂，不包括HRIG）；第二组于三角肌接种一次1ml 减毒ERAG333疫苗（10(9次方)TCID50/ml）(于3, 7, 14和28天在三角肌接种1ml PBS）；第三组只在0, 3, 7, 14和28天于三角肌接种1ml 的PBS。

所有动物在第1 个月每周采一次血检测VNA，1 个月后继续每日至少观察动物两次，连续观察3 个月，并对发病动物执行安乐死，做好记录。

2.7.在地鼠模型中检测早期和延迟进行标准PEP（5剂疫苗）的有效性将地鼠分为6组（3只/组），每只地鼠经左腓肠肌注射50μl 滴度为10(2.5次方) MIC LD50/50μl分离于德克萨斯狗的RV。