第六节免疫标记技术
《标记免疫技术》课件
荧光物质具有高灵敏度、高特异性和可 定量检测等优点，使得荧光免疫技术成 为一种高灵敏度、高特异性的检测方法
。
荧光物质可以通过不同的激发光波长和 发射光波长进行选择，从而实现多组分
的同时检测。
荧光免疫技术的应用
荧光免疫技术在医学领域中广泛应用于感染性疾病、肿瘤标志物、激素、细胞因子 等的检测。
该技术的基本原理是利用酶标记的抗 体或抗原，与相应的抗原或抗体结合 ，形成酶-抗原-抗体的复合物。
酶联免疫技术的应用
酶联免疫技术广泛应用于医学、生物 学、化学等领域，如诊断试剂、药物 筛选、食品安全检测等。
在生物学领域，酶联免疫技术用于研 究生物分子相互作用、蛋白质表达和 细胞信号转导等方面。
在医学领域，酶联免疫技术被用于检 测各种传染病、肿瘤标志物、自身抗 体等，为疾病的早期诊断和治疗提供 了有力支持。
化学发光免疫技术的优缺点
优点
化学发光免疫技术具有高灵敏度 、高特异性和低检测限等优点， 能够实现快速、准确地定量分析 目标物质。
缺点
该技术的缺点是标记物的制备较 为复杂，且某些化学发光物质具 有一定的毒性，需要谨慎处理。
THANKS
感谢观看
REPORTING
环境监测
用于检测环境中的有害物 质、污染物等，评估环境 质量。
标记免疫技术的发展历程
19世纪末
免疫学基础理论建立，为标记免疫技术发 展奠定了基础。
21世纪初
随着生物技术的不断发展，新型标记免疫 技术不断涌现，如量子点标记免疫技术、 纳米材料标记免疫技术等。
20世纪初
放射免疫技术诞生，实现了对生物样本中 微量物质的定量分析。
20世纪90年代
荧光免疫技术和化学发光免疫技术得到广 泛应用，进一步提高了检测的灵敏度和自 动化程度。
第六章免疫标记技术ppt课件
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１ ．SPA通用系统
（1）SPA的发现 （2）颗粒SPA的应用 （3）SPA的标记和应用
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（1）SPA的发现
1940 年 Verwey 发 现 金 黄 色 葡 萄 球 菌 的 某 些菌株，可与人正常血清在双相免疫扩 散试验中出现沉淀线。
1958 年 Jensen 用 离 子 交 换 树 脂 分 析 证 明 ， 该成分是一种细菌胞壁上不含糖的蛋白 质，命名为金黄色葡萄球菌A蛋白 (Staphylococcal Protein A，SPA)
开创了生物活性物质微量测定 技术的新时代，是微量分析方法学 上的一个突破。
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5
放射免疫技术
优点：
① 特异性强，即抗原抗体的特异性反应；
② 灵敏度高，结果精确，检测范围10-910-12g；
③ 操作流程简单易行，加样程序简单，测量和
数据处理自动化；
④ 样品用量少、一般无需复杂的提纯步骤；
(direct labeling)
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direct ELISA—for Ag
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direct ELISA—for Ab
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（2）间接标记法
（indirect labeling）
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（3）夹心法 （sandwich assay）
⑤ 应用范围广泛，尤其是测量小分子半抗原。
缺点：
需要昂贵的检测仪精选器课件；ppt 同位素污染。
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放射免疫技术的原理
是建立在标记抗原（或配体） 和待测抗原（或配体）对有限量的 特异性抗体（或受体）的竞争性抑 制反应基础上的，最终形成的放射 性标记复合物与被测配体（或抗原） 呈负相关，因而亦称竞争性放射免 疫技术。
《免疫标记技术》课件
胶体金标记抗体和抗原的制备
胶体金颗粒的制备： 通过化学方法将金 离子还原为胶体金 颗粒
抗体或抗原的制备： 通过生物技术方法 制备特异性抗体或 抗原
标记反应：将胶体 金颗粒与抗体或抗 原进行标记反应， 形成胶体金标记抗 体或抗原
纯化：通过离心、 过滤等方法对胶体 金标记抗体或抗原 进行纯化，去除杂 质和未结合的胶体 金颗粒
确性
实验室安全与防护
实验室环境：保持清洁、通风 良好
实验操作：遵守操作规程，避 免交叉污染
防护设备：使用防护服、手套、 口罩等防护设备
废弃物处理：妥善处理废弃物， 避免环境污染
07
免疫标记技术的未来发 展
新技术的应用和展望
免疫标记技 术在疾病诊 断中的应用
免疫标记技 术在药物研 发中的应用
免疫标记技 术在食品安 全检测中的 应用
镜ห้องสมุดไป่ตู้察等。
04 免疫酶技术
酶标抗体和酶标抗原的制备
酶标抗体的制 备：通过免疫 反应，将酶与 抗体结合，形
成酶标抗体
酶标抗原的制 备：通过化学 方法，将酶与 抗原结合，形
成酶标抗原
酶标抗体和酶 标抗原的纯化： 通过色谱法、 电泳法等方法
进行纯化
酶标抗体和酶 标抗原的保存： 低温保存，避 免酶的活性降
交叉学科融合与创新
免疫标记技术与生物医学的融合：提高疾病诊断和治疗效果
免疫标记技术与纳米技术的融合：开发新型免疫标记材料和检测方法
免疫标记技术与人工智能的融合：实现自动化、智能化的免疫标记检测和 分析 免疫标记技术与大数据、云计算的融合：提高免疫标记数据的处理和分析 效率，为疾病预防和治疗提供更准确的信息支持。
荧光免疫标记应用： 细胞标记、蛋白质 标记、DNA标记 等
免疫标记技术的应用
免疫标记技术的应用免疫标记技术是一种重要的实验技术，其主要应用于生物学、医学等领域中。
以下是免疫标记技术的主要应用及其特点：1. 免疫印迹技术免疫印迹技术又称为Western blotting，是一种检测蛋白质的方法。
该技术主要应用于检测蛋白质的表达、定位及重组蛋白的纯化等研究领域。
与传统的蛋白质检测方法相比，免疫印迹技术具有高灵敏度和高特异性的特点。
2. 免疫组化技术免疫组化技术是一种基于免疫标记技术的细胞和组织学研究方法，用于检测蛋白质在组织或细胞中的分布、表达水平及其定位。
该技术可用于研究肿瘤、癌症等多种疾病的发生机制、转移及预后等方面，具有高度特异性和敏感性。
3. 流式细胞术流式细胞术是一种利用激光光散射和荧光技术对细胞进行分析和排序的方法。
该技术可用于研究细胞的免疫特性、组成、功能及化学性质等方面。
流式细胞术具有高通量、高特异性和高灵敏度等特点，广泛应用于细胞生物学研究、免疫学和肿瘤学等领域。
4. 免疫沉淀技术免疫沉淀技术是一种重要的蛋白质相互作用研究方法。
该技术利用抗体将目标蛋白质与其他蛋白质结合，然后通过沉淀和检测蛋白质相互作用。
免疫沉淀技术可用于研究蛋白质的复合物组成、相互作用、调控和信号传递等方面，具有高度特异性和敏感性。
5. 免疫荧光技术免疫荧光技术是一种基于荧光染料和抗体的免疫标记技术。
该技术可用于研究细胞或组织内特定蛋白质及其亚细胞定位、表达水平等方面。
免疫荧光技术具有高分辨率、高特异性和高灵敏度的优点，广泛应用于细胞学、免疫学、感染病原体检测等领域。
总之，免疫标记技术是现代生物医学研究中不可或缺的实验技术之一。
其应用范围广泛、技术手段多样、具有高度特异性和敏感性等优点，成为了生物学及医学领域的重要研究工具。
免疫标记技术课件
2.胶体金法无污染，不含危害操作者即污染环境;
3.胶体金标抗体在冻干状态下室温储存较稳定,有 效期长; 4.灵敏度高，10-25IU/L。
免疫标记技术
Immunolabeling technique
免疫标记技术
用荧光素、同位素或酶等示踪物质标记抗体（或抗原）
进行抗原-抗体反应。 标记物质与抗体（或抗原）的化学连接未改变 抗体或 抗原的免疫学特性，且极大的提高了反应的灵敏度，可以对 微量物质进行定量、定性 或定位检测。
免疫标记技术 = 免疫技术+ 标记技术
常用底物： 对硝基苯磷酸酯(p-NPP)：产物为黄色。 AP灵敏性高于HRP，但不易获得纯品，且稳定性低于HRP、 价高，故应用不如HRP普及。
基本特点：
①标记后保留酶和抗原(抗体)的活性；
②酶促反应专一性，保证特异性；
③底物反应放大作用，提高敏感性； ④酶标试剂保存稳定；
⑤操作简便，安全易行。
常用方法: 酶联免疫吸附试验
一、双抗体夹心法检测HBsAg
实验材料
1.HBV诊断试剂盒； 2.HBsAg阳性对照品，阴性对照品，待检品。
HBV感染后的血清学指标: HBsAg, HBsAb
乙肝表面抗原,存在于 HBV感染的急性期及慢 性期的血清中,为感染 指标。
HBeAg, HBeAb
HBcAb(IgG,IgM)
实验步骤
层析流方向
G：金标鼠抗人HCG单抗
T：鼠抗人HCG单抗
C：羊抗鼠IgG抗体 B：吸水纸
HCG金标试纸
滴加标本 复溶 固定
反应条带
质控条带
A
G 层析流方向
免疫标记技术原理
免疫标记技术原理
免疫标记技术是一种用于检测或定位特定分子的方法。
它基于免疫学原理，利用特异性抗体与目标分子结合，并通过标记物的发光、荧光、酶、放射性等性质来检测或可视化目标分子。
免疫标记技术的原理主要包括以下几个步骤：
1. 抗体选择：选择与目标分子高度特异性结合的抗体。
这些抗体常通过免疫动物（如小鼠）注射目标分子来获得。
2. 标记物的选择：选择适当的标记物，如荧光染料、酶（如辣根过氧化物酶）、放射性同位素等，用于标记抗体。
标记物的选择通常取决于实验的要求，如需要检测感光杯、细胞表面分子或组织切片等。
3. 抗体与目标分子的结合：将标记的抗体与待检的样品中的目标分子结合。
这一步可以在体内（如细胞或组织内）或体外（如孵育在试管中）完成。
4. 洗涤：通过洗涤步骤，去除未结合的抗体和其他非特异性结合物质，以减少背景信号。
5. 检测与可视化：根据所使用的标记物的性质，采用相应的方法进行检测和可视化。
例如，对于荧光标记的抗体，可以使用荧光显微镜进行观察；对于酶标记的抗体，可以使用酶底物产生显色反应。
免疫标记技术在生物医学研究和临床诊断中广泛应用。
它能够高效、高灵敏地检测和定位目标分子，为疾病诊断、药物研发等领域提供了重要的工具和方法。
免疫标记技术的基本原理
免疫标记技术的基本原理
免疫标记技术是一种常用的细胞分子生物学技术，它是通过利用免疫原/抗原反应，将抗体与抗原或细胞内的标记物质结合在一起，以便识别、追踪、回收、测量和检测标记物质的手段。
免疫标记技术的基本原理相当简单，即在微小样品中检测特定抗原的方法。
它充分利用免疫系统的特性：抗体可以与外来的受体（抗原）结合，而不对正常细胞发生反应。
抗体与抗原结合时，会产生一种特殊的生物反应，该反应可以把抗体和抗原标记的某一特定的抗原分子联系起来，从而实现抗体和抗原之间的标记化效果。
免疫标记技术中首先要选择合适的抗体，并将其做好标记，然后将抗体接种到实验动物（如小鼠、大鼠）中，令其产生一种针对抗原特异性的免疫应答。
当抗体与抗原结合时，均会由于表位的分子吸引力而结合在一起，并且都会引发一系列的生物化学反应。
抗体标记物中的抗原与受体结合时，抗体也会受到外部影响而引发生物学改变，从而使其达到对目标抗原的特异性结合，从而提高标记物的特异性。
最后，在细胞或组织内观察抗体标记物所标记后的抗原或受体，以获得免疫标记技术的结果，从而实现抗原的高度特异性鉴定。
免疫标记技术的优势在于可以在细胞或组织的微小样品中检测出特定的抗原，而不需要大量的样品研究。
免疫标记技术
常用的酶及其底物 酶 辣根过 氧化物 酶 (HRP) 底物
邻苯二胺 (OPD) 四甲替联苯胺 (TMB) 5氨基水杨酸 (5AS) 邻联苯甲胺 (OT) 2,2‘-连胺基-2(3-乙基-并噻 唑啉磺酸-6)铵盐 (ABTS )
显色反应 测定波长
橙红色 蓝绿色 棕色 蓝绿色
蓝绿色
492 450 449 425 642
酶是一种有机催化剂，很少量的酶即可导致大 量的催化过程，所以极为敏感。它的催化过程 有两种基本形式： (1)E十S →(ES)→E十P (2)E十S →＝(ES) (ES)十D1 →E十P十D2 E为酶，S为酶作用的底物，P为底物分解 后的产物，D，为供氢体，D：为D1的氧化型。 如P或D：为有色化合物，即可用呈色反应显示 酶的存在。
HRP的催化反应需要底物过氧化氢(H2O2) 和供氢体(DH2)。供氢体多为无色的还原型 染料，通过反应可生成有色的氧化型染料 (D)。酶促反应的过程如下: HRP DH2＋H2O2────→D＋2H2O
供氢体的种类很多，形成的产物特点不一。如 DAB(3.3－二氨基联苯胺)的反应产物为不溶性沉 淀物，并有电子密度，故适宜于做免疫酶染色或 电镜观察。5AS(5-氨基水杨酸)早期曾用于ELISA， 但其溶解度不够大，且空白孔不易控制到无色， 现已很少应用。OT(邻联甲苯胺)的特点是能产生 鲜艳的蓝绿色产物且灵敏度较高，但反应中受温 度影响较大，而且由于产物不稳定，需要在短时 间内进行测定。
荧光是指一个分子或原子吸收了给 予的能量后，即刻引起发光；停 止能量供给，发光亦瞬即停止。 荧光素是一种能吸收激发光的光能 产生荧光，并能作为染料使用的 有机化合物。目前用于标记抗体 的荧光素主要有异硫氰酸荧光黄 (FITC)、四乙基罗丹明及四甲基 异硫氰酸罗丹明。
第六章 免疫标记技术
优点： ①灵敏度高，特异性强； ②可定性、定量检测可溶性抗原和抗体，适用 于普查； ③试剂来源广，稳定，保存时间长，且无同位 素污染； ④结果可肉眼半定量，也可用仪器定量检测， 且仪器价格较低廉，可在大多数实验室开展； ⑤操作简便，易于掌握和使用，且重复性好； ⑥可用于定位组织细胞上的抗原或抗体成分。 缺点： 标记反应较难掌握，容易引起蛋白失活。
（1）试剂要求
①能使B和F完全分离 ②不受外界因素的干扰 ③与游离抗原的非特异性作用尽可能小 ④操作简便、分离迅速、重复性好 ⑤来③盐析法 ④层析电泳法 ⑤固相法
①双抗体法
加入第二抗体使微量抗原抗体复 合物的分子加大，从而使原来不能 用普通离心法沉淀的抗原抗体复合 物易于沉淀而分离。 本法为目前应用最广泛的分析方法
第一节放射免疫技术第二节免疫荧光技术第三节免疫酶技术第一节放射免疫技术第二节免疫荧光技术第三节免疫酶技术一放射免疫技术的原理二建立放射免疫技术必备的条件三放射免疫技术的基本方法一放射免疫技术的原理二建立放射免疫技术必备的条件三放射免疫技术的基本方法放射免疫技术radioimmunoassayria1977年获诺贝尔生理和医学奖特异性强即抗原抗体的特异性反应灵敏度高结果精确检测范围为1091012操作流程简单易行加样程序简单测量和数据处理自动化样品用量少一般无需复杂的提纯步骤应用范围广泛尤其是测量小分子半抗原需要昂贵的检测仪器
RIA测定原理
放射免疫技术的原理
是建立在标记抗原（或配体） 和待测抗原（或配体）对有限量的 特异性抗体（或受体）的竞争性抑 制反应基础上的，最终形成的放射 性标记复合物与被测配体（或抗原） 呈负相关，因而亦称竞争性放射免 疫技术。
免疫标记技术的原理及应用
免疫标记技术的原理及应用1. 引言免疫标记技术是一种通过添加荧光染料或酶等标记物，使得目标分子可以被直接观察、定量或检测的技术。
它在生物学、医学、生物工程等领域具有广泛的应用。
本文将介绍免疫标记技术的原理和常见的应用案例。
2. 免疫标记技术的原理免疫标记技术主要依赖于抗体的高度特异性和结合能力。
它通过标记抗体或抗原来实现目标分子的可视化或检测。
其中最常见的免疫标记技术包括：免疫荧光染色、酶联免疫吸附实验（ELISA）和免疫组织化学。
2.1 免疫荧光染色免疫荧光染色是利用荧光染料标记抗体或抗原，并通过特定的荧光显微镜观察目标分子的分布。
这种技术能够在细胞水平上观察目标分子的定位和表达水平。
免疫荧光染色常用在免疫细胞化学、蛋白质定位和细胞信号转导的研究中。
2.2 酶联免疫吸附实验（ELISA）酶联免疫吸附实验是一种常见且灵敏的定量检测方法。
它通过将酶标记的抗体或抗原与待检测分子结合，再用底物与酶作用生成可测量的产物。
这种技术广泛应用于血液学、临床诊断和药物研发等领域。
2.3 免疫组织化学免疫组织化学是通过在组织切片上标记抗体或抗原，利用显微镜观察目标分子在组织中的位置和表达情况。
它在研究肿瘤、组织发育和疾病等方面有重要应用。
3. 免疫标记技术的应用免疫标记技术在许多领域都有广泛的应用，下面介绍一些常见的应用案例。
3.1 免疫组织化学在癌症诊断中的应用免疫组织化学可以通过标记抗体来检测肿瘤标志物，从而帮助医生诊断和治疗癌症。
例如，可以利用针对特定抗原的抗体来检测肿瘤细胞在组织中的分布和表达水平，以辅助早期的癌症诊断和预后评估。
3.2 免疫荧光染色在细胞生物学研究中的应用免疫荧光染色可以在细胞水平上观察某个特定蛋白质的定位和表达情况。
这种技术广泛应用于细胞生物学研究中，例如研究细胞器的分布和功能、蛋白质互作和信号通路等。
3.3 ELISA在生物药物研发中的应用ELISA是一种常用的生物药物研发工具，可以用于检测和定量药物分子、抗体和蛋白质的浓度。
免疫标记技术
• 100 ul of fresh substance (DAB) are added into each well.
Incubated at 37℃ for 20min. • 50 ul (one drop) of the stop solution are added into each well. • Read OD of each well at 490nm with a ELISA reader.
• 以胶体金为标记物的抗原抗体反应。 • 分类：定性：免疫电镜技术和免疫组织化学技术
半定量：常与膜载体技术结合，包括斑点金免疫渗滤
试验和斑点金免疫层析试验等。
• 胶体金是由金盐被还原成原子金后形成的金颗粒悬液，呈红 色，并能与蛋白质等大分子物质结合。
斑点金免疫层析试验(dot gold immunochromatographic assay，DICA)
• 三种试剂： ① 固相抗原或抗体 即把抗原或抗体用合适的方法连接到固 相载体表面，同时保留它们的免疫活性；
② 酶标抗原或抗体，即把某些酶用合适的方法连接到抗原或 抗体表面，同时保留它们的免疫活性以及酶的催化活性。 常用的酶是辣根过氧化物酶(HRP)和碱性磷酸酶(AP)； ③ 酶作用的底物 ：一般是能发生颜色改变的化合物，也可 以是发光类化学物质。
Immunogold labeling technique
the "rapid tests" that you might use to detect pregnancy, or diagnose an infection quickly in a doctor's office
胶体金免疫技术
Method
• Rabbit anti-human antibody are attached to the surface of microplate. (have been done)
第六节 免疫标记技术
第十一章血清学试验第六节免疫标记技术免疫标记技术是利用抗原抗体反应的特异性和标记分子极易检测的高度敏感性相结合形成的试验技术。
免疫标记技术主要有荧光抗体标记技术、酶标抗体技术和同位素标记抗体技术。
它们的敏感性和特异性大大超过常规血清学方法，现已广泛用于传染病的诊断、病原微生物的鉴定、分子生物学中基因表达产物分析等领域。
其中酶标抗体技术最为简便，应用较广。
这里主要介绍荧光抗体标记技术和酶标抗体技术。
一、荧光抗体标记技术荧光抗体标记技术（fluorescent-labelled antibody technicque）是用荧光色素标记在抗体或抗原上，与相应的抗原或抗体特异性结合，然后用荧光显微镜观察所标记的荧光，以分析示踪相应的抗原或抗体的方法。
（一）原理荧光素在10-6的超低浓度时，仍可被专门的短波光源激发，在荧光显微镜下可观察到荧光。
荧光抗体标记技术就是将抗原抗体反应的特异性、荧光检测的高敏性、以及显微镜技术的精确性三者结合的一种免疫检测技术。
（二）荧光色素荧光色素是能产生明显荧光，又能作为染料使用的有机化合物。
主要是以苯环为基础的芳香族化合物和一些杂环化合物。
它们受到激发光(如紫外光)照射后，可发射荧光。
可用于标记的荧光色素有异硫氰酸荧光黄(FITC)、四乙基罗丹明(RB 200)和四甲基异硫氰酸罗丹明（TMRITC）。
其中FITC应用最广，为黄色结晶，最大吸收光波长为490～495nm,最大发射光波长520～530nm，可呈现明亮的黄绿色荧光。
FITC分子中含有异硫氰基，在碱性(pH9.0～9.5)条件下能与IgG分子的自由氨基结合，形成FITC-IgG结合物，从而制成荧光抗体。
抗体经荧光色素标记后，不影响与抗原的结合能力和特异性。
当荧光抗体与相应的抗原结合时，就形成了带有荧光性的抗原抗体复合物，从而可在荧光显微镜下检出抗原的存在。
（三）荧光抗体染色及荧光显微镜检查1．标本片的制备标本制作的要求首先是保持抗原的完整性，并尽可能减少形态变化，抗原位置保持不变。
免疫标记技术实验报告
免疫标记技术实验报告实验目的：本实验旨在通过免疫标记技术，对特定生物分子进行定位、定量和功能分析。
免疫标记技术是一种利用抗体与抗原特异性结合的原理，通过标记物的信号放大，实现对目标分子的检测和分析的方法。
实验原理：免疫标记技术主要包括直接法和间接法两种。
直接法是将荧光素或其他标记物直接连接到抗体上，而间接法则是先将未标记的抗体与抗原结合，然后再用标记的二抗进行检测。
本实验采用荧光标记的直接法，通过荧光显微镜观察目标分子的分布情况。
实验材料：1. 目标细胞或组织样本2. 特异性抗体（一抗）3. 荧光标记的二抗4. 荧光显微镜5. 固定液、洗涤液、封闭液等实验试剂实验步骤：1. 样本准备：将细胞或组织样本固定在载玻片上，进行适当的固定处理。
2. 封闭处理：使用封闭液处理样本，以减少非特异性结合。
3. 一抗孵育：将样本与特异性一抗孵育，使一抗与目标抗原结合。
4. 洗涤：去除未结合的一抗，使用洗涤液清洗样本。
5. 二抗孵育：将荧光标记的二抗与样本孵育，使二抗与一抗结合。
6. 洗涤：再次洗涤样本，去除未结合的二抗。
7. 荧光显微镜观察：使用荧光显微镜观察并记录目标分子的荧光信号。
实验结果：通过荧光显微镜观察，我们可以看到目标分子在细胞或组织中的分布情况。
荧光信号的强度和分布模式为我们提供了关于目标分子表达水平和位置的重要信息。
实验讨论：本实验中，免疫标记技术的成功应用依赖于抗体的特异性和亲和力，以及荧光标记的稳定性和亮度。
实验中可能存在的非特异性结合和背景噪声需要通过优化实验条件和使用适当的封闭液来控制。
此外，荧光显微镜的分辨率和灵敏度也是影响实验结果的关键因素。
实验结论：免疫标记技术是一种强大的生物分子分析工具，它能够提供目标分子在细胞或组织中的精确定位和定量信息。
通过本实验，我们成功地应用了免疫标记技术，并对目标分子的分布情况进行了有效的观察和分析。
注意事项：1. 实验过程中应严格控制温度和时间，以保证抗体与抗原的特异性结合。
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第十一章血清学试验第六节免疫标记技术免疫标记技术是利用抗原抗体反应的特异性和标记分子极易检测的高度敏感性相结合形成的试验技术。
免疫标记技术主要有荧光抗体标记技术、酶标抗体技术和同位素标记抗体技术。
它们的敏感性和特异性大大超过常规血清学方法，现已广泛用于传染病的诊断、病原微生物的鉴定、分子生物学中基因表达产物分析等领域。
其中酶标抗体技术最为简便，应用较广。
这里主要介绍荧光抗体标记技术和酶标抗体技术。
一、荧光抗体标记技术荧光抗体标记技术（fluorescent-labelled antibody technicque ）是用荧光色素标记在抗体或抗原上，与相应的抗原或抗体特异性结合，然后用荧光显微镜观察所标记的荧光，以分析示踪相应的抗原或抗体的方法。
（一）原理荧光素在10-6的超低浓度时，仍可被专门的短波光源激发，在荧光显微镜下可观察到荧光。
荧光抗体标记技术就是将抗原抗体反应的特异性、荧光检测的高敏性、以及显微镜技术的精确性三者结合的一种免疫检测技术。
（二）荧光色素荧光色素是能产生明显荧光，又能作为染料使用的有机化合物。
主要是以苯环为基础的芳香族化合物和一些杂环化合物。
它们受到激发光（如紫外光）照射后，可发射荧光。
可用于标记的荧光色素有异硫氰酸荧光黄（FITC）、四乙基罗丹明（RB 200）和四甲基异硫氰酸罗丹明（TMRITC。
其中FITC M用最广，为黄色结晶，最大吸收光波长为490〜495nm,最大发射光波长520〜530nm可呈现明亮的黄绿色荧光。
FITC 分子中含有异硫氰基，在碱性（pH9.0〜9.5）条件下能与IgG分子的自由氨基结合，形成FITC-IgG结合物，从而制成荧光抗体。
抗体经荧光色素标记后，不影响与抗原的结合能力和特异性。
当荧光抗体与相应的抗原结合时，就形成了带有荧光性的抗原抗体复合物，从而可在荧光显微镜下检出抗原的存在。
（三）荧光抗体染色及荧光显微镜检查1．标本片的制备标本制作的要求首先是保持抗原的完整性，并尽可能减少形态变化，抗原位置保持不变。
同时还必须使抗原标记抗体复合物易于接受激发光源，以便很好地观察和记录。
这就要求标本要相当薄，并要有适宜的固定处理方法。
根据被检样品的不同，采用不同的制备方法。
细菌培养物、血液、脓汁、粪便、尿沉渣及感染的动物组织等，可制成涂片或压印片。
感染组织最好制成冰冻切片或低温石蜡切片。
也可用生长在盖玻片上的单层细胞培养作标本。
标本的固定有两个目的，一是防止被检材料从玻片上脱落，二是消除抑制抗原抗体反应的因素。
最常用的固定剂是丙酮和95%勺乙醇。
固定后用PBS反复冲洗, 干后即可用于染色。
2．染色方法荧光抗体染色法有多种类型，常用的有直接法和间接法两种。
（1）直接法取待检抗原的标本片，滴加荧光抗体染色液于其上，置湿盒中，于37C作用30min,用pH7.2的PBS®漂洗15min,冲去游离的染色液，干燥后滴加缓冲甘油（分析纯甘油9份加PBS1份）封片，在荧光显微镜下观察。
标本片中若有相应抗原存在，即可与荧光抗体结合，在镜下见有荧光抗体围绕在受检的抗原周围，发出黄绿色荧光（图11-8）。
直接法应设以下对照，标本自发荧光对照，阳性标本和阴性标本对照。
该方法优点是简便、特异性高，非特异性荧光染色少。
缺点是敏感性偏低，而且每检一种抗原就需要制备一种荧光抗体。
（2）间接法取待检抗原的标本，首先滴加特异性抗体，置湿盒中，于37C 作用30min,用pH7.2的PBS®漂洗后，再滴加荧光色素标记的第2抗体（抗抗体）染色，再置湿盒中，于37E作用30min,用PBS®漂洗，干燥后封片镜检。
阳性者形成抗原-抗体-荧光抗抗体复合物,发黄绿色荧光（图11-9）。
间接法对照除自发荧光、阳性和阴性对照外，首次试验时应设无中间层对照（标本加标记抗抗体）和阴性血清对照（中间层用阴性血清代替特异性抗血清）。
间接法的优点是，比直接法敏感，对一种动物而言，只需制备一种荧光抗抗体，即可用于多种抗原或抗体的检测，镜检所见荧光也比直接法明亮。
（3）抗补体法将抗血清与补体等量混合，滴加于待检抗原的标本片上，使其形成抗原-抗体-补体复合物，漂洗后再滴加荧光标记的抗补体抗体染色®，感作一定时间，漂洗、干燥后镜检。
此法特异性和敏感性均高，但易产生非特异性荧光。
3．荧光显微镜检查标本滴加缓冲甘油后用盖玻片封载，即可在荧光显微镜下观察。
荧光显微镜不同于光学显微镜之处，在于它的光源是高压汞灯或溴钨灯，并有一套位于集光器与光源之间的激发滤光片，它只让一定波长的紫外光及少量可见光（蓝紫光）通过。
此外，还有一套位于目镜内的屏障滤光片，只让激发的荧光通过，而不让紫外光通过，以保护眼睛并能增加反差。
为了直接观察微量滴定板中的抗原抗体反应，如感染细胞培养物上的荧光，可使用现已有商品的倒置荧光显微镜观察。
（四）荧光抗体标记技术的应用荧光抗体标记技术具有快速、操作简单的特点，同时又有较高的敏感性、特异性和直观性，已广泛用于细菌、病毒、原虫的鉴定和传染病的快速诊断。
此外还可用于淋巴细胞表面抗原的测定和自身免疫病的诊断等方面。
1．细菌病诊断能利用荧光抗体标记技术直接检出或鉴定的细菌约有30余种，均具有较高的敏感性和特异性，其中较常应用的是链球菌、致病性大肠杆菌、沙门氏菌、马鼻疽杆菌、猪丹毒杆菌等。
动物的粪便、黏膜拭子涂片、病变部渗出物、体液或血液涂片、病变组织的触片或切片以及尿沉渣均可作为检测样本，经直接法检出目的菌，这对于细菌病的诊断具有很高的价值。
2．病毒病诊断用荧光抗体标记技术直接检出患畜病变组织中的病毒，已成为病毒感染快速诊断的重要手段，如猪瘟、鸡新城疫等可取感染组织做成冰冻切片或触片，用直接或间接免疫荧光染色可检出病毒抗原，一般可在2h内作出诊断报告；猪流行性腹泻在临床上与猪传染性肠胃炎十分相似，将患病小猪小肠冰冻切片，用猪流行性腹泻病毒的特异性荧光抗体做直接免疫荧光检查，即可对猪流行性腹泻进行确诊。
二、酶标抗体技术酶标抗体技术（enzyme-labelled antibody technicque ）是继免疫荧光技术之后发展起来的一大新型的血清学技术，目前该技术已成为免疫诊断、检测和分子生物学研究中应用最广泛的免疫学方法之一。
（一）原理酶标抗体技术是根据抗原抗体反应的特异性和酶催化反应的高度敏感性而建立起来的免疫检测技术。
酶是一种有机催化剂，催化反应过程中不被消耗，能反复作用，微量的酶即可导致大量的催化过程，如果产物为有色可见产物，则极为敏感。
酶标抗体技术的基本程序是：①将酶分子与抗原或抗体分子共价结合，这种结合既不改变抗体的免疫反应活性，也不影响酶的催化活性。
②将此种酶标记的抗体（抗抗体）与存在于组织细胞或吸附在固相载体上的抗原（抗体）发生特异性结合，并洗下未结合的物质。
③滴加底物溶液后，底物在酶作用下水解呈色；或者底物不呈色，但在底物水解过程中由另外的供氢体提供氢离子，使供氢体由无色的还原型变为有色的氧化型，呈现颜色反应。
因而可通过底物的颜色反应来判定有无相应的免疫反应发生。
颜色反应的深浅与标本中相应抗原（抗体）的量呈正比。
此种有色产物可用肉眼或在光学显微镜或电子显微镜下看到，或用分光光度计加以测定。
这样，就将酶化学反应的敏感性和抗原抗体反应的特异性结合起来，用以在细胞或亚细胞水平上示踪抗原或抗体的所在部位，或在微克、纳克水平上测定它们的量。
所以，本法既特异又敏感，是目前应用最为广泛的一种免疫检测方法之一。
（二）用于标记的酶用于标记的酶有辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等，其中以HR应用最广泛，其次是碱性磷酸酶。
HR广泛分布于植物界，辣根中含量最高。
HR是由无色的酶蛋白和深棕色的铁卟啉构成的一种糖蛋白，分子量为40 000。
HRP勺作用底物是过氧化氢，常用的供氢体有邻苯二胺（0PD）和33-二氨基联苯胺（DAB），二者作为显色剂。
因为它们能在HR催化HQ 生成HO 过程中提供氢，而自己生成有色产物。
QP氧化后形成可溶性产物，呈橙色，最大吸收波长为492nm可用肉眼判定。
QP 不稳定，须现用现配，常作为酶联免疫吸附试验中的显色剂。
QP有致癌性，操作时应予注意。
DA反应后形成不溶性的棕色物质，可用光学显微镜和肉眼观察，适用于各种免疫酶组织化学染色法。
HR可用戊二醛交联法或过碘酸盐氧化法将其标记于抗体分子上制成酶标抗体。
生产中常用的酶标抗体技术有免疫酶组织化学染色法和酶联免疫吸附试验两种。
（三）免疫酶组织化学染色技术又称免疫酶染色法。
是将酶标记的抗体应用于组织化学染色，以检测组织和细胞中或固相载体上抗原或抗体的存在及其分布位置的技术。
（图11-10 ）。
1 ．标本制备和处理用于免疫酶染色的标本有组织切片（冷冻切片或低温石蜡切片）、组织压印片、涂片以及细胞培养的单层细胞盖片等。
这些标本的制备和固定与荧光抗体技术相同，但尚要进行一些特殊处理。
用酶结合物作细胞内抗原定位时，由于组织和细胞内含有内源性过氧化酶，可与标记在抗体上的过氧化物酶在显色反应上发生混淆。
因此，在滴加酶结合物之前通常将制片浸于0.3% HO2中室温处理15〜30min,以消除内原酶。
应用1%- 3%HO甲醇溶液处理单纯细胞培养标本或组织涂片，低温条件下作用10〜15min,可同时起到固定和消除内原酶的作用,效果比较好。
组织成分对球蛋白的非特异性吸附所致的非特异性背景染色，可用10%卵蛋白作用30min进行处理，用0.05%吐温-20和含1%牛血清白蛋白（BSA的PBS寸细胞培养标本进行处理，同时可起到消除背景染色的效果。
2 ．染色方法可采用直接法、间接法、抗抗体搭桥法、杂交抗体法、酶抗酶复合物法、增效抗体法等各种染色方法，其中直接法和间接法最常用。
反应中每加一种反应试剂，均需于37C作用30min,然后以PBS反复洗涤三次，以除去未结合物。
（ 1 ）直接法以酶标抗体处理标本，然后浸入含有相应底物和显色剂的反应液中，通过显色反应检测抗原抗体复合物的存在。
（2）间接法标本首先用相应的特异性抗体处理后，再加酶标记的抗抗体，然后经显色揭示抗原- 抗体- 抗抗体复合物的存在。
3 ．显色反应免疫酶组化染色中的最后一环是用相应的底物使反应显色。
不同的酶所用底物和供氢体不同。
同一种酶和底物如用不同的供氢体，则其反应物的颜色也不同。
如辣根过氧化物酶，在组化染色中最常用DAB用前应以0.05%mol/L,pH7.4〜7.6的Tris-HCI缓冲液配成50〜75mg/100m溶液，并加少量（约0.01%〜0.03%）HO2混匀后加于反应物中置室温10〜30min,反应产物呈深棕色；如用甲萘酚，则反应产物呈红色，用4-氯-1- 萘酚, 则呈浅蓝色或蓝色。
4 .标本观察显色后的标本可在普通显微镜下观察，抗原所在部位DAB!色呈棕黄色。