基础生化实验-蛋白质纯化

蛋白质纯化

一、目的:

利用金属亲和性管柱(metal affinity column)来大量纯化带有affinity tag的基因重组蛋白。

二、原理:

由于六个Histidine 所组成的His Tag (metal affinity tag)可与Ni2+ bind，所以利用基因重组技术在表现的蛋白质加上His Tag，再以金属亲和性管柱

(Ni-NTA) (此His- tag序列可与带二价正电的阳离子相螯和)及liquid chromatography来大量纯化蛋白质。

三、试剂与器材:

1.loading(binding) buffer (10mM imidazole,0.3M NaCl,50Mm Tris-HCl

Ph7)

✧细菌回溶成为蛋白质的载体以保持活性

2.wash buffer (20mM imidazole,0.3M NaCl,50Mm Tris-HCl,Ph7)

3.elution buffer (20mM EDTA,0.3M NaCl,50Mm Tris-HCl,Ph7)

上课补充:

✧蛋白质很脆弱，需要在特殊的buffer里。

四、仪器与设备:

FPLC(速液相色谱仪)

五、步骤:

1.将管柱架在铁架上，把亲和性胶体悬浮装填于管柱内。

2.以2~3倍CV loading buffer清洗管柱后，注入蛋白质样本。

3.以wash buffer梳洗，2到3倍column体积。

4.用wash buffer和elution buffer进行线性梳洗，并收集流出液体，以

FPLC UV monitor上的OD280数据读取样品流出与否，并观察冲离液之

曲

线图。

上课补充:

✧胞内型分泌需要用超音波破菌，因为会放热所以要放在冰中使用。

✧线性梳洗为加入elution buffer会有颜色变化会把镍离子跟imidazole冲

洗掉，剩下胶体溶液。

✧其中imidazole和Histidine类似也会和镍离子结合所以会竞争，可拿来

洗涤蛋白质。(可详见问题一及补充资料2)

六、问题:

问题一: Imidazole的结构与特性。

Imidazole又名咪唑即1,3-二氮唑，是一个五元杂环芳香性有机化合物，化学式C3H4N2。它也是一个生物碱。白色或浅黄色固体结晶，可溶于水、氯仿、

醇、醚，具有酸性，也具有碱性。氢原子在两个氮原子之间移动，因此存在两个互变异构体。

咪唑环结构在生物分子中广泛存在，例如组氨酸和对应的荷尔蒙组胺。很多药物也包含有咪唑环，例如硝基咪唑和咪唑类抗真菌药物。

结构与性质

咪唑为平面五元环状化合物，易溶于水（以无限比例）和其它极性溶剂。咪

唑的两个氮原子间存在永久偶极，极性很强，偶极矩为3.61D，并且分子间存在氢键缔合，导致了咪唑具有反常高的沸点（256°C）。分子中存在一个6电子

共轭大π键，故具有典型的芳香性。与氢以σ键相连的氮原子提供一对电子，环内其余四个原子各提供一个电子成键。

1N上有氢的咪唑环中，氢原子可以在两个氮原子间迁移，存在两个互变异构体，C-4和C-5是等同的。这两个互变异构体无法分离，当有取代基时，常以「4(5)-取代咪唑」（如4(5)-甲基咪唑）来命名。

组氨酸生成组胺的反应如下所示：

咪唑一个用途是在金属螯合亲和层析(IMAC)中用于His标签蛋白的纯化。

标签蛋白与层析柱表面珠孔内的镍离子介质发生结合，过量的咪唑通过层析柱，将与镍配位的标签蛋白洗脱下来，得到高纯度的目标蛋白。

咪唑是许多药品的重要组成部分。许多杀菌剂和抗真菌、抗原虫和抗高血压的药物中含有合成咪唑。咪唑是茶叶和咖啡豆中含有的茶碱分子的组成部分，具

有刺激中枢神经系统的作用。通过干扰DNA的活动抑制白血病的抗癌药物巯嘌

呤中也含有咪唑。

问题二:2.ETDA的资料(整理)

EDTA又名乙二胺四乙酸(Ethylene Diamine Tetraacetic Acid)

简称：EDTA

俗名；依地酸（特别是它的钙盐络合物，医学上称为依地酸钠钙）

分子量：292.248

分子式：C10H16N2O8

为白色无臭无味、无色结晶性粉末，熔点240℃(分解)。不溶于冷水、醇及一般有机溶剂，微溶于热水，溶于氢氧化钠，碳酸钠及氨的溶液中，能溶于160份100℃沸水。为一种有机化合物。它是一个六齿配体，可以螯着多种金属离子。它的4个酸和2个胺的部分都可作为配体的齿，与锰（II）、铜（II）、铁（III）及钴（III）等金属离子组成螯合物

化学家曾经用多种不同的字来形容EDTA，例如将配体本身叫做EDTA4−，而它的共轭酸叫做H4EDTA。

配合物

EDTA和金属的螯合物，EDTA 和其他化合物如H2IDA（亚胺基二乙酸）和H3NTA（氨三乙酸）等属于同类的螯合物，这些配体都是由一种叫做甘氨酸的胺

基酸制成的。EDTA类的螯合物都极易溶于水。这些配体都为三或四齿配体，而合成出来的螯合物都是光学异构物。

用途

在1999年欧洲EDTA年消耗量为35,000吨，在美国为50,000吨，其重要的用途如下：

∙工业：清理重金属离子及Ca2+和Mg2+离子。

∙肥皂：与硬水中的Ca2+和Mg2+离子结合来降低硬度。

∙摄影：以Fe(III)EDTA作为氧化剂。

∙纺织品：与重金属结合。

∙食物：作为防腐剂来避免重金属的氧化。

∙化妆品：加上EDTA 来保存化妆品。

∙油生产：加上EDTA 来防止矿物沈淀。

∙牛奶：清洗牛奶瓶。

∙氮氧化物：废气的处理。

∙生物医学：

o汞毒治疗：使用EDTA的二钠钙盐-乙二胺四乙酸二钠钙[3]（EDTA Na2-Ca）治疗重金属中毒。可治疗汞中毒的人，也可治疗铅中毒

的人。利用EDTA与重金属结合的特性，生成穏定而可溶的盐，

随尿液排出。

o检验医学：作为血液等液体类标本的抗凝剂（如全血细胞计数时所采用的血液标本）。

o牙医学：在根管治疗术中用来清除一些有机或无机的物质。

o生物化学：在分子生物学中用EDTA 来防止金属离子对酶的影响

[4]。