基础生化实验-蛋白质纯化
蛋白质的分离纯化
蛋白质的分离纯化蛋白质是生命体中最基本的分子之一，它在细胞内发挥着重要的功能。
由于蛋白质的复杂性和多样性，研究人员通常需要从复杂的混合物中分离和纯化蛋白质。
蛋白质的分离纯化是生物化学和生物技术领域中非常重要的一项工作，它为我们深入研究蛋白质的结构和功能提供了必要的条件。
蛋白质的分离纯化可以通过多种不同的方法实现，这些方法包括离心法、凝胶过滤法、电泳法、层析法等。
在选择合适的方法时，研究人员需要考虑到蛋白质的特性以及实验的要求。
离心法是最常用的分离方法之一，在离心过程中，通过调整离心力和离心时间，可以实现不同密度的蛋白质的分层。
这种方法适用于分离大分子量的蛋白质。
凝胶过滤法是利用孔径不同的凝胶将蛋白质分离开来。
通常使用的凝胶有琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶，这些凝胶具有不同的孔径，可以根据蛋白质的分子量选择合适的凝胶进行分离。
电泳法是基于蛋白质的电荷和分子量差异而进行分离的方法。
最常用的电泳方法是SDS-PAGE电泳，通过使用SDS（十二烷基硫酸钠）对蛋白质进行解性和蛋白质间的形成复合物，使得蛋白质在电泳过程中仅仅受到电场力的影响，从而实现蛋白质的分离。
层析法是一种利用物质在载体上的分配和吸附性质进行分离的方法。
常见的层析方法有凝胶层析、亲和层析、离子交换层析等。
凝胶层析是通过利用载体颗粒的孔径进行分离，亲和层析是将特定配体固定在载体上，与目标蛋白质结合，从而实现分离，而离子交换层析是利用载体表面电荷与目标蛋白质的电荷相互作用进行分离。
在进行蛋白质的分离纯化时，需要注意以下几个关键步骤。
首先是样品制备，通常样品要经过细胞破碎、蛋白质提取等步骤，使得目标蛋白质从复杂的混合物中提取出来。
其次是样品的处理，包括去除杂质、调整蛋白质的溶液环境等。
然后是选择合适的分离方法，根据蛋白质的特性和实验要求来确定最适合的方法。
最后是纯化过程中的监测和分析，通过使用各种蛋白质分析方法，如SDS-PAGE、Western blot等，来确定目标蛋白质的纯化程度和鉴定其存在。
生化实习报告
实习报告一、实习背景及目的随着科学技术的不断发展，生物技术在各个领域中的应用日益广泛，生化实验技术也成为了现代科学研究的重要手段。
为了提高自己的实践操作能力，将所学理论知识与实际相结合，我参加了本次生化实习。
本次实习旨在培养我们的实验操作技能、科学研究能力和团队协作精神，深入了解生物化学实验的基本原理和方法。
二、实习内容与过程实习期间，我们进行了多个生化实验，包括蛋白质的提取与纯化、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、酶活性测定等。
以下为部分实验的详细过程及结果：1. 蛋白质的提取与纯化(1) 实验原理：利用不同浓度的盐溶液对蛋白质进行分级沉淀， followed by washing and elution with specific buffers to obtain purified protein.(2) 实验过程：首先，将样品与适量的高盐溶液混合，充分搅拌，置于冰箱中沉淀过夜。
次日，离心弃去上清液，用低盐溶液洗涤沉淀，然后用特定缓冲液进行洗脱，收集洗脱液。
(3) 实验结果：通过透析、凝胶过滤和离子交换层析等方法，成功获得了较纯净的蛋白质。
2. SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(1) 实验原理：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种常用的蛋白质分离技术，通过蛋白质与SDS形成的复合物在电场中的迁移速率来实现分离。
(2) 实验过程：首先，制备SDS-聚丙烯酰胺凝胶，然后将样品与SDS溶液混合，加热使蛋白质变性。
接着，将混合液加载到凝胶上，进行电泳。
最后，用染色剂对凝胶进行染色，观察蛋白质带。
(3) 实验结果：通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，成功地将不同分子量的蛋白质分离，并观察到清晰的蛋白质带。
3. 酶活性测定(1) 实验原理：酶活性测定是通过测定酶催化反应的速率来评估酶活性的大小。
本实验采用紫外分光光度法测定酶活性。
(2) 实验过程：首先，准备酶溶液和底物溶液。
然后，将酶溶液与底物溶液混合，置于恒温振荡器中反应。
蛋白质生化技术实验报告
蛋白质生化实验报告生殖免疫研究所薛樱子学号：1133111003实验一溶液中蛋白质浓度的测定一光吸收法（测量范围：0.1—2mg）1实验原理：由于蛋白质中存在着含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸，它们具有吸收紫外光的性质，其吸收高峰在280nm波长处，且在此波长内吸收峰的光密度值OD280nm与其浓度成正比关系，故可作为蛋白质定量测定的依据。
纯蛋白的A280/A260为 1.8，纯核酸的A280/A260为2步骤：2.1）打开仪器的电源开关（接220V交流电），打开比色槽暗箱盖，选择光源，选档，选波长，用调零旋钮调暗电流至0 。
2.2）将空白对照样品和待测溶液装入石英比色杯2.3）将仪器的比色槽暗箱合上，比色槽处于蒸馏水（或校正缓冲液）校正位置，旋转光量调节器使电表指针正确处于0 。
2.4）拉出比色槽手柄拉杆使比色槽处于样品位置读数。
2. 5）在260nm和280nm分别读数（分别用缓冲液调0），根据上表查处相应蛋白浓度，根据喜事倍数计算原溶液蛋白浓度，根据体积计算总蛋白量。
3结果与分析：A280=0.571 A260=0.340根据公式：蛋白浓度=1.5 ×A280 —0.75 ×A260=1.5×0.571—0.75×0.340=0.6015也可以根据蛋白质和核算含量折算图表画出一条直线估算蛋白质的浓度。
结果说明我的蛋白样品浓度是0.6015mg/ml。
二Folin—酚法（测量范围：10-300ug/ml）1实验原理：在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。
Folin—酚试剂中的磷钼酸盐—磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深蓝色（钼兰和钨兰的混合物）。
在一定的条件下，蓝色深度与蛋白的量成正比。
2试剂：2.1）甲液：１，4%碳酸钠；2，0.2n氢氧化钠；3，1%硫酸铜；4,2%酒石酸钾钠。
1和2，4溶于500ml水中，然后和4以50：1混合。
提蛋白质的原理及步骤
蛋白质提取是一项基础实验，通常用于从组织或细胞中提取纯度较高的蛋白质样品，以便进行各种蛋白质研究。
常规的蛋白质提取步骤包括以下几个主要步骤：
1. 细胞或组织的裂解：将待提取的样品裂解以释放出蛋白质。
裂解方法取决于被裂解的细胞类型，可使用机械法、化学法、超声波或高压等方法进行裂解。
2. 蛋白质的分离：将蛋白质与非蛋白质组分进行分离，常用的方法有沉淀、过滤、离心和柱层析等。
3. 蛋白质的纯化：通过进一步的分离和纯化来获得高纯度的蛋白质。
这些步骤通常需要进行多次，每次都使用不同的方法来分离和纯化蛋白质。
提蛋白质的原理是基于蛋白质的化学和物理特性进行分离和纯化。
蛋白质分子量大小、电荷、亲水性等特性不同，容易与不同化学试剂、柱层析介质或生物酶相互作用。
通过调节这些条件和步骤，就可以使不同的蛋白质与其它组分分离出来，并得到纯度较高的蛋白质样品。
虽然蛋白质提取步骤较多，但因为各种蛋白质的特性不同，所以实验时需要根据需要选择不同的提取和分离方法以获得更理想的效果。
生物化学实验--蛋白质性质试验
（三）黄色反应 原理：蛋白质分子中含有苯环结构的氨基酸（如
酪氨酸、色氨酸等），于浓硝酸可反应并生成黄色物 质，此物质在碱性环境下变为桔黄色的硝基苯衍生物 硝醌酸等。
操作：取一支试管，加入1ml蛋白液及浓硝酸5滴。加 热，冷却后注意颜色变化。然后再加入10%NaOH溶液 1ml，颜色有什么变化？
（四）茚三酮反应 原理：蛋白质与茚三酮共热，产生兰紫色的还原茚三
操作：
1、尿素实验
取少量尿素晶体放在干燥的试管中，微火加热使其
熔化成液体，此时有氨气放出，可用湿润的试纸检验，
至液体重新结晶出现白色固体时，停止加热，冷却。然
后加10%NaOH溶液1ml，摇匀，再加2-4滴1% 混匀，观察有无紫色出现。
CuSO4溶液，
2、蛋白液实验
取蛋白液1ml，加10%NaOH溶液1ml，摇匀，再加2-4 滴1% CuSO4溶液，混匀，观察有无紫色出现。
荧光法gml不同种类蛋白最大吸收波长nm标准方法准确操作麻烦费时灵敏度低适用于标准的测定紫外分光光度280205灵敏快速不消耗样品核酸类物质有影响100010000540重复性线性关系好灵敏度低测定范围窄样品需要量大folin酚试剂750灵敏费时较长干扰物质多25050500595灵敏度高稳定误差较大颜色会转移bca50500562灵敏度高稳定干扰因素少费时较长蛋白质不同方法比较一实验原理一实验原理蛋白质或多肽分子中有带酚基酪氨酸或色氨酸在碱性条件下可使酚试剂中的磷钼酸化合物还原成蓝色生成钼蓝和钨蓝化合物
察结果。 （四）生物碱试剂沉淀蛋白质 取一支试管，加入蛋白液2ml及醋 酸4-5滴，再加饱和苦味酸数滴，
观察现象。
http://222.195.234.199/openclass 登录名：自己的学号 密码：自己的学号 大家先把电子版的实验报告作好，然后在
蛋白质提取与纯化技术
蛋白质提取与纯化技术选择材料及预处理以蛋白质和结构与功能为基础，从分子水平上认识生命现象，已经成为现代生物学发展的主要方向，研究蛋白质，首先要得到高度纯化并具有生物活性的目的物质。
蛋白质的制备工作涉及物理、化学和生物等各方面知识，但基本原理不外乎两方面。
一是得用混合物中几个组分分配率的差别，把它们分配到可用机械方法分离的两个或几个物相中，如盐析，有机溶剂提取，层析和结晶等；二是将混合物置于单一物相中，通过物理力场的作用使各组分分配于来同区域而达到分离目的，如电泳，超速离心，超滤等。
在所有这些方法的应用中必须注意保存生物大分子的完整性，防止酸、硷、高温，剧烈机械作用而导致所提物质生物活性的丧失。
蛋白质的制备一般分为以下四个阶段：选择材料和预处理，细胞的破碎及细胞器的分离，提取和纯化，浓细、干燥和保存。
微生物、植物和动物都可做为制备蛋白质的原材料，所选用的材料主要依据实验目的来确定。
对于微生物，应注意它的生长期，在微生物的对数生长期，酶和核酸的含量较高，可以获得高产量，以微生物为材料时有两种情况：（1）得用微生物菌体分泌到培养基中的代谢产物和胞外酶等；（2）利用菌体含有的生化物质，如蛋白质、核酸和胞内酶等。
植物材料必须经过去壳，脱脂并注意植物品种和生长发育状况不同，其中所含生物大分子的量变化很大，另外与季节性关系密切。
对动物组织，必须选择有效成份含量丰富的脏器组织为原材料，先进行绞碎、脱脂等处理。
另外，对预处理好的材料，若不立即进行实验，应冷冻保存，对于易分解的生物大分子应选用新鲜材料制备。
蛋白质的分离纯化一，蛋白质（包括酶）的提取大部分蛋白质都可溶于水、稀盐、稀酸或碱溶液，少数与脂类结合的蛋白质则溶于乙醇、丙酮、丁醇等有机溶剂中，因些，可采用不同溶剂提取分离和纯化蛋白质及酶。
（一）水溶液提取法稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂，通常用量是原材料体积的1-5倍，提取时需要均匀的搅拌，以利于蛋白质的溶解。
【生物化学】第八章 蛋白质的分离纯化
㈤、凝胶过滤层析技术
⒈ 基原理
概念（排阻层析，分子筛层析）： 当生物大分子通过装有凝胶颗粒 的层析柱时，根据它们分子大小 不同而进行分离的技术。 原理：凝胶颗粒内部具有多孔网 状结构，被分离的混合物流过层 析柱时，比凝胶孔径大的分子不 能进入凝胶孔内，在凝胶颗粒之 间的空隙向下移动，并最先被洗 脱出来； 比网孔小的分子能不同程度的自 由出入凝胶孔内外，在柱内经过 的路程较长移动速度较慢，最后 被洗脱出来。
⒊ 分配纸层析
纤维素吸附的水是固定相，展层用的有 机溶剂是流动相
层析时混合氨基酸在这两相中不断分配， 使他们分布在滤纸的不同位置上。
此项技术可用于氨基酸成分的定量定性 测定。
⒊ 分配纸层析
操作：点样→展层→显 色用茚三酮显色时，得到 一个滤纸层析谱。 定义：原点到氨基酸停 留点的距离与原点至溶剂 前沿之比称为Rf值。 只要把溶剂系统、温度、 滤纸型号等条件确定，则 每一种氨基酸的Rf值是一 个确定值。
⒊ 分析型超速离心机
XL-A分析型超速离 心机 主要技术指标： 检测波长范围 200nm800nm 转子最大转速 40000RPM
什么是酶的活性中心？ 三维结构上比较接近的少数特异的氨基酸残基参与底物的 结合与催化作用，这一与酶活力直接相关的区域称酶的活 性部位。 在很多酶的活性中心均有His残基参与，原因是什么? 酶蛋白分子中组氨酸侧链咪唑基pK值为6.0-7.0，在生理条 件下，一半解离，一半不解离，因此既可以做质子供体，也 可以做质子受体，可以作为广义酸碱共同催化反应。 胰凝乳蛋白酶活性中心的催化三联体是指哪三种氨基酸？
⑵ 按两相所处的状态分类 流动相有两种状态：
*液体作为流动相 *气体作为流动相 固定相也有两种状态： *固体吸附剂作为固定相 *以吸附在固体上的液体作为固定相
生化大实验实验报告范文
生化大实验实验报告范文一蛋白质提取、纯化及分析技术实验一多酚氧化酶（PPO）的分离提取一、材料与试剂（1）马铃薯（大约每小组200-300g）（2）试剂：0.03M磷酸缓冲液PH6.0(内含0.02m巯基乙醇，0.001mEDTA，5%甘油，1%的聚乙烯吡咯烷酮)配制时配某10倍的浓缩液1000ml；固体硫酸铵；0.03M磷酸缓冲液PH6.0（内含0.02m巯基乙醇，0.001mEDTA，0.005mMgCL2）配置时配。
（3）实验器械与仪器设备：试管与试管架；烧杯、玻璃搅棒；移液管、滴管等；试剂瓶；透析袋；过滤纱布；植物组织匀浆器；PH计和PH试纸；GL-20C高速冷冻离心机；DL-7A大容量低速冷冻离心机二、操作步骤1：粗酶提取：马铃薯组织按1：1（W/V）比例与0.03m磷酸缓冲液PH6.0（内含0.02M巯基乙醇，0.001mEDTA，5%甘油，1%聚乙烯吡咯烷酮）混合，匀浆4层后纱布过滤，滤液以6000rpm离心10min，弃除沉淀获得酶提取液。
2：盐析分级沉淀：在酶提取液中加入固体硫酸铵使其达到40%饱和度（边加边搅拌达到充分溶解），然后6000rpm离心20min弃除沉淀；离心上清液在加入固体硫酸铵达到70%饱和度（边加边搅拌达到充分溶解），再以6000rpm离心20min，弃除上清夜，收集粗酶沉淀。
沉淀用0.03M磷酸缓冲液PH6.0（内含0.02巯基乙醇，0.001MEDTA，0.005MMgCL2）溶解，装入透析袋中用0.02NKCL溶液透析至无硫酸铵根离子，获得粗酶液供上柱使用。
三、实验结果获得PPO粗酶液供上柱使用。
实验二柱层析纯化PPO一、材料与试剂试剂：0.02MTri-HCL缓冲液Ph7.4(内含0.001MEDTA)配制时配某10倍浓缩液1000ml;NaCL;聚已二醇；葡聚糖凝胶Sephade某G-200等；实验器械与仪器设备：试管与试管架、烧杯、玻璃搅棒、移液管、滴管等；试剂瓶、层析柱、pH计和pH试纸、恒流泵、梯度混合仪、核酸蛋白监测仪、GL-20C高速冷冻离心机、DL-7A大容量低速冷冻离心机二、操作步骤1．葡聚糖凝胶的处理、装柱及平衡（1）柱材处理称取一定量的Sephade某G-200干粉，加无离子水或蒸馏水浸泡溶胀48h,去掉悬浮的细微颗粒，为防止凝胶颗粒中的空气存在，影响层析效果，凝胶装柱前一定要将凝胶液中的气体除掉，其办法是将凝胶液放进抽滤瓶中，进行抽真空处理，直到凝胶液中没有气泡出现为止。
血清γ-球蛋白的分离纯化实验报告
血清γ-球蛋白的分离纯化实验报告血清γ-球蛋白的分离纯化一、目的与要求1、掌握分离纯化蛋白质的基本原理和基本过程。
2、熟悉盐析、离心、层析、电泳等生化基本技术在蛋白质分离纯化中的综合应用。
3、学会设计和制定分离纯化蛋白质的实验方案，技术路线，质量监控和保证措施。
二、实验原理血清蛋白有300多种，可粗略的分为清、球蛋白两大类，γ球蛋白只是球蛋白中的一个亚类。
欲用常规方法获得，可先用半饱和硫酸铵从血清中盐析出球蛋白，接着用葡萄糖凝胶G-25脱去球蛋白中的盐分最后用DEAE纤维素阴离子交换柱便可直接从脱盐的球蛋白溶液中分离纯化出γ球蛋白,其反应机理如下：C2H5H纤维素-O-(CH2)2-N(C2H5)2纤维素-O-(CH2)2-N+……H2PO4H++H2PO4DEAE纤维素离子交换柱COOHC2H5α、β、γ球蛋白NH2COOH经过盐析和脱盐的球蛋白液纤维素-O-(CH2)2-N+…α和βGPH6.3NH2交换到柱上的α和β-球蛋白H2PO4COOHγ-球蛋白NH3+被DEAE柱分离纯化的γ-球蛋白被柱层析交换结合的α球蛋白和β球蛋白，可通过增加洗脱液的离子强度或降低洗脱的pH值（也可两者同时改变），使其分部洗脱下来而被纯化。
纯化前后的γ球蛋白可用电泳方法进行比较鉴定。
三、仪器和材料仪器：离心机，1.5×40cm层析柱，层析架或滴定台，核酸-蛋白检测仪，部分收集器，紫外分光光度计，色谱柱，电泳槽，电泳仪。
材料：马血清，SephadexG-25×200g，DEAE-32×200g。
四、实验步骤（一）分离纯化步骤1、取3mL,4℃预冷血清，加入3mL4℃预冷的饱和硫酸铵。
边滴边摇。
2、静置大于10min后，3500rpm离心15min，弃去上清液，将沉淀溶于少量的生理盐水。
从中取0.5mL用于测定蛋白质含量。
3、将剩余的样品上SephadexG-25柱，用0.02mol/LpH6.5的NH4AC缓冲液洗脱，每管收集3mL，用于绘制洗脱曲线，选择颜色最深（即浓度最高管）的取0.5mL留待电泳用。
蛋白纯化技术路线
蛋白纯化技术路线
1.寻找来源：确定需要纯化的蛋白质所在的生物样品，可以是细胞提取物、细菌发酵液、动物组织等。
2.预处理：对样品进行预处理来去除非目标蛋白质和杂质，使目标蛋白更容易纯化。
常见的预处理方法包括超声破碎、离心、滤过等。
3.亲和层析：使用亲和层析柱选择性地结合目标蛋白质。
亲和层析柱可以根据目标蛋白质的性质选择，例如亲和剂可以是金属离子、抗体、某种结构域等。
目标蛋白质被结合到柱子上后，其他非目标蛋白质可以通过洗脱步骤洗脱下来。
4.尺寸排阻层析：利用蛋白质的分子量差异进行分离。
此步骤常用于去除亲和层析步骤中残留的杂质和非目标蛋白质。
5.离子交换层析：利用蛋白质在不同离子浓度条件下的电荷差异来实现分离。
在正负电荷基质之间的交换，可以根据蛋白质的电荷特性进行选择性结合和洗脱。
6.亲水性层析：利用蛋白质的亲水性差异进行分离。
亲水性层析可以通过调整盐浓度和pH值来选择性结合和洗脱目标蛋白质。
7.透析：用于去除层析步骤中使用的缓冲剂、杂质与目标蛋白之间的物质交换。
8.浓缩：用于将目标蛋白溶液浓缩至适当的浓度，以便于后续的研究操作。
9.纯化效果验证：使用蛋白质分析方法（如SDSPAGE、Westernblot等）来验证纯化的效果和目标蛋白质的纯度。
生化实验盐析法实验报告
一、实验目的1. 了解盐析法在蛋白质分离纯化中的应用原理。
2. 掌握盐析法的基本操作步骤。
3. 学会通过盐析法对蛋白质进行分离纯化。
4. 分析实验结果，探讨盐析法在蛋白质分离纯化中的优缺点。
二、实验原理盐析法是一种利用盐离子与蛋白质分子间的相互作用，使蛋白质从溶液中沉淀出来的方法。
当盐浓度增加时，盐离子与蛋白质分子争夺水分子，使蛋白质分子之间的氢键、疏水作用等相互作用减弱，导致蛋白质分子聚集并沉淀。
通过调节盐浓度，可以使不同蛋白质在不同盐浓度下沉淀，从而实现蛋白质的分离纯化。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 蛋白质样品：如鸡蛋清、牛奶蛋白等。
- 盐：如NaCl、KCl等。
- pH调节剂：如NaOH、HCl等。
- 水浴锅、移液器、离心机、pH计等。
2. 实验试剂：- 0.1mol/L KCl溶液。
- 1mol/L NaCl溶液。
- 0.1mol/L HCl溶液。
- 0.1mol/L NaOH溶液。
四、实验步骤1. 准备蛋白质样品：取一定量的蛋白质样品，加入适量的0.1mol/L KCl溶液，搅拌均匀。
2. 调节pH值：使用pH计检测溶液的pH值，如需调节，用0.1mol/L HCl或NaOH溶液进行调节。
3. 盐析：向蛋白质溶液中加入1mol/L NaCl溶液，边加边搅拌，观察蛋白质沉淀现象。
4. 离心：将沉淀的蛋白质离心，收集沉淀物。
5. 洗涤：向沉淀物中加入适量的0.1mol/L KCl溶液，搅拌，静置，再次离心，收集沉淀物。
6. 溶解：将洗涤后的沉淀物加入适量的0.1mol/L KCl溶液，溶解。
7. 分析：通过紫外-可见分光光度计检测蛋白质溶液的吸光度，分析蛋白质的纯度。
五、实验结果与分析1. 实验结果：- 加入1mol/L NaCl溶液后，蛋白质溶液中出现白色沉淀。
- 离心后，沉淀物为白色固体，溶解后溶液呈透明状。
- 紫外-可见分光光度计检测结果显示，蛋白质溶液的吸光度与蛋白质浓度呈线性关系。
蛋白质纯化实验方案与应用
蛋白质纯化实验方案与应用蛋白质纯化的步骤通常包括以下几个方面：初步纯化、分离和纯化以及终点纯化。
初步纯化是指通过一系列简单的预处理步骤，如澄清、沉淀或去除其它成分来将目标蛋白质从混合物中分离出来。
基于目标蛋白质的物理性质和特征，可以选择不同的方法进行初步纯化，如沉淀、离心、过滤、超滤等。
分离和纯化是指将初步纯化得到的目标蛋白质进一步分离并提高纯度。
常用的方法包括色谱技术（如凝胶过滤、离子交换、亲和层析、凝胶电泳等）和电泳技术（如SDS-、IEF等）。
终点纯化是指通过一系列高级技术和步骤进一步提高目标蛋白质的纯度，如高效液相层析、透析、冰冻干燥等。
蛋白质纯化实验的应用广泛，特别是在生物医药领域。
通过蛋白质纯化，可以制备得到高纯度的蛋白质样品，进而用于研究蛋白质的结构和功能，探究蛋白质在生物体内的作用机制以及与疾病发生发展的关联。
此外，蛋白质纯化也是生物医药制剂开发中不可或缺的一步，可以确保药物的纯度和安全性。
另外，蛋白质纯化还可用于工业生产中的酶、抗体、疫苗、血液制品等产品的制备。
在蛋白质纯化实验中，为了提高纯度和产率，并减少不必要的损失和污染，需要合理设计实验方案。
下面是一个常用的蛋白质纯化实验方案的示例：1.初步纯化-提取样品：将生物样本中的蛋白质溶解提取出来，去除其它成分。
-澄清：通过离心或滤过等方法去除大分子物质和固体杂质。
-浓缩：用浓缩设备或浓缩胶等方法将蛋白质溶液浓缩。
-洗脱：使用合适的缓冲液洗脱目标蛋白质。
2.分离和纯化-使用一种或多种分离技术（如色谱技术和电泳技术）将蛋白质纯化。
-根据蛋白质的性质和特征，选择适当的分离方法和条件，如酸碱度、温度、流速等。
-根据分离结果，收集含有目标蛋白质的样品，排除不需要的成分。
3.终点纯化-使用高级技术和步骤进一步提高目标蛋白质的纯度。
-使用高效液相层析技术（如逆流层析、亲和层析等）和透析、冰冻干燥等方法进行终点纯化。
-最终得到高纯度的蛋白质样品。
“凝胶过滤层析法分离纯化蛋白质”生化实验报告
凝胶过滤层析法分离纯化蛋白质操作人：XXX 时间：XXXX 地点：XXXX 温度：20℃实验目的：①理解凝胶过滤层析的原理。
②掌握装柱、平衡、上样、柱效检验的方法。
③学会分析洗脱峰峰型。
试验方法与过程：1.装柱①固定层析柱，柱内装1/2双蒸水，双蒸水下降到1/4时，关闭出口。
②搅拌凝胶浆液，用玻璃棒引流缓慢倒入层析柱，打开出口，让凝胶沉降。
③装至柱内有2/3凝胶，上层保留至少0.5cm的水。
2.平衡双蒸水平衡柱，管口上接恒流泵、下管接检测仪入口，控制流速。
观察紫外检测仪平衡后A280应小于0.01.然后调整流速为2ml/min，暂停恒流泵。
3.加样吸取5%丙酮溶液500ul，沿柱壁缓慢加入，控制出水口管的高度使使样品缓缓进入胶内，用1ml双蒸水冲洗壁上的样品，在加入3-4ml双蒸水后关闭盖子。
4.洗脱凝集打开恒流泵开关，监视紫外检测仪的情况，待丙酮全部流出后加入，加入蛋白质混合物，监视紫外检测仪情况，开始出现上升即开始收集流出液。
蛋白质样品全部流出后，用双蒸水冲洗凝胶。
原始数据：图一：从左到右第一个峰为丙酮，第二第三个峰分别为混合物中的两种蛋白质。
结果处理与分析：①根据图像得As略大于1，说明装柱压力不足，可能滤网内有空气进入。
②由于是先加入丙酮再打开色谱分析软件，所以不能分析到分配系数Kd。
③在图一黑色箭头所指处色谱曲线出现了抖动，可能是因为在丙酮洗脱过程中打开了层析柱上口，导致空气进入。
④加入样品后出现两个峰，说明混合样品中有两种大小不同的物质被分离出来。
讨论：1.注意事项：一定要保证凝胶柱上层有液体覆盖，不能使之暴露于空气中；保证所灌凝胶中没有气泡，当有气泡和凝胶有明显分层时3，应在灌胶过程中及时用玻璃棒搅拌去除气泡及使不均匀的凝胶重悬后重新沉淀。
2.经验和心得：用滴管向凝胶柱内加入双蒸水和样品时，一定要沿管壁边旋转边缓慢加入，防止加入时产生压力太大，使凝胶柱上表面不平整；用滴管比用移液枪加样品好，因为滴管产生的压力小。
基础生化实验-蛋白质纯化
基础⽣化实验-蛋⽩质纯化蛋⽩质纯化⼀、⽬的:利⽤⾦属亲和性管柱(metal affinity column)来⼤量纯化带有affinity tag的基因重组蛋⽩。
⼆、原理:由于六个Histidine 所组成的His Tag (metal affinity tag)可与Ni2+ bind，所以利⽤基因重组技术在表现的蛋⽩质加上His Tag，再以⾦属亲和性管柱(Ni-NTA) (此His- tag序列可与带⼆价正电的阳离⼦相螯和)及liquid chromatography来⼤量纯化蛋⽩质。
三、试剂与器材:1.loading(binding) buffer (10mM imidazole,0.3M NaCl,50Mm Tris-HClPh7)细菌回溶成为蛋⽩质的载体以保持活性2.wash buffer (20mM imidazole,0.3M NaCl,50Mm Tris-HCl,Ph7)3.elution buffer (20mM EDTA,0.3M NaCl,50Mm Tris-HCl,Ph7)上课补充:蛋⽩质很脆弱，需要在特殊的buffer⾥。
四、仪器与设备:FPLC(速液相⾊谱仪)五、步骤:1.将管柱架在铁架上，把亲和性胶体悬浮装填于管柱内。
2.以2~3倍CV loading buffer清洗管柱后，注⼊蛋⽩质样本。
3.以wash buffer梳洗，2到3倍column体积。
4.⽤wash buffer和elution buffer进⾏线性梳洗，并收集流出液体，以FPLC UV monitor上的OD280数据读取样品流出与否，并观察冲离液之曲线图。
上课补充:胞内型分泌需要⽤超⾳波破菌，因为会放热所以要放在冰中使⽤。
线性梳洗为加⼊elution buffer会有颜⾊变化会把镍离⼦跟imidazole冲洗掉，剩下胶体溶液。
其中imidazole和Histidine类似也会和镍离⼦结合所以会竞争，可拿来洗涤蛋⽩质。
生化研究技术——生物化学实验原理-蛋白质(酶)、核酸的分
室温下，这些有机溶剂不仅能使蛋白质沉淀， 而且伴随着变性。若预先将有机溶剂冷却，然 后在不断搅拌下将其逐渐加入蛋白质溶液中， 防止有机溶剂局部浓度过高，则在很大程度上 解决变性问题。
▪ 不同的蛋白质由于水化层厚度不同，发生沉淀 需要的有机溶剂浓度不同，因此可利用不同浓 度的有机溶剂分离不同的蛋白质。
分段盐析
不同的蛋白质分子，由于其分子表面的极 性基团的种类、数目以及排布的不同，其水 化层厚度不同，故盐析所需要的盐浓度也不 一样，因此调节蛋白质中盐的浓度，可以使 不同的蛋白质分别沉淀。如：
(NH4)2SO4
血清
球蛋白
50%饱和度
析出
饱和
清蛋白
析出
（2）等电点沉淀
蛋白质是两性电解质，其溶解度与其净电荷数 量有关，随溶液pH变化而变化。在溶液pH值 等于蛋白质等电点时，蛋白质的溶解度最小。
一般动物组织和细胞可用电动捣碎机或匀浆器破碎或用 超声波处理破碎；
植物组织和细胞由于具有纤维素、半纤维素和果胶等物 质组成的细胞壁，一般常用与石英砂和适当的提取液一 起研磨的方法破碎或用纤维素酶处理也能达到目的；
细菌细胞的破碎比较困难，因为整个细菌细胞壁的骨架 实际上是一借共价键连接而成的肽聚糖囊状大分子，非 常坚韧。破碎的方法常有超声波震荡、与石英砂研磨、 高压挤压或溶菌酶处理（以分解肽聚糖）。
三、细胞器的分离
细胞器包括细胞核、线粒体、核糖体、内质网，植物细胞 还有叶绿体。
如果要分离制备分布在这些细胞器中的生物大分子，为了 防止其他细胞组分中的物质对制备物的干扰或污染，还需 先将细胞器分离出来，然后在某一细胞器中分离某一物质。
细胞器的分离一般采用差速离心法，即将破碎后的细胞在 适当的介质中进行离心，常用的介质有蔗糖、甘露醇、柠 檬酸、聚乙二醇等。各种细胞组分按质量大小的不同，经 过不同速度的离心后，沉降于离心管的不同部位，经多次 分步离心后，即可获得所需组分。
生物化学中的蛋白质表达和纯化
生物化学中的蛋白质表达和纯化蛋白质是细胞中最基本的生物大分子之一，具有重要的结构和功能作用。
在生化实验研究中，常常需要大量的蛋白质作为实验材料。
蛋白质表达和纯化技术是生物化学研究中的关键技术之一。
本文将简要介绍蛋白质表达和纯化的原理和方法。
一、蛋白质表达技术蛋白质表达是将目的基因转录成RNA后再翻译成蛋白质的过程。
蛋白质表达主要有原核细胞和真核细胞两种方法。
原核细胞表达系统主要利用大肠杆菌，真核细胞表达系统则使用哺乳动物细胞，其主要的表达技术有以下几种：（一）重组蛋白质大规模表达重组蛋白质是指人为构建的同源或异源蛋白序列，利用基因工程技术将其导入到表达宿主中进行高效表达的蛋白质。
大肠杆菌是目前最常用的宿主。
一般来说，要将目的基因插入到选择性表达载体中，选用合适的启动子和终止子，将目的蛋白质与标签结合。
表达宿主随后被转化，蛋白质在生长过程中表达出来，随后进行纯化和鉴定。
（二）GST融合蛋白表达GST融合蛋白是利用GST (glutathione S-transferase)标签的蛋白质，将GST和目的蛋白质融合在一起表达，然后通过Glutathione 亲和层析纯化方法纯化目的蛋白质。
GST融合蛋白可以提高目的蛋白质的稳定性和可溶性，使得其在细胞内表达更加稳定。
（三）His标签蛋白表达His标签是一种聚组氨酸标签，可以与Ni2+螯合，因此可采用Ni2+亲和层析的方法纯化。
His标签融合蛋白表达时选择了较少的氨基酸标签，对目标蛋白的生物学性质和功能影响较小。
二、蛋白质纯化技术蛋白质表达和纯化是蛋白质生物化学研究的关键。
通常情况下，表达宿主细胞中的蛋白质必须经过纯化才能得到纯净的蛋白质，获得足够高纯度的蛋白质可用于测定其结构和功能。
（一）离子交换层析法离子交换层析法是利用蛋白质负荷（或正荷）的离子性质与相应的离子交换质团之间进行选择性结合的纯化方法。
离子交换层析法分为阴离子交换层析和阳离子交换层析两种。
蛋白纯化岗位职责
蛋白纯化岗位职责职位概述蛋白纯化是生物制药领域中至关重要的一项工作，主要目的是从混合物中提取和纯化目标蛋白质。
蛋白纯化岗位处于研究开发管线的前端，负责开展蛋白质生产的关键环节，确保所生产的蛋白质具有高纯度和活性。
岗位职责1.进行蛋白质样品的制备：根据实验方案，合理选择培养基和培养温度，培养目标蛋白质的表达宿主，并利用细胞破碎、离心等技术，制备蛋白质样品。
2.选择合适的纯化方法：根据蛋白质的物理、化学性质，选择最适合的纯化方法，常用的纯化技术包括亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤层析等。
3.进行蛋白纯化操作：根据实验方案和工艺流程，利用所选择的纯化方法，对蛋白质样品进行纯化操作。
包括样品加载、洗脱、洗涤、浓缩和储存等步骤。
4.分析纯化后的蛋白质：利用一系列生化分析技术如SDS-PAGE、Western blot、质谱等，对纯化后的蛋白质进行检测和分析，确认蛋白质的纯度和活性。
5.文档记录：及时、准确地记录实验数据、实验步骤和结果等信息，编写实验方案、实验报告，标注样品信息并进行文档归档。
6.设备维护和安全操作：保护和维护实验室设备，确保设备正常运行，参与实验室安全管理工作，遵守实验室操作规程和安全操作要求。
7.与其他团队成员协作：与研发部门、质控部门等密切合作，共同解决实验过程中的问题，提供技术支持和新方法的改进意见。
职位要求1.学历背景：生物技术、生物化学或相关领域的本科及以上学历。
2.专业知识：具备扎实的生物学、生物化学、蛋白质学等相关专业知识，了解蛋白质表达、纯化、分析等技术。
3.实验技术：熟练运用常见的生物制药实验技术，如细胞培养、蛋白质纯化和分析方法等。
4.仪器设备：熟悉常见的生物制药实验仪器设备的使用和维护。
5.数据分析：具备较强的数据分析和解释能力，熟悉Excel、GraphPadPrism等数据分析软件的使用。
6.团队协作：具备良好的团队合作精神，善于沟通，能够与其他团队成员有效协作，解决实验中的问题。
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蛋白质纯化一、目的:利用金属亲和性管柱(metal affinity column)来大量纯化带有affinity tag的基因重组蛋白。
二、原理:由于六个Histidine 所组成的His Tag (metal affinity tag)可与Ni2+ bind，所以利用基因重组技术在表现的蛋白质加上His Tag，再以金属亲和性管柱(Ni-NTA) (此His- tag序列可与带二价正电的阳离子相螯和)及liquid chromatography来大量纯化蛋白质。
三、试剂与器材:1.loading(binding) buffer (10mM imidazole,0.3M NaCl,50Mm Tris-HClPh7)✧细菌回溶成为蛋白质的载体以保持活性2.wash buffer (20mM imidazole,0.3M NaCl,50Mm Tris-HCl,Ph7)3.elution buffer (20mM EDTA,0.3M NaCl,50Mm Tris-HCl,Ph7)上课补充:✧蛋白质很脆弱，需要在特殊的buffer里。
四、仪器与设备:FPLC(速液相色谱仪)五、步骤:1.将管柱架在铁架上，把亲和性胶体悬浮装填于管柱内。
2.以2~3倍CV loading buffer清洗管柱后，注入蛋白质样本。
3.以wash buffer梳洗，2到3倍column体积。
4.用wash buffer和elution buffer进行线性梳洗，并收集流出液体，以FPLC UV monitor上的OD280数据读取样品流出与否，并观察冲离液之曲线图。
上课补充:✧胞内型分泌需要用超音波破菌，因为会放热所以要放在冰中使用。
✧线性梳洗为加入elution buffer会有颜色变化会把镍离子跟imidazole冲洗掉，剩下胶体溶液。
✧其中imidazole和Histidine类似也会和镍离子结合所以会竞争，可拿来洗涤蛋白质。
(可详见问题一及补充资料2)六、问题:问题一: Imidazole的结构与特性。
Imidazole又名咪唑即1,3-二氮唑，是一个五元杂环芳香性有机化合物，化学式C3H4N2。
它也是一个生物碱。
白色或浅黄色固体结晶，可溶于水、氯仿、醇、醚，具有酸性，也具有碱性。
氢原子在两个氮原子之间移动，因此存在两个互变异构体。
咪唑环结构在生物分子中广泛存在，例如组氨酸和对应的荷尔蒙组胺。
很多药物也包含有咪唑环，例如硝基咪唑和咪唑类抗真菌药物。
结构与性质咪唑为平面五元环状化合物，易溶于水（以无限比例）和其它极性溶剂。
咪唑的两个氮原子间存在永久偶极，极性很强，偶极矩为3.61D，并且分子间存在氢键缔合，导致了咪唑具有反常高的沸点（256°C）。
分子中存在一个6电子共轭大π键，故具有典型的芳香性。
与氢以σ键相连的氮原子提供一对电子，环内其余四个原子各提供一个电子成键。
1N上有氢的咪唑环中，氢原子可以在两个氮原子间迁移，存在两个互变异构体，C-4和C-5是等同的。
这两个互变异构体无法分离，当有取代基时，常以「4(5)-取代咪唑」（如4(5)-甲基咪唑）来命名。
组氨酸生成组胺的反应如下所示：咪唑一个用途是在金属螯合亲和层析(IMAC)中用于His标签蛋白的纯化。
标签蛋白与层析柱表面珠孔内的镍离子介质发生结合，过量的咪唑通过层析柱，将与镍配位的标签蛋白洗脱下来，得到高纯度的目标蛋白。
咪唑是许多药品的重要组成部分。
许多杀菌剂和抗真菌、抗原虫和抗高血压的药物中含有合成咪唑。
咪唑是茶叶和咖啡豆中含有的茶碱分子的组成部分，具有刺激中枢神经系统的作用。
通过干扰DNA的活动抑制白血病的抗癌药物巯嘌呤中也含有咪唑。
问题二:2.ETDA的资料(整理)EDTA又名乙二胺四乙酸(Ethylene Diamine Tetraacetic Acid)简称：EDTA俗名；依地酸（特别是它的钙盐络合物，医学上称为依地酸钠钙）分子量：292.248分子式：C10H16N2O8为白色无臭无味、无色结晶性粉末，熔点240℃(分解)。
不溶于冷水、醇及一般有机溶剂，微溶于热水，溶于氢氧化钠，碳酸钠及氨的溶液中，能溶于160份100℃沸水。
为一种有机化合物。
它是一个六齿配体，可以螯着多种金属离子。
它的4个酸和2个胺的部分都可作为配体的齿，与锰（II）、铜（II）、铁（III）及钴（III）等金属离子组成螯合物化学家曾经用多种不同的字来形容EDTA，例如将配体本身叫做EDTA4−，而它的共轭酸叫做H4EDTA。
配合物EDTA和金属的螯合物，EDTA 和其他化合物如H2IDA（亚胺基二乙酸）和H3NTA（氨三乙酸）等属于同类的螯合物，这些配体都是由一种叫做甘氨酸的胺基酸制成的。
EDTA类的螯合物都极易溶于水。
这些配体都为三或四齿配体，而合成出来的螯合物都是光学异构物。
用途在1999年欧洲EDTA年消耗量为35,000吨，在美国为50,000吨，其重要的用途如下：∙工业：清理重金属离子及Ca2+和Mg2+离子。
∙肥皂：与硬水中的Ca2+和Mg2+离子结合来降低硬度。
∙摄影：以Fe(III)EDTA作为氧化剂。
∙纺织品：与重金属结合。
∙食物：作为防腐剂来避免重金属的氧化。
∙化妆品：加上EDTA 来保存化妆品。
∙油生产：加上EDTA 来防止矿物沈淀。
∙牛奶：清洗牛奶瓶。
∙氮氧化物：废气的处理。
∙生物医学：o汞毒治疗：使用EDTA的二钠钙盐-乙二胺四乙酸二钠钙[3]（EDTA Na2-Ca）治疗重金属中毒。
可治疗汞中毒的人，也可治疗铅中毒的人。
利用EDTA与重金属结合的特性，生成穏定而可溶的盐，随尿液排出。
o检验医学：作为血液等液体类标本的抗凝剂（如全血细胞计数时所采用的血液标本）。
o牙医学：在根管治疗术中用来清除一些有机或无机的物质。
o生物化学：在分子生物学中用EDTA 来防止金属离子对酶的影响[4]。
∙汽水：汽水中含有的维生素C和苯甲酸钠有机会产生致癌物质苯，可以EDTA来处理。
∙水的测试：测试水的硬度。
环境问题EDTA 不能在污水处理中被分解，不过在控制着pH值的情况下，经长时间后EDTA 就会几乎完全反应了，当其时要将其他微生物抽离，来让EDTA 完成结合的过程。
在水中，太多或太少的螯合物都会影响浮游生物和藻类的数量，可以是增加或者减少。
EDTA 对细菌来说是有毒的，在哺乳类动物的粪便中会破坏生物的细胞膜。
问题三:Tris-HCL是甚么?答:Tris-HCl是三羟甲基氨基甲烷盐酸盐的英文名称的缩写, 用作生物缓冲剂,添加剂英文名Tris(hydroxymethyl)aminomethane hydrochloride别名2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol hydrochloride; Tromethanehydrochloride; Trizma hydrochloride别名:2-氨基-2-羟甲基-1,3-丙二醇盐酸盐三羟甲基氨基甲烷盐酸盐分子式:C4H11NO3.HCl分子量:157.59物理化学性质熔点:150-152°C为水溶性SOLUBLE结构式:pKa ( 25℃ ):pH ( 0.5M in water ) 3.5 ~ 5.0问题四:为何使用UV波长为280 nm?答:一般有机物质，对于波长在250 nm 以下的光才有吸收作用，但含有苯环的胺基酸(aromatic amino acids)，对于波长250 nm 以上的光却有吸收作用。
凡含有此等胺基酸的蛋白质，其水溶液对于波长在260 nm至290 nm (通常取280 nm波长)之光，均有吸收作用，其吸收量与蛋白质溶液的浓度成正比。
所以含有phenylalanine、tyrosine或tryptophan的蛋白质，均可采用此法来定量。
利用UV光OD280(波长280nm)可侦测蛋白质的特性，可以将从管柱流出的蛋白质绘出吸收峰图型，在对照圆盘内所收集纯化蛋白质的tube，搭配蛋白质电泳SDS-PAGE观测，取自tube内的液体进行蛋白质电泳，可以更加确定蛋白质的分子量及纯度。
七、补充资料:1. 快速液相色谱仪(FPLC)利用快速液相色谱仪搭配不同性质和特性的纯化蛋白质用的管柱，依照研究目标蛋白质的特性，可以从已破菌的菌液中分离出来。
纯化蛋白质用的管柱，可以分为:亲和性管柱：经典代表为镍金属的树脂，当将研究目标在其蛋白质的头尾端，加上6个His(与镊金属结合形成敖合物)，之后在利用与His类似的化合物，与镍金属结合的蛋白质竞争，进而分离出带走6个His的研究目标蛋白质✧分子筛管柱: 可以依照分子量大小不同，导致流出管柱的时间点不同来分离✧离子树质管柱：利用蛋白质在不同pH值下，会使蛋白质改变其本身的电荷，来达到吸附管柱的效果，将研究目标蛋白质与其他大肠杆菌本身所携带的蛋白质分离。
←快速液相色谱仪(FPLC)2.组胺酸(Histidine)组胺酸缩写:His, H化学式:C6H9N3O2摩尔质量:155.16 g·mol−1p K a2 = 6.0 (咪唑环)而这次实验所使用的六个Histidine结构与镍离子结合如下图3.螯合物与螯合剂螯合物又称内络合物，是螯合物形成体（中心离子）和某些合乎一定条件的螯合剂（配位体）配合而成具有环类架构的配合物。
“螯合”即成环的意思，犹如螃蟹的两个螯把形成体（中心离子）钳住似的，故叫螯合物。
形成螯合物的第一个条件是螯合剂必须有两个或两个以上都能给出电子对的配位原子（主要是N，O，S等原子）。
第二个条件是每两个能给出电子对的配位原子，必须隔着两个或三个其他原子，因为只有这样，才可以形成稳定的五原子环或六原子环。
例如，在氨基乙酸根离子（H2N-CH2-COO-）中，给出电子的羟基氧和氨基氮之间，隔着两个碳原子，因此它可以形成稳定的具有五原子环的化合物。
常用的螯合剂是氨螯合剂，是一类似以氨基二乙酸[HN（CH2COOH）2]为基体的螯合剂，它以N，O为螯合原子，与金属离子螯合时形成环类的螯合物常用的氨羧螯合剂有︰1.氨羧螯合剂Ⅰ（ATA）指的是氨三乙酸2.氨羧螯合剂Ⅱ（EDTA）指的是乙二胺四乙酸。
EDTA是应用最广的一种氨羧螯合剂，用EDTA标准液可以滴定几十种金属离子，这个方法就称EDTA滴定法。
目前所谓螯合滴定法主要是指EDTA滴定。