第四章单克隆抗体与基因工程抗体的制备

～天出现克隆 筛选 挑克隆
（四）杂交瘤细胞的选择性培养
酶与酶： 次黄嘌呤磷酸核糖转化酶 胸腺嘧啶核苷激酶
应用液： 杂氮鸟嘌呤 聚乙二醇
培养基： （）:次黄嘌呤 （）：氨基喋呤；叶酸拮抗物，阻断合成主 要途径 ()：胸腺嘧啶核苷；“核苷酸前体”，供细胞 通过替代途径合成
选择作用： 淋巴细胞：不能生长，天死亡；合成的主 要途径被阻断 骨髓瘤细胞：不能生长，天死亡；缺乏， 合成的替代途径受阻
细胞冷冻的意义
防止污染 避免染色体丢失 防止非分泌细胞的过度生长 防止细胞密度过高而死亡
第二节 单克隆抗体的制备
经过反复克隆化获得的抗体阳性杂交瘤 细胞株应立即扩大培养（除及时冻存的细胞 外）。因多次传代易引起染色体逐渐丢失而 使细胞产生抗体能力逐渐减弱甚至消失，还 应尽早使用获得的抗体阳性杂交瘤细胞株制 备单克隆抗体。
动 物： 小鼠 ～周龄 ～体重
免疫小鼠
细胞性抗原： （）×只，不加佐剂，周重复一次 可溶性抗原： 首次，完全福氏佐剂微克抗原，周微克抗原，融合 前天，加强免疫
淋巴细胞
。
淋巴细胞发育
。
浆细胞
。
抗原接种
。
（三）细胞融合
培养液： 培养液 培养液
细胞融合剂： :分子量 的是最常用的细胞融合剂 作用机理：诱导细胞膜上脂类物质结构重排，使 细胞膜易打开而有助于细胞融合 作用特点：随机发生的，不同厂商、批号、分子 量的，其纯度与毒性有所不同
化学交联
分别分离纯化两种不同的，使各抗体解离 为单价抗体，再使两种不同抗原特异性的单价 抗体通过化学试剂交联起来，然后分离出目的 组分。此法缺点是容易导致抗体失去活性，产 物均一性不佳。
细胞工程
将两种分泌不同特异性单抗的杂交瘤细胞进行再次 融合，产生四源杂交瘤 ()。但二次杂交瘤细胞株分泌的 是两套重链，轻链的随机组合物。在其中的比例可为～ 不等。多倍杂交瘤细胞的稳定性差，的产量少且活性低， 费时费力，临床应用时存在人抗鼠抗体免疫反应 ()，因 此不适用于临床。
局限性 ： 固有的亲和性和局限的生物活性限制了它的应用范围 反应强度不如多克隆抗体 制备技术复杂、费时费工、价格较高
与的比较
抗原要求 得量 特异性 稳定 沉淀反应 成本
பைடு நூலகம்
可以不纯 高 高 低 无 高
纯度高 低 低 高 有 低
第三节 基因工程抗体制备
基因工程抗体( ) 根据研究者的意图，采用基因工程方法，在
增加
免疫沉淀
二、蛋白质的提纯
单克隆抗体是亲和层析中重要的配体。将单克隆 抗体吸附在一个惰性的固相基质（如 、、等）上，并 制备成层析柱。当样品流经层析柱时，待分离的抗原 可与固相的单克隆抗体发生特异性结合，其余成分不 能与之结合。将层析柱充分洗脱后，改变洗脱液的离 子强度或，欲分离的抗原与抗体解离，收集洗脱液便 可得到欲纯化的抗原。
噬菌体抗体库
构建噬菌体抗体库
① 从外周血或脾、淋巴结等组织中分离淋巴细胞，提取并逆 转录为；
② 应用抗体轻链和重链引物，根据建库的需要通过技术扩增 不同的基因片段；
③ 构建噬菌体载体。噬菌体抗体库载体有λ噬菌体、丝状噬 菌体和噬菌粒三种，其中后二者是目前构建表面表达的噬 菌体抗体库( )常用载体；
基因连接，插入适当表达载体，转染宿主细胞，表达人鼠 嵌合抗体 特点：
减少了鼠源性抗体的免疫原性 保留了亲本抗体特异性结合抗原的能力
嵌合抗体
（二）改型抗体
定义：指利用基因工程技术，将人抗体可变区（）中互补 决定簇（）序列改换成鼠源单抗序列。重构成既具有鼠源 性单抗的特异性又保持抗体亲和力的人源化抗体。亦叫 “重构型抗体”，因其主要涉及的“移植”，又可称为 “移植抗体 意义：多种特异的鼠源单抗有可能应用于临床治疗
抗体种类： 第一代抗体 多克隆抗体（ ) 第二代抗体 单克隆抗体（ ) 第三代抗体 基因工程抗体（ )
淋巴细胞:寿命短,分泌 特异系性抗体 骨髓瘤细胞：寿命长 杂交瘤细胞：寿命长， 单克隆抗体
一、杂交瘤技术
流 程
（一）小鼠骨髓瘤细胞
不产生的重链和轻链 与提供淋巴细胞的动物品系相同
（二）免疫脾细胞
多头加样枪
免疫荧光法
。
的纯化
盐析沉淀 亲和层析 离子交换层析
三、 单克隆抗体的性质鉴定
类型、亚类测定：双扩法或法 特异性测定：抗原类似物的交叉反应 效价测定：用腹水或培养液的稀释度表示 表位测定：几株单抗是否为不同表位特异的,用竞 争抑制 法，相加指数法及微机集群分析 亲和性测定：测定亲和常数 杂交瘤细胞染色体：秋水仙素裂解法，小鼠细胞染色体条， 细胞条，杂交瘤细胞一般多条 靶抗原分子量：常用
④ 表达载体转化细菌，构建全套抗体库。通过多轮的抗原亲 合吸附洗脱扩增，最终筛选出抗原特异的抗体克隆。
（二）噬菌体抗体库技术的特点
模拟天然全套抗体库 抗体文库可以达到或超过库容,能包含细胞全部克隆 建库的外源基因来自人体多克隆细胞的总 通用引物具有人的种属普遍性 抗体的和基因的随机重组也增加了抗体的多样性
第四章 单克隆抗体与基因工程抗体的制备
第一节 杂交瘤技术的基本原理 一、杂交瘤技术 二、阳性杂交瘤细胞的克隆化培养与冻存
第二节 单克隆抗体的制备 一、单克隆抗体的产生 二、单克隆抗体的纯化 三、单克隆抗体的性质鉴定 四、单克隆抗体的特性
第三节 基因工程抗体制备 一、人源化抗体 二、小分子抗体 三、抗体融合蛋白 四、双特异性抗体 五、噬菌体抗体库技术
（一）基本原理和程序
用扩增人抗体重链可变区()和轻链可变区()基因 克隆到噬菌体载体并以融合蛋白的形式表达在其外壳表面
用抗原抗体反应筛选出表达所需要抗体的克隆并扩增。 使抗体基因以分泌的方式表达，获得可溶性的抗体片段。
抗体库： 组合抗体文库：在建库过程中如果将和随机组合 人天然抗体库：抗体来源于未经免疫的正常人
基因水平，对免疫球蛋白基因进行切割、拼接或 修饰后导入受体细胞进行表达，产生新型抗体。 主要包括嵌合抗体、单链抗体、人源化抗体、双 价抗体和双特异性抗体。
一、人源化抗体
将小鼠基因敲除，转染人基因，在小鼠 体内产生人，再经杂交瘤技术，产生大量完 全人源化抗体
（一）嵌合抗体
方法： 从杂交瘤细胞分离出功能性可变区基因，与人恒定区
一、单克隆抗体的产生
动物体内诱生方法： 每次用或代小鼠，（～）×只 体外培养法： 中空纤维培养系统 单抗含量不高，牛血清难以去除
腹腔注射法
高滴度腹水
前天进行,预先腹腔注射 （～）×细胞 ～形成腹水
二、 单克隆抗体的纯化
可溶性抗原：抗体捕获法 细胞、亚细胞结构上的抗原：免疫荧光法 （用丙酮和甲醇按比例固定细胞）
第四节 单克隆抗体的应用 一、检验医学诊断试剂 二、蛋白质的提纯 三、小分子抗体的应用 四、抗体融合蛋白的应用 五、双特异抗体的应用 六、抗体库技术的应用和前景
思考题 小结
第一节 杂交瘤技术的基本原理
杂交瘤技术原理： 聚乙二醇（）：细胞融合剂，使免疫的小鼠脾 细 胞与小鼠骨髓瘤细胞融合 培养基的选择培养：反复的免疫学检测筛选克隆 化增殖的杂交瘤 细胞系 单克隆抗体生成：接种杂交瘤 细胞于小鼠腹腔， 腹水中即可得到高效价的单克隆抗体
四、单克隆抗体的特性
（一）单克隆抗体的特性
高度特异性 高度的均一性和可重复性 弱凝集反应和不呈现沉淀反应 对环境敏感性
（二）单克隆抗体的优点与局限性
优点 ： 在体外“永久”地存活并传代 用相对不纯的抗原，获得大量高度特异的、均一的抗 体。适用于以标记抗体为特点的免疫学分析方法 可用于体内的放射免疫显像和免疫导向治疗
骨髓瘤细胞、脾细胞与杂交瘤细胞
: ，; 长命 脾细胞: ， ;短命(天) 杂交瘤细胞 ，; 长命
杂交瘤细胞： 长期生长繁殖 利用淋巴细胞的，将合成为嘌呤碱并最 终与一起合成 从淋巴细胞获得产生某种抗体的遗传信 息 从骨髓瘤细胞获得不断繁殖的能力
二、阳性杂交瘤细胞的克隆化培养与冻存
有限稀释法( ) 显微操作法() 法（ ） 软琼脂平板法( )
四、抗体融合蛋白的应用
肿瘤的体内显像诊断 单链抗体排除速度快，穿透力强，在肿瘤组织中的分布 指数较完整抗体分子高 放射显像时，放射性核素排除较快，对身体危害程度小， 显像的本底较低 理想的显像定位诊断载体
病毒的诊断和抗病毒感染 血液性疾病的诊断
白血病的免疫诊断及分型
五、双特异抗体的应用
在体外免疫检测中的应用 自身红细胞凝集试验 快速检测和病原体等 避免化学交联减低两者的活性，从而提高酶免疫 检测的敏感度 用双特异抗体作为二抗，检测限达
二、小分子抗体
：抗原结合片断 ：可变区片段 ：单链可变区片段 ：单区抗体
小分子抗体
三、抗体融合蛋白 其它生物活性蛋白融合
四、双特异性抗体
许多抗原抗体反应要求双价的抗原结合位点，使抗原 分子上的两个表位交联或使两个抗原分子连接。将识别肿 瘤抗原的抗体和识别细胞毒性免疫效应细胞表面分子的抗 体连结在一起，可使效应细胞更容易与肿瘤细胞结合识别， 取得杀伤肿瘤细胞的作用。
饲养细胞
。
融合方法 骨髓瘤细胞与淋巴细胞()
内加完; 内加培养液
细胞融合
细胞与脾细胞的比例为：～ 的（无菌，预温℃）在分钟内滴完,静置秒,时间一到,将事
先准备的培养液一滴一滴加入,停止作用 根据细胞数量加入培养基，使之分加到孔板中时每孔细胞数 为（～）×个。融合后天，换用培养液
融合细胞的早期培养
在体内肿瘤放射免疫显像诊断中的应用 方法：
双特异抗体的一只臂结合靶抗原，一只臂结合半 抗原螯合剂，后者可选择性地与放射性核素结合， 利用二次导向系统显示 特点： 更高的的灵敏度和清晰度
在体内免疫治疗中的应用 抗体分子可与放射性核素、细胞毒药物、毒素、等多种 分子相融合，这些分子在抗体结合靶分子后可提供重要 辅助功能 双功能抗体可有效针对低水平的肿瘤相关抗原，并将细 胞毒物质输送到肿瘤细胞 抗体还可与携带药物的脂质体、各种偶联，从而增强体 内运输和药代动力学
三、小分子抗体的应用
定义： 分子量较小但具有抗原结合功能的分子片段 优点： 分子量小,穿透性强,抗原性低 不含段，不会与带有段受体的细胞结合，不良反应少 可在原核系统表达及易于基因工程操作 半衰期短，有利于及时中和及清除毒素
应用： 用于肿瘤的导向治疗 肿瘤的影像分布 基因治疗 细胞内抗体： 在细胞内表达 特异性识别某一基因产物 可干扰该基因产物的生物活性 研究基因结构与功能的关系
一、检验医学诊断试剂
病原微生物抗原、抗体的检测 肿瘤抗原的检测 免疫细胞及其亚群的的检测 激素测定 细胞因子的测定
病原体测定： 肝炎病毒－ －弓形虫,风疹病毒,巨细胞病毒 ，单
纯疱疹病毒 细胞表面测定：
白血病的分型
激素的测定： 内分泌疾病的诊断
药物测定()： 抗排斥药物抗肿瘤药物地高辛
研究工作中的探针： 越来越多未知功能的克隆 对复杂的基因功能和多肽蛋白功能的研究需求
有限稀释法
特点： 不需任何特殊设备 克隆出现效率高 实验室常用方法 方法： 细胞悬液通过系列稀释 每个培养孔含～个细胞
效率最高 价格昂贵
杂交瘤细胞的冻存与复苏
配制方案：杂交瘤细胞（（～）) 细胞冻存液(～ 牛血 清，～ 培养液， ) “慢冻”：分步冷冻，℃→℃→液氮 “快融”：取出立即浸入℃～℃水浴中，使其迅速融化、复 苏
基因工程
多采用抗体分子片段,如，或, 经基因操作修饰后,或体外组装为, 或直接表达分泌型的。
五、噬菌体抗体库技术
定义：将体外克隆的抗体基因片段插入噬菌体载体， 转染工程细菌进行表达，然后用抗原筛选即可获得 特异的单克隆噬菌体抗体。利用这一技术可以得到 完全人源性的抗体，在等病毒感染和肿瘤的诊断与 治疗方面有其独特的优越性
避开了人工免疫和杂交瘤技术 抗体库的大容量 抗体库极高的筛选效率 可获得高亲和力的人源化抗体 和基因的随机重组模拟了体内抗体亲和力成熟的过程 所用的抗体基因又来自人体
第四节 单克隆抗体的应用
检验医学诊断试剂 蛋白质的提纯 小分子抗体的应用 抗体融合蛋白的应用 双特异抗体的应用 抗体库技术的应用和前景
培养骨髓瘤细胞： 选择对数生长期的细胞进行传代培养 细胞形态：浑圆、透亮、均一、排列整齐 避免细胞返祖：定期用处理细胞 注意事项：切忌过多传代培养，可将细胞分装冻存于℃ 或液氮及干冰中
免疫脾细胞的制备：
×的淋巴细胞
无菌手术
饲养细胞： 细胞密度过低不利于细胞生长繁殖 常用小鼠腹腔细胞作饲养细胞 其中还有清除死亡细胞的作用 饲养存活一般不超过周，不影响杂交瘤细胞的 纯化