亲和纯化

配基和目标蛋白的可逆性亲和结合可表示为
E＋L E·L
结合常数
Keq

E L EL
结合常数越大，表示 亲和作用越强
其中：E、L和E·L分别表示蛋白、配基和二者形成的复合体。 Keq一般为104~108dm3/mol，太大(接近不可逆结合）洗脱回收困 难，太小则难于有效吸附目标物质。
第二节 亲和色谱原理
亲和吸附作用只有在特定配基的存在下才能实 现，多数情况下需根据目标产物选择合适的亲和 配基修饰固定相粒子，制备所需的亲和吸附介质。 进行外源凝集素的亲和纯化时，无需自制亲和吸 附介质。可直接选用商品化凝胶介质（含有糖基 介质）。
亲和吸附剂及其制备方法（p322）
❖ 载体的选择 ❖ 配基的选择
❖载体的选择
❖ 蛋白质参与亲和作用的机理
一般认为蛋白质的立体结构中存在结合位点， 呈凹陷或凸起结构。
具有亲和作用的分子间还需分子或原子水平的 各种相互作用，主要包括静电作用、氢键力、 疏水性相互作用、配位键、弱共价键等。
生物亲和作用是一种复杂的生物现象，这也是 亲和作用特异性高的主要原因。
二、影响亲和作用的因素
❖ 亲和作用体系的特异性
高度特异性体系：一对一关系，如抗原与其单克 隆抗体的结合、酶与底物的结合。
群特异性体系：大多数亲和体系，亲和作用不具 备绝对的特异性，如外源凝集素可与任何含有糖 基的蛋白质结合、酶与辅酶或金属辅基的结合。
在亲和纯化中，一般将亲和作用分子对中被固定的分子称为 亲和结合对象（一般为蛋白质）的配基（ligand)
❖ 1.离子强度(I↑，氢键力↓，亲和作用↓ ； I↑，疏水性 相互作用↑，亲和作用↑ ）
❖ 2.pH（根据蛋白质解离基团的pKa值而定,如解离基团为羧基，
pH应高于其pKa值，带电量最高，静电作用力大， pH严重影
响亲和作用，存在最佳pH，使亲和作用最大 ）
❖ 3.抑制氢键形成的物质(脲和盐酸胍会抑制氢键形成，亲和 作用↓ ）
第四节 亲和吸附平衡 （略）
第五节 亲和色谱过程分析
❖ 亲和色谱操作过程
上样吸附 清洗（洗涤） 洗脱 再生
1、进料吸附（p329)
亲和色谱操作中可能存在的两种吸附：
❖ 亲和吸附：亲和配基与目标分子间的特异性结合 （选择性高） ❖ 非特异性吸附：料液中各种溶质（包括目标产物）
载体 配基
吸附 (Adsorption)
洗脱 (Elution )
二、亲和色谱操作
❖步骤： ➢ 进样、吸附：含有目标产物的料液连续通过亲
和色谱柱，直至目标产物在色谱柱出口穿透为 止（与固定床吸附操作相似） ➢ 清洗：用清洗液（与原料溶解液的组成相同的 缓冲液）除去非特异性结合的杂蛋白 ➢ 洗脱：特异结合在配体上的靶蛋白最后可用能 使其与配基解离的溶液（洗脱液）洗下。 ➢ 再生：用清洗液清洗，使色谱柱的PH和离子强 度适合于亲和吸附
概述
❖ 生物亲和作用（bioaffinity）
定义： 生物分子能够区分结构和性质非常相近的其他分子， 选择性地与其中某一分子相结合，生物分子间的这种 特异性相互作用称为生物亲和作用或简称亲和作用。
通过亲和作用发生的结合称特异性结合（specific binding）或亲和结合（affinity binding）。
进样、吸附
清洗液
带有配体的树脂 珠（或胶粒）
洗脱液：含配 体溶液
洗下未结合的蛋白
收集目的蛋白
洗脱
吸附
清洗
时间
来自百度文库
❖ 注意事项
1.）当两种以上蛋白质同时被吸附时，可采用线性 梯度洗脱或逐次洗脱法分离 2）为提高分离度，应采取较小的进料量（远低于 发生穿透所需的进料量）
第三节 亲和色谱介质
❖ 制备亲和色谱介质的意义：
❖配基的选择
配基应具备的特性： 1.对于欲纯化的生物物质应具有专一亲和性 2.必须具备能被修饰的功能基团
配基可以是小分子物质：一些辅酶、辅基 大分子物质：酶、抗体
❖ 纯化酶的配基:底物、抑制剂、辅酶、辅基 等；
❖ 纯化抗原抗体的配基：互为配基 ❖ 纯 化 核 酸 的 配 基 ： DNA 和 RNA ， 蛋 白 质 和
mRNA
❖配基的固相化（亲和吸附介质）
固相化技术：将配基以共价键连接于不溶于 水的固相基质上制成固相化吸附剂
过程：载体活化、接臂 CNBr活化法 环氧基活化法 硅胶的活化
接臂：在配基与载体之间连接一个“间隔臂”，以增大小分 子配基与在载体之间的距离,克服载体空间位阻的影响，使 配基与生物大分子有效亲和结合
一、原理
常用的配基有抗体、抗原、 激素或受体蛋白、酶的底 物和抑制剂等
利用键合了亲和配基的亲和吸附介质为固定 相亲和吸附目标产物，不同蛋白质分子对固 定化在载体上的亲和配基具有不同的识别和 结合能力，根据亲和吸附作用力的差异，使 目标产物得到分离纯化的液相色谱法。
❖ 基本过程： 固相化
(Immobilise)
载体应具备的特征：
具有亲水性多孔结构，无非特异性吸附，比表面积大； 物理和化学稳定性高，有较高的机械强度，使用寿命长； 含有可活化的反应基团，用于亲和配基的固定化； 粒径均一的球形粒子。
可供选择的载体
❖ 琼脂糖凝胶
❖ 聚丙烯酰胺凝胶
❖ 葡聚糖凝胶
亲水性凝胶过滤介质均 可作为亲和配基的载体
❖ 4.温度（T ↑,疏水性相互作用↑;静电作用、氢键力、配位 键作用↓）
❖ 5.离液液体（离子半径大、电荷密度低的阴离子如SCN-, I，CLO4-等减弱疏水性作用，亲和作用↓ ）
❖ 6.鳌合剂（除去金属离子，影响配位键的形成，抑制亲和作 用
三、亲和作用体系
①酶：底物、底物类似物、抑制剂、辅酶、金 属离子； ②抗体：抗原、病毒、细胞； ③激素、维生素：受体蛋白、载体蛋白； ④外源凝集素：多糖、糖蛋白、细胞表面受体 蛋白、细胞； ⑤核酸（ DNA和RNA ）：互补碱基链段、组蛋 白、核酸聚合酶、核酸结合蛋白；
❖ 亲和纯化技术 定义：利用生物分子间的特异性结合作用（亲 和作用）的原理进行生物物质分离纯化的技术。 分类：亲和色谱技术、亲和膜分离技术、亲和 沉淀、亲和反胶团、亲和电泳等。
第一节 生物亲和 作用
一、亲和作用的本质
❖ 参与亲和作用的两个分子中，其中之一为蛋 白质的情况占绝大多数，或者两者均为蛋白 质。