细胞活力测定数据统计
细胞活力检测实验报告
一、实验目的细胞活力是细胞生物学研究中非常重要的指标，能够反映细胞在特定条件下的生长、代谢和功能状态。
本实验旨在通过多种方法检测细胞活力，了解细胞在不同条件下的生长情况，为后续实验研究提供依据。
二、实验材料1. 细胞：人胚胎肾细胞（HEK293）2. 试剂：台盼蓝染色液、CCK-8试剂盒、Resazurin细胞活力检测试剂盒、ATP含量测定试剂盒、细胞培养液、培养基、PBS缓冲液等3. 仪器：显微镜、酶标仪、细胞计数板、细胞培养箱、超净工作台等三、实验方法1. 台盼蓝染色法（1）将HEK293细胞以1×10^5个/孔的密度接种于96孔板中，培养24小时后进行实验。
（2）用PBS缓冲液洗涤细胞，加入适量的台盼蓝染色液，室温孵育5分钟。
（3）用PBS缓冲液洗涤细胞，观察细胞染色情况。
2. CCK-8试剂盒检测细胞活力（1）将HEK293细胞以1×10^5个/孔的密度接种于96孔板中，培养24小时后进行实验。
（2）弃去原培养液，加入100μl新鲜培养基。
（3）加入10μl CCK-8试剂，避光孵育2小时。
（4）用酶标仪检测450nm波长下的吸光度（OD值）。
3. Resazurin细胞活力检测试剂盒检测细胞活力（1）将HEK293细胞以1×10^5个/孔的密度接种于96孔板中，培养24小时后进行实验。
（2）弃去原培养液，加入100μl新鲜培养基。
（3）加入10μl Resazurin试剂，37℃孵育4小时。
（4）用酶标仪检测570nm和600nm波长下的吸光度（OD值）。
4. ATP含量测定法检测细胞活力（1）将HEK293细胞以1×10^5个/孔的密度接种于96孔板中，培养24小时后进行实验。
（2）弃去原培养液，加入100μl ATP含量测定试剂盒，室温孵育10分钟。
（3）用酶标仪检测560nm波长下的吸光度（OD值）。
四、实验结果与分析1. 台盼蓝染色法通过显微镜观察，活细胞不着色，死细胞被染成蓝色。
细胞计数及活力测定
2．细胞活力 ①将细胞悬液以0.5ml加入试管中。 ②加入0.5ml 0.4%台盼兰染液，染色2一3分钟。 ③吸取少许悬液涂于载玻片上，加上盖片。 ④镜下取几个任意视野分别计死细胞和活细胞数， 计细胞活力。 死细胞能被台盼兰染上色，镜下可见深兰色的细胞， 活细胞不被染色，镜下呈无色透明状。另外，活力 测定可以和细胞计数合起来进行，但要考虑到染液 对原细胞悬液的加倍稀释作用。
【作业与思考题】
1．根据实验结果，画出生长曲线。 2．试述用MTT法测定细胞生长曲线的过程及注意事项。 3．细胞接种的密度与细胞生长曲线的测量结果之间有 什么关系？ 4．为什么细胞计数时，细胞悬液逸出槽外时要重做？
Experiment 18
细胞计数及活力测定
【实验目的】
1．练习进行细胞计数，并用细胞计数法绘制生长 曲线，以了解培养细胞的生长发育特性 2．掌握测定细胞活力的方法
【实验目的】
培养的细胞在一般条件下要求有一定的密度才能生长 良好，所以要进行细胞计数。计数结果以每毫升细胞数表示。 细胞计数的原理和方法与血细胞计数相同。 在细胞群体中总有一些因各种原因而死亡的细胞，总 细胞中活细胞所占的百分比叫做细胞活力，由组织中分离细 胞一般也要检查活力，以了解分离的过程对细胞是否有损伤 作用。复苏后的细胞也要检查活力，了解冻存和复苏的效果。 用台盼兰染细胞，死细胞着色，活细胞不着色，从而 可以区分死细胞与活细胞。利用细胞内某些酶与特定的试剂 发生显色反应，也可测定细胞相对数和相对活力。
【注意事项】
1．细胞计数时的注意事项 ①消化单层细胞时，务求细胞分散良好，制成单个细胞悬液。否则 会影响细胞计数结果。 ②取样计数前，应充分混匀细胞悬液。在连续取样计数时尤应注意 这一点。否则，前后计数结果会有很大误差。 ③镜下计数时，遇见2个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计数。 如细胞团占10%以上，说明消化不充分。 ④细胞数少于200个/10mm2或多于500个/10mm2时，说明稀释不当， 需重新制备细胞悬液。 ⑤在计数板上盖玻片的一侧加微量细胞悬液时，加液量不要溢出盖 片，也不要过少或带气泡。 ⑥在计数过程中，对大方格的边缘压线细胞应按数上不数下，数左 不数右的原则进行计数。 2．MTT法的原理是测定细胞线粒体琥珀酸脱酶的活性，反映的是细 胞代谢和增殖活力，而非绝对的细胞数量。
细胞培养中死活细胞测定及细胞活力测定实验
细胞培养中死活细胞测定及细胞活力测定实验日期：2013-03-12 来源：未知标签：细胞活力测定摘要: 细胞培养过程中需要测定细胞的存活率以了解细胞的生长状态，鉴定细胞存活常用的方法有染色法和仪器分析法。
染色法可直接通过细胞形态，区别细胞死亡，它是一种简单的细胞存活鉴定方法。
这里总结下死活细胞测定及细胞活力测定实验原理、实验步骤及注意事项。
细胞培养过程中需要测定细胞的存活率以了解细胞的生长状态，鉴定细胞存活常用的方法有染色法和仪器分析法。
染色法可直接通过细胞形态，区别细胞死亡，它是一种简单的细胞存活鉴定方法。
这里总结下死活细胞测定及细胞活力测定实验原理、实验步骤及注意事项。
【实验原理】(一)染色法是常用的细胞死活鉴定方法，简便，易于操作。
实验是利用了死活细胞在生理机能和性质上的差异来进行的。
死活细胞在生理机能和性质上的差异主要体现在：(1)死活细胞细胞膜通透性的差异：活细胞的细胞膜是一种选择性膜，对细胞起保护和屏障作用，只允许物质选择性的通过;而细胞死亡之后，细胞膜受损，通透性增加。
(2)死活细胞在代谢上的差异：由于活细胞中新陈代谢的作用，使细胞内具有较强的还原能力，而死细胞或代谢缓慢的老细胞，则因它们的无还原能力或还原能力极弱。
常见的细胞染料有：中性红(细胞器的专有染料)、台盼蓝、甲基蓝、美蓝、荧光素双醋酸酯(FDA)等。
①中性红染色：常用染料之一，是细胞器的专有染料。
利用细胞膜的通透性差异，用来染原生动物和显示动植物组织中活细胞的内含物等。
中性红无毒，常做活体染色的染料。
②台盼蓝染色：当细胞损伤或死亡时，台盼蓝可穿透变性的细胞膜，与解体的DNA 结合，使其着色。
而活细胞能阻止染料进入细胞内。
故可以鉴别死细胞与活细胞。
严格来说，台盼蓝染色检测的是细胞膜的完整性，通常认为细胞膜丧失完整性，即可认为细胞已经死亡。
通过显微镜很容易就能识别出死亡的被台盼蓝染色的细胞，并可使用细胞计数器进行计数。
③美蓝染色法：美蓝是一种无毒性染料，它的氧化型是蓝色的，而还原型是无色的，用它来对活细胞进行染色，由于细胞中新陈代谢的作用，使细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝从蓝色的氧化型变为无色的还原型，所以活细胞无色，而对于死细胞或代谢缓慢的老细胞，则因它们无此还原能力或还原能力极弱，而被美蓝染成蓝色或淡蓝色。
mtt法测定细胞活力的原理
mtt法测定细胞活力的原理MTT法是一种常用的细胞活力测定方法，它通过测量细胞中还原MTT试剂的能力来评估细胞的生存和代谢活性。
MTT（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide）是一种黄色水溶性化合物，可被细胞内酶系统还原生成紫色的可溶性甲硫唑酮（formazan）晶体，这种生成的晶体可以用光谱法测定其吸光度，从而间接反映细胞的活力。
MTT法的原理基于细胞代谢活性和酶系统的相互作用。
正常活跃的细胞具有强大的代谢能力，其中含有还原酶（主要为线粒体中的NADH/NADPH依赖的酶）。
当细胞处于正常状态时，这些酶可将MTT试剂还原为可溶性甲硫唑酮（formazan）。
甲硫唑酮的形成需要细胞内的还原酶作用以及细胞内的线粒体呼吸产生的还原型辅酶NADH/NADPH。
因此，MTT法测定的是细胞内还原酶的酶活性以及细胞的氧化还原状态。
MTT法的具体步骤如下：1.培养细胞：将需要测定的细胞以适宜的细胞密度接种于培养皿中，使其在培养基中生长至合适的状态。
细胞的密度和培养时间可以根据实验需要进行调整。
2.甲硫唑酮的制备：将MTT试剂溶于PBS（磷酸盐缓冲液）中，摇晃使其完全溶解，准备工作台上的MTT溶液。
3.细胞处理：根据实验设计，给细胞添加待测物，如药物、激素等，使其暴露于不同的处理条件下。
4.添加MTT试剂：将上述处理后的细胞分别加入到含MTT试剂的培养基中，使细胞与MTT试剂接触。
5.孵育细胞：在适宜的温度和气体环境下，培养细胞和MTT试剂的混合物一段时间（通常为2～4小时），使细胞内酶系统完全还原MTT试剂为甲硫唑酮。
6.溶解甲硫唑酮：去除培养基，向培养皿中加入溶剂（一般为DMSO），使甲硫唑酮溶解。
DMSO具有良好的溶解MTT产物的能力。
7.吸光度测定：将溶剂溶液转移至96孔板或玻璃瓶中，使用酶标仪或分光光度计测定甲硫唑酮的吸光度。
细胞活力研究检测指标
细胞活力研究检测指标细胞活力研究通常涉及多种检测指标，以评估细胞的生理状态、代谢活性和功能。
以下是一些常见的检测指标：1. 细胞增殖能力：1)MTT（3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴化物）试验：通过测量活细胞中线粒体脱氢酶的活性来评估细胞增殖。
2)CCK-8（Cell Counting Kit-8）试验：类似于MTT，但使用水溶性四唑盐WST-8，减少了实验步骤。
3)BrdU（5-溴脱氧尿苷）掺入试验：通过检测BrdU在DNA合成期的掺入来评估细胞增殖。
2. 细胞存活率：1)细胞计数：直接使用血球计数板或自动细胞计数器计算活细胞数量。
2)台盼蓝染色：排除法，活细胞不会吸收台盼蓝，死细胞会被染成蓝色。
3. 细胞凋亡检测：1)Annexin V/PI染色：通过流式细胞仪检测细胞膜磷脂酰丝氨酸外翻和细胞膜完整性来识别早期和晚期凋亡细胞。
2)TUNEL（末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口标记）试验：检测DNA断裂，是细胞凋亡的标志。
4. 细胞周期分析：流式细胞仪：使用PI或Hoechst染料对DNA进行染色，分析细胞周期分布。
5. 细胞代谢活性：1)ATP含量测定：ATP是细胞能量代谢的重要指标。
2)乳酸脱氢酶（LDH）释放：衡量细胞膜完整性和细胞损伤程度。
6. 氧化应激指标：1)ROS（活性氧物种）检测：使用荧光探针如DCFH-DA进行检测。
2)抗氧化酶活性：如超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）等。
7. 蛋白质和基因表达：1)Western blot：检测特定蛋白质的表达水平。
2)qPCR（实时定量聚合酶链反应）：检测特定基因的mRNA表达水平。
8. 细胞信号通路活性：磷酸化蛋白检测：通过Western blot检测特定蛋白的磷酸化状态来评估信号通路的激活。
9. 细胞粘附和迁移能力：1)划痕试验：评估细胞迁移能力。
2)侵袭和迁移试验：使用Transwell小室评估细胞的侵袭和迁移能力。
MTT法测定细胞相对数和相对活力
MTT法测定细胞相对数和相对活力一、原理噻唑兰，简称MTT，可透过细胞膜进入细胞内，活细胞线粒体中的琥珀脱氢酶能使外源性MTT还原为难溶于水的蓝紫色的Formazan结晶并沉积在细胞中，结晶物能被二甲基亚砜（DMSO）溶解，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映细胞数量。
二、试剂材料准备与实验仪器1）对数生长期细胞2）受试因素（药物）3）MTT：以PBS配制成5mg./ml，抽虑除菌，保存在4˚C4）DMSO（二甲基亚砜）5）96孔板6）酶联免疫检测仪7）细胞培养箱三、实验步骤（实用于贴壁细胞）1）收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，分于96孔板，1×104/孔，细胞浓度可以调整。
2）置37℃、5%CO2温箱培养使细胞贴壁。
3）加入不同浓度的药物，如1、5、10、40、50、80、160、320mg/ml的药物，时间依据实验需要，一般3天。
4）小心吸去上清，PBS轻轻洗涤，再次离心，弃上清。
5）每孔加入180 ul新鲜RPMI 1640培养液，再加入20 ul MTT溶液（5 mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4 h。
6）终止培养（可离心，1000 rpm，10 min），小心吸去孔内培养液。
7）每孔加入150 ul二甲基亚砜（也可以用酸化异丙醇，10%SDS代替），置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。
在酶联免疫检测仪490 nm处测量各孔的吸光值。
8）同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜），每组设定3复孔。
三、结果统计学处理所有数值以x±s表示，应用SPSS软件进行方差分析，p<0.05时为相差显著，p<0.01时为相差非常显著。
可以以时间为横轴，光吸收值为纵轴绘制细胞生线，专门公式求IC50。
或计算抑制率。
四、注意事项与常见问题1）实验时应设置调零孔，对照孔，加药孔。
细胞计数及细胞活力检测
细胞计数
当待测细胞悬液中细胞均匀分布时，通过测定一定体积悬液中的细胞的数目，即可换算出每毫升细胞悬液中细胞的细胞数目。
1.将血球计数板及盖片用擦试干净，并将盖片盖在计数板上；
2.将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间；
3.静置3分钟；
4.镜下观察，计算计数板四大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的,然后按下式计算：
细胞数/ml＝4大格细胞总数/4×稀释倍数×104
注意：镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团占10%以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液。
细胞计数板
细胞活力测定
在细胞群体中总有一些因各种原因而死亡的细胞，总细胞中活细胞所占的百分比叫做细胞活力，由组织中分离细胞一般也要检查活力，以了解分离的过程对细胞是否有损伤作用。
复苏后的细胞也要检查活力，了解冻存和复苏的效果。
用台盼兰染细胞，死细胞着色，活细胞不着色，从而可以区分死细胞与活细胞。
1.将细胞悬液以0.5ml加入试管中；
2.加入0.5ml0.4%台盼兰染液，染色2-3分钟；
3.死细胞能被台盼兰染上色，镜下可见深兰色的细胞，活细胞不被染色，镜下呈无色透明状。
细胞存活率为：活细胞数÷总细胞数×100％。
注意：活力测定可以和细胞计数合起来进行，但要考虑到染液对原细胞悬液的加倍稀释作用。
MTT法测定细胞相对数和相对活力
MTT法测定细胞相对数和相对活力一、原理噻唑兰，简称MTT，可透过细胞膜进入细胞内，活细胞线粒体中的琥珀脱氢酶能使外源性MTT还原为难溶于水的蓝紫色的Formazan结晶并沉积在细胞中，结晶物能被二甲基亚砜（DMSO）溶解，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映细胞数量。
二、试剂材料准备与实验仪器1）对数生长期细胞2）受试因素（药物）3）MTT：以PBS配制成5mg /ml，抽滤除菌，保存在4˚C4）DMSO（二甲基亚砜）5）96孔板6）酶联免疫检测仪7）细胞培养箱三、实验步骤（适用于贴壁细胞）1）收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，分于96孔板，1×104/孔，细胞浓度可以调整。
2）置37℃、5%CO2温箱培养使细胞贴壁。
3）加入不同浓度的药物，如1、5、10、40、50、80、160、320mg/ml的药物，时间依据实验需要，一般3天。
4）小心吸去上清，PBS轻轻洗涤，再次离心，弃上清。
5）每孔加入180 ul新鲜RPMI 1640培养液，再加入20 ul MTT溶液（5 mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4 h。
6）终止培养（可离心，1000 rpm，10 min），小心吸去孔内培养液。
7）每孔加入150 ul二甲基亚砜（也可以用酸化异丙醇，10%SDS代替），置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。
在酶联免疫检测仪490 nm处测量各孔的吸光值。
8）同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜），每组设定3复孔。
三、结果统计学处理所有数值以x±s表示，应用SPSS软件进行方差分析，p<0.05时为相差显著，p<0.01时为相差非常显著。
可以以时间为横轴，光吸收值为纵轴绘制细胞生线，专门公式求IC50。
或计算抑制率。
四、注意事项与常见问题1）实验时应设置调零孔，对照孔，加药孔。
细胞活力检测
细胞活力检测在细胞群体中总有一些因各种原因而死亡的细胞，总细胞中活细胞所占的百分比叫做细胞活力（cell viability）。
细胞活力测定方法有MTT法、克隆（集落）形成法、台盼蓝染色法、3H放射性同位素掺入法等。
其中MTT法以其快速简便，不需要特殊检测仪器、无放射性同位素、适合大批量检测的特点而得到广泛的应用。
但MTT法形成的Formazan为水不溶性的，需要加有机溶剂溶解，由于在去上清操作时会有可能带走小部分的Formazan，故有时重复性略差。
为了解决这个问题，研究人员又开发了很多种水溶性的四氮唑盐类：如CCK-8（WST-8）、XTT等。
MTTMTT分析法以活细胞代谢物还原剂3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide, MTT噻唑蓝为基础。
MTT为黄色化合物，是一种接受氢离子的染料，可作用于活细胞线粒体中的呼吸链，在琥珀酸脱氢酶和细胞色素C的作用下tetrazolium环开裂，生成蓝色的formazan结晶，formazan 结晶的生成量仅与活细胞数目成正比（死细胞中琥珀酸脱氢酶消失，不能将MTT还原）。
还原生成的formazan结晶可在含50%的N,N-二甲基甲酰胺和20%的十二甲基磺酸钠（pH 4.7）的MTT溶解液中溶解，利用酶标仪测定490 nm处的光密度OD值，以反映出活细胞数目。
也可以用DMSO来溶解。
MTT粉末和配置好的溶液都需要用铝箔纸包好避光保存。
实验的时候尽量关闭超净台上的日光灯进行避光操作。
步骤如下：1：接种细胞：用含10％胎小牛血清的培养液配成单个细胞悬液，以每孔1000－10000个细胞的密度接种到96孔板中，每孔体积200ul.2：培养细胞：同一般培养条件，培养3-5天（可根据试验目的和要求决定培养时间）。
3：呈色：培养3-5天后，每孔加MTT溶液（5mg/ml用PBS 配)20ul. 继续孵育4小时，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。
MTT法检测细胞活力讲解
MTT法检测细胞活力
甘肃中医药大学
MTT法目的和意义
检测细胞存活和生长情况 用于评价药物产生的细胞毒作用
原理
• 四唑盐（噻唑蓝）是一种能接受氢原子的染料，简称MTT • 活细胞的线粒体中的琥珀脱氢酶能使外源性的MTT还原为难 溶性的蓝紫色结晶物并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。 二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的紫蓝色结晶物，用酶 联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映 活细胞数量，从而反映细胞的增殖情况。 • 在一定细胞数范围内，MTT结晶物形成的量与活细胞数成正 比。
药物的配制
• 浓度 • 体积 • 过滤
MTT的配制
• MTT一般最好现用现配，过滤后4º C避光保存两周内有效，或配制成 5mg/ml保存在-20度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用 避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。尤其当MTT变为灰绿 色时就绝对不能再用了。 • MTT有致癌性，用的时候小心,有条件最好带那种透明的簿膜手套.配 成的MTT需要无菌，MTT对菌很敏感；往96孔板加时不避光也没有 关系，因为时间较短。
4.培养时间。100ul的培养液对于10的4～5次方的增
殖期细胞来说，很难维持68h，如果营养不够的话， 细胞会由增殖期渐渐趋向G0期而趋于静止，影响结果， 我们是在48h换液的。
5.MTT法只能测定细胞相对数和相对活力，不 能测定细胞绝对数。做MTT时，尽量无菌操作，因
细胞活力计数实验报告
一、实验目的1. 掌握细胞计数的原理和方法。
2. 了解细胞活力的概念及其测定方法。
3. 熟悉细胞计数及活力测定的实验操作步骤。
二、实验原理细胞计数是研究细胞生长、繁殖、死亡等生命活动的基础，细胞活力计数则是判断细胞质量的重要指标。
细胞计数的基本原理是利用显微镜直接观察和计数细胞，根据计数结果计算细胞密度。
细胞活力计数则是通过染色剂（如台盼蓝）对细胞进行染色，区分活细胞和死细胞，进而计算细胞活力。
三、实验材料1. 细胞悬液2. 试剂：台盼兰、四甲基偶氮唑盐、酸化异丙醇3. 仪器：普通显微镜、血球计数板、试管、吸管、酶标仪、分光光度计四、实验步骤1. 细胞计数（1）将血球计数板及盖片用擦试干净，并将盖片盖在计数板上。
（2）将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间。
（3）静置3分钟。
（4）镜下观察，计算计数板四大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的。
（5）按下式计算细胞数/ml：细胞数/ml = 4大格细胞总数 / 4 x 10^52. 细胞活力（1）将细胞悬液进行台盼兰染色，死细胞着色，活细胞不着色。
（2）将染色后的细胞悬液滴加在血球计数板上，静置3分钟。
（3）镜下观察，分别计数活细胞和死细胞数量。
（4）按下式计算细胞活力：细胞活力 = 活细胞数量 / （活细胞数量 + 死细胞数量） x 100%五、实验结果与分析1. 通过细胞计数，得到实验组细胞密度为1.2 x 10^6个/ml，对照组细胞密度为1.0 x 10^6个/ml。
2. 通过细胞活力测定，得到实验组细胞活力为85%，对照组细胞活力为90%。
3. 分析实验结果，可知实验组细胞密度略高于对照组，但细胞活力低于对照组，可能是因为实验过程中某些操作对细胞造成了损伤。
六、实验总结本次实验成功完成了细胞计数和细胞活力测定，掌握了细胞计数的原理和方法，了解了细胞活力的概念及其测定方法。
实验过程中，需要注意操作规范，确保实验结果的准确性。
实验4 细胞的活力测定(MTS法)
（X为4个大格的 细胞总数）
2. 正中央红色小格用于计数红细胞
➢ 计数前，如果细胞密度很大则先将细胞用台盼蓝 溶液将细胞稀释一定倍数（如5倍），计算时需要 在公式里乘以相应的稀释倍数，即得到细胞的实 际密度。
➢ 根据个人习惯，计数时当细胞压到大格的边线时， 遵循“数上不数下，数左不数右”的原则。
实验对照每孔 加100ul细胞
空白对照每孔 加100ul 1640 培养基
从右到左分别加入100ul经10uM，5uM……的梯度药物处理的细胞
1.加细胞和 培养基。
2.细胞加完
后，每孔加
入MTS和
PMS的混合 液20ul
，
VMTS:VPMS=2 0：1，先计
算需要多少
孔，可以多
配6孔 为了减少误
差，每个浓MTS法的原理与TT法相同（测定490nm吸光度值），灵敏度高，操作简单。
酶标仪
实验内容
1.测定抗癌药物对慢性粒细胞白血病(CML)细胞系的IC50. 2.细胞倍比稀释测定细胞活力. 3.细胞计数.
IC50（ inhibitory concentration 50% ）：药物抑制细胞活力50%时的浓度。 单位：nM,uM
2.细胞倍比稀释测定细胞活力.
取CML细胞系1ml（细胞浓度约为5*106个/ml）于1.5ml离心管中， 编号为第1管；取7个1.5ml离心管编号为2-7管， 向第2-7管中分别加入 500ul培养基；管1颠倒混匀数次后，吸取500ul细胞加入到管2，管2颠 倒混匀后吸取500ul细胞加入到管3，依次类推直到第7管；各管吸取 100ul加入到96孔细胞培养板中（设置3个复孔），同时设置3个空白对 照孔（培养基）。将MTS和PMS解冻后，按20：1的比例混匀，每孔 加入20ul，将细胞培养板置于细胞培养箱中培养4个小时后，取出细胞 培养板使用酶标仪测定490nM波长时的吸光度值，绘制细胞浓度（X轴 ）和细胞活力（Y轴），分析细胞活力与活细胞数量是否呈正比？ 注意：MTS和PMS需避光，操作时需避光操作。
最新MTT法检测细胞活力
7.实验时应设置调零孔，对照孔，加药孔。调零孔加
培养基、MTT、二甲基亚砜。对照孔和加药孔都要加细胞、 培养液、MTT、二甲基亚砜，不同的是对照孔加溶解药物 的介质，而加药组加入不同浓度的药物。
8.避免血清干扰。用含15％胎牛血清培养液培养细胞时，
高的血清物质会影响试验孔的光吸收值。由于试验本底增 加，会试验敏感性。因此，一般选小于10％胎牛血清的培 养液进行。在呈色后，尽量吸净培养孔内残余培养液。
的一内贴壁细胞长满时约有105个细胞。但由于不同细胞贴 壁后面积差异很大，因此，在进行MTT试验前，要进行预 实验检测其贴壁率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下 的生长曲线，确定试验中每孔的接种细胞数和培养时间， 以保证培养终止致细胞过满。这样，才能保证MTT结晶形 成酌量与细胞数呈的线性关系。否则细胞数太多敏感性降 低，太少观察不到差异。
谢谢观看
MTT本身就是比较粗的实验，增殖率10%左右的波动都不算 奇怪。特别是新手，20％的波动也是常见的，所以很可能 是技术原因引起的，特别是种板技术一定要过关。
注意细胞悬液一定要混匀，已避免细胞沉淀下来，导致每孔 中的细胞数量不等，可以每接几个就要再混匀一下。加样 器操作要熟练，尽量避免人为误差。另外，吹散次数过多 也会影响细胞活力。所以要熟练鞋、快些上板。
实验结果统计学处理
所有数值以x±s表示，应用SPSS软件进行方差分析， p<0.05时为相差显著，p<0.01时为相差非常显著。 可以以时间为横轴，光吸收值为纵轴绘制细胞生线 曲线，专门公式求IC50（半数抑制浓度 ）。或计算 抑制率。 OD对照组-OD实验组 ×100 % 抑制率 % = OD对照组
翻转倒扣法：可以直接将板翻转倒扣（垫几层滤纸）2－3次，比用“
实验6_人外周血单个核细胞的分离及活力测定1
Ficoll/Hypaque (2:1)
1500rpm, 20 min
水平离心
血小板
⒈ 简述补体的概念、分泌细胞及激活途径。 ⒉ 简述补体的经典激活途径的具体过程。 ⒊ 补体结合反应为什么需分两阶段进行？如果将 几种成分反应顺序颠倒，结果会如何？ ⒋ 参加补体结合反应的各已知成分，为什么须预 先滴定？试验中所设计的四种对照管有何意义？
细胞存活率(%)＝无色细胞数/细胞总数×100%
计数200个细胞，一般活性应在95％以上
注意事项
1. 与血液样品接触时应注意安全防护，避免血源性 传染病传染。 2. 操作应轻柔，细胞悬液应充分混匀，避免损伤细 胞活性及细胞丢失。 3.细胞分层液在室温下比重为l.077±0.001g/L；应 避光 4 ℃下保存，取出后逐渐升至室温后混匀， 方可使用。使用中应避免细菌污染。 4. 稀释血液可降低红细胞的凝集，提高淋巴细胞收 获量，但如果要保留血浆成分作其他实验用时， 则不能稀释血液，以免影响血浆成分。
用毛细吸管轻轻插入灰白色层，沿管壁轻
轻吸出该层的单个核细胞，盛入另一支离
心管中。
将所得到的PBMC悬液用5倍体积的Hanks液
洗涤2次，1500 rpm 5min。
台盼蓝染色测定细胞存活率
台盼蓝（trypan blue）染色法是测定细胞活力的 最简便的方法。 台盼蓝又称锥蓝，是一种阴离子型染料，它不能 透过活细胞正常完整的细胞膜，故活细胞不着 色，但死亡细胞的细胞膜通透性增加，可使染 料通过细胞膜进入细胞内，使死细胞着色呈蓝 色。
人血液中各种细胞的密度如下： 红细胞：1.093 白细胞：1.092 淋巴细胞和单核细胞：1.075-1.090 血小板：1.030-1.035
F/HБайду номын сангаас 1.077±0.001
细胞活力测试实验报告
通过本实验，了解细胞活力测试的基本原理和方法，掌握MTT法（MTT比色法）测定细胞活力的操作步骤，并分析细胞在不同条件下的活力变化。
实验时间：2023年4月10日实验地点：细胞生物学实验室实验材料：1. 细胞系：人肺上皮细胞（A549）2. MTT试剂：3-（4，5-二甲基噻唑-2-yl）-2，5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）3. DMSO（二甲基亚砜）4. 细胞培养试剂：DMEM培养基、胎牛血清、青霉素、链霉素5. 细胞培养瓶、细胞培养板、移液器、吸管、试管、离心机、酶标仪等实验方法：1. 细胞培养：将人肺上皮细胞（A549）接种于培养瓶中，置于37℃、5%CO2的培养箱中培养。
2. 细胞传代：待细胞生长至约80%融合时，用0.25%胰蛋白酶消化细胞，传代至新的培养瓶中。
3. 实验分组：将传代后的细胞分为实验组和对照组，实验组细胞在特定条件下培养，对照组细胞在正常培养条件下培养。
4. 细胞接种：将实验组和对照组细胞分别接种于96孔细胞培养板中，每孔接种细胞数量为5×104个。
5. 细胞培养：将细胞培养板置于37℃、5%CO2的培养箱中培养24小时。
6. MTT实验：向每孔细胞中加入20μl MTT试剂，继续培养4小时。
7. 终止培养：弃去孔内液体，向每孔加入150μl DMSO，振荡混匀。
8. 比色：用酶标仪在490nm波长下测定各孔的吸光度（OD）值。
9. 数据分析：计算实验组和对照组的细胞活力，并比较两组间的差异。
1. 实验组细胞活力较对照组显著降低，说明特定条件下细胞活力受到抑制。
2. 不同浓度药物处理的实验组细胞活力呈剂量依赖性下降，说明药物浓度越高，细胞活力抑制越明显。
实验结论：通过MTT法测定细胞活力，可以有效地评估细胞在不同条件下的生长状态。
本实验结果表明，特定条件下细胞活力受到抑制，且药物浓度越高，细胞活力抑制越明显。
实验讨论：1. MTT法是一种简单、快速、灵敏的细胞活力测定方法，适用于多种细胞系和药物筛选实验。
细胞活率计算方法
细胞活率计算方法
细胞活率的计算方法主要有两种：
1. 直接观察法：可以通过显微镜观察细胞的形态、大小、颜色等特征，判断细胞的存活状态。
具体来说，可以取一定量的细胞悬液，滴在载玻片上，然后在显微镜下观察，统计活细胞和死细胞的数量，计算细胞活率。
细胞活率=（活细胞数/总细胞数）×100%。
2. 间接测定法：通过测定细胞的某些生理指标，如代谢活性、膜完整性、酶活性等，来评估细胞的存活状态。
常用的方法包括：台盼蓝染色法、MTT 法、荧光染色法等。
台盼蓝染色法与直接观察法类似，通过染色后细胞的着色情况判断细胞存活状态。
MTT法是通过测量细胞代谢产物来评估细胞的活性。
荧光染色法则是利用荧光物质标记特异性抗体或核酸探针，通过荧光显微镜观察细胞的染色情况来判断细胞的存活状态。
以上是两种常见的细胞活率计算方法，具体使用哪种方法需要根据实验要求和条件来选择。
细胞活性测定
细胞活性测定方法细胞活性指标通常包括细胞膜对核酸染料的通透性，代谢活性，膜电位等。
核酸染料有多种，如EB带有单个自由正电荷，能通过完整细胞膜。
而PI，TO—PRO—1，TO-PRO-3等等带一个有四铵基团和两个或两个以上正电荷的染料是不能通过完整细胞膜进入细胞内的。
因而吸收了这些多电荷染料的细胞被认为是非活性的。
另外，一些酸性染料，如上面提到的台盼兰，曙红等都是膜非通透性。
代谢活性是另一重要指标，它通过细胞内的酶的活性来判定。
使用细胞某种酶的底物，它能通过（或是不能通过）完整细胞膜，在细胞内被酶切而产生荧光性，膜不通透性产物，能在细胞膜完好的细胞内存留，在细胞膜不完整的细胞内散失很快。
通过检测荧光强度就可知细胞代谢活性。
FDA(fluorescein diacetate)和CTC（5-cyano-2,3-ditolyl tetrazolium chloride）是常用的两种底物。
前者虽然透过细胞膜的速度较慢，但它的产物基本不往外通透。
后者经细胞内脱氢酶催化而具有荧光性，能提供细胞呼吸代谢系统活性和细胞膜完整性信息。
正常细胞的细胞膜两侧维持着一个胞内为负的膜电位为梯度，带正电的亲脂性染料，如Cyanines类能因电梯度而通过细胞的脂双层膜聚积在活细胞内，带负电的亲脂性染料如oxonols会被排除在外。
不再维持着膜电位梯度的细胞里，则会吸收更多Oxonols类染料。
用流式细胞仪测量的方法优点是，灵敏，荧光强度精确定量，快速高通量的检测逐个细胞，可同时检测细胞的多个活性指标，提高可信度，结果具有统计意义。
缺点是，实验较MTT等复杂，费用较高。
常用的细胞活性测定方法有台盼蓝染色法、克隆（集落）形成法、3H放射性同位素掺入法、MTT法等。
其中MTT法以其快速简便，不需要特殊检测仪器、无放射性同位素、适合大批量检测的特点而得到广泛的应用。
但MTT法形成的Formazan为水不溶性的，需要加有机溶剂溶解，由于在去上清操作时会有可能带走小部分的Formazan，故有时重复性略差。
细胞活力检测实验报告
细胞活力检测实验报告实验部分：材料与方法：实验装置：1.采用PI公司的光镊组装二极管激光器泵浦器、余辉压缩机、激光齿轮机，激光波长为740nm。
2.使用实验室提供的无底玻璃培养皿，尺寸为3.5 cm宽×1.5 cm 高。
3.细胞培养基DF中含有高浓度glucose，营养物质和激素。
4.电极式超微型光弹性式式生物力传感器，电极表面有许多针状物，针状物数量越多，粘附细胞数量和弹性越好。
实验步骤：1.在多孔培养皿中将前成的新鲜小鼠细胞培养3天，温度为37℃，100％湿度，5％CO2。
2.将细胞培养基DF涂在电极的表面上，并将电极插入培养皿中。
3.然后将电极式超微型光弹性式式生物力传感器与放大器组成一个闭环回路，并将该系统与计算机连接起来。
4.调整放大器，选择合适的放大倍数。
5.接通激光，并将激光照射到细胞培养皿中。
6.根据测试结果来判断细胞的分裂、死亡和微环境的状态。
数据分析：在实验中，我们通过检测细胞活力，来确定给定微环境下细胞的活力状态。
我们根据数据进行了分析，得出以下结论：1.在含有高浓度营养物质的DF培养基下，细胞的生长速度和分裂率远高于其他培养条件，这表明营养物质是维持细胞的重要支持。
2.通过检测生物力传感器的弹性，我们发现细胞的环境对细胞的弹性有着直接的影响，这表明微环境与细胞的交流直接关系到细胞的生命周期。
3.通过多次实验的结果，我们可以看出，培养皿中的细胞的死亡率极低，而在其他培养条件下则不然。
这可以从容易死去的细胞所释放出的生物正面信号中得出结果。
结论：综上所述，这项实验结果表明，给定的微环境对细胞的生命周期有着关键性的影响。
通过调整微环境，我们可以促进细胞的生长，降低细胞的死亡。
未来研究方向：在我们的研究中，我们发现细胞的微环境对细胞的生命周期具有关键的影响。
我们计划将微环境的调整带入下一步的研究，以了解细胞在不同的微环境下的反应和调整机制。
此外，我们还希望研究诸如调整化学成分、温度、气体含量和湿度等其他微环境调控因素对细胞行为的影响。
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空白对照 试验对照 药物浓度 药物浓度 药物浓度
0.304
1.733
1.862
1.322
0.989
0.313
2.049
2.0671.796Fra bibliotek1.986
0.304
2.276
2.108
2.052
1.347
0.307 1.426 1.555 1.015 0.682
1.742 1.76 1.489 1.679
药物浓度 细胞相对活 力
0 0.050805 0.152416 0.457247 1 0.995912 0.827137 0.66206
1.2 1
0.8 0.6 0.4 0.2
0 0
y = -0.0637x + 0.8295 R² = 0.8089
系列 线性
5
10
15
2.细胞倍比稀释的 作图同上（例如理 想状态） 细胞相对活力 细胞密度（10的6 次方个每ml）
细胞活力
1
0.5 0.25 0.125
5
2.5 1.25 0.625
1.2 1
0.8 0.6 0.4 0.2
0 0
1
2
3
4
细胞浓度（10的6次方）
选中数据-插 入-图表-XY 散点图-下一 步-下一步标题（对标 题和X轴Y轴 进行命名， 如第几个试 验，X轴为药 物浓度，Y轴 为细胞活 力）-下一步 -完成。可见 图已经画 好，右键单 击图中一点添加趋势线 （线性回 归）-线性选项-勾选显 示公式和显 示R值-确定 。根据公式 计算药物的 IC50
6
次方）
0.57154 0.474401 0.096944 0.035819 0.017715
1.371742 4.115226 12.34568 37.03704 111.1111
0.57154 0.474401 0.096944 0.035819 0.017715
0.0637x + 0.8295 R² = 0.8089
1.337 1.191 0.317 0.086 0.055
0.525015 0.306015 0.059568 0.021024 0.004672
0.408799 0.421647 0.046136 0.036208 0.016352 0.780806 0.695542 0.185128 0.050224 0.03212
药物浓度 （X轴）细胞相对 活力（Y 轴）的作 图步骤如 下：
系列1 线性 (系列1)
y=0.5时 的药物浓 度
R值越接 近1说明 实验结果 越可靠
0.0625 0.03125 0.015625 0.3125 0.15625 0.078125
y = 0.2x R² = 1
系列1 线性 (系列1)
5
1.969 1.801 1.745 1.04
1.712333333 0.832782 0.908118 0.592759 0.398287
1.017325 1.027837 0.869574 0.980534 1.149893 1.051781 1.019077 0.607358
1 0.995912 0.827137 0.66206
药物浓度 药物浓度 药物浓度 药物浓度 药物浓度
1.206
0.831
0.409
0.343
0.315
1.007
1.029
0.386
0.369
0.335
1.644
1.498
0.624
0.393
0.362
0.899 0.524 0.102 0.036 0.008
0.7 0.722 0.079 0.062 0.028