毒性试验整理

实验一发光细菌的急性毒性评价试验一、实验器材1.菌株明亮发光杆菌（Photobacterium phosphoreum）2.培养基酵母膏0.5%，胰蛋白胨或多聚蛋白胨（Polypetone）0.5%，甘油0.3%，NaCl 3%，Na2HPO4 0.5%, KH2PO4 0.1%，pH6.5。

固体培养基再加琼脂2%。

3.溶液、试剂及待测物质酵母粉，蛋白胨，NaCl（AR），Na2HPO4（AR），KH2PO4（AR），甘油（AR），二甲基亚砜（AR），乙酸乙酯（AR），HCl（1M），去离子水。

4.仪器及其他用品生物毒性测试仪；电热恒温鼓风干燥箱；振荡培养箱；DELTA 320pH计；氮吹仪；镊子，移液枪，三角锥形瓶等。

二、目的要求1.学习了解发光细菌的急性毒性评价试验的基本原理。

2.掌握发光细菌的急性毒性评价试验的操作要领和评价方法。

三、基本原理发光细菌是指在正常的生理条件下能够发射肉眼可见的蓝绿色荧光的细菌，这种可见荧光波长在450-490 nm之间，在黑暗处肉眼可见。

不同种类发光细菌的发光机理是相同的，都是由特异性的荧光酶(LE)，还原性的黄素(FMNH2)，八碳以上长链脂肪醛(RCHO)，氧分子(O2)所参与的复杂反应，大致历程如下：FMNH2+LE→FMNH2·LE+O2→LE·FMNH2·O2+RCH→LE·FMNH2·O2·RCHO→LE+FMN+ H2O+RCOOH+光具体来说，生物发光反应由分子氧作用，胞内荧光酶催化，将还原态的黄素单核苷酸(FMNH2)及长链脂肪醛氧化为FMN及长链脂肪酸，同时释放出最大发光强度在波长为407-409 nm处的蓝绿光。

发光细菌法是利用灵敏的光电测量系统测定毒物对发光细菌发光强度的影响。

发光细菌含有荧光素、荧光酶、ATP等发光要素，在有氧条件下通过细胞内生化反应而产生微弱荧光。

当细胞活性升高，处于积极分裂状态时，其ATP含量高，发光强度增强。

发光细菌在毒物作用下，细胞活性下降，ATP含量水平下降，导致发光细菌发光强度的降低。

实验显示，毒物浓度与菌体发光强度呈线性负相关关系，因而，可以根据发光细菌发光强度判断毒物毒性大小，用发光度表征毒物所在环境的急性毒性。

四、操作步骤1. 待测样品处理1) 萃取将降解后的培养液组(样品，30 mL)用等体积的乙酸乙酯萃取四次，前两次不酸化，后两次需用HCl酸化（浓盐酸，一滴，约0.2 mL）。

步骤如下：先加一滴浓盐酸（如需酸化），再加入30 mL乙酸乙酯，将锥形瓶用封口膜及报纸封口，放入摇床摇30分钟，取出，将上清液与下层液体分离，继续进行下一次，上清液即我们所需样品。

2）氮吹四次萃取液合并后，摇匀，并取10 mL的萃取液于试管内在40℃下氮吹至乙酸乙酯挥发干净，并放入-20℃冰箱待用。

2.培养基的配置以及发光细菌的培养配置培养基所需试剂及剂量如下表所示：培养基成分培养基含量（g/L）酵母粉 5蛋白胨 5NaCl 30Na2HPO4 5KH2PO4 1甘油 3培养基为100 mL，按上表加入各成分后，需将pH调整至7.2，发光细菌的接种量为10%，培养温度为18℃，需放置在150 rpm的暗摇床中，培养18-20个小时后达到发光细菌的稳定生长期，即可以进行毒性评价使用。

接种：接种前，配置好的培养基应放入灭菌锅内灭菌，灭菌结束后，取出放入无菌操作台内冷却至室温，同时无菌操作台用紫外灯消毒15分钟，消毒完成后打开通风，点燃酒精灯（一切操作要在酒精灯边完成），将培养基封口膜打开约三分之二，然后将原本保存在冰箱内的装在EP管内的发光细菌用移液枪移入培养基内，即可，随后放入暗摇床内培养。

3.利用发光细菌进行毒性评价在冷藏的样品中加入2.5 mL配置好的2%DMSO和98%的3%NaCl混合溶液进行溶解，由于样品是放在-20℃的冰箱内保存，氮吹后的样品较难以溶解，故可以在60℃的水浴锅内进行水浴10分钟。

用配置好的DMSO和NaCl混合溶液(98%的3%NaCl和2%的DMSO)调节发光细菌溶液浓度，使其（空白样）发光度在800-1200范围内，然后即可测定样品的发光度：在溶解了的2.5mL样品中取0.2 mL于小试管中，并加入1.8 mL的DMSO和NaCl混合溶液，再加入200 μL可供检测的菌液，摇匀，静置5 min后测定并记录结果。

每个样品做3组平行样，得出的结果取平均值，作图，得到结果。

4.数据处理与分析方法相对发光率(%)=样品发光强度*100%/对照发光强度实验二蚕豆微核率检测实验一、实验器材4.实验对象松滋蚕豆（Vicia faba）5.溶液、试剂及待测物质5mol/L HCl溶液；卡然诺氏溶液：无水乙醇（或95%乙醇）：冰醋酸3:1，需现配现用；Shiff试剂：0.5g碱性品红加100ml蒸馏水于三角烧瓶中煮沸5min，并不断搅拌使之溶解。

冷却到58℃时，过滤于棕色试剂瓶中，待滤液冷却至25℃时再加入10ml 1mol/L HCl 和1g Na2S2O5（或K2S2O5）充分振荡使其溶解。

塞紧瓶塞用黑纸包好，置暗处24h后，检查染色液，若透明无色即可使用。

可将其置于4℃冰箱保存，若出现沉淀则不能继续使用；SO2洗涤液：现配现用，取10% Na2S2O5（或10%K2S2O5）溶液5ml，加1mol/L HCl溶液5ml，再加100ml蒸馏水配置而成。

4.仪器及其他用品显微镜，解剖盘，培养皿，尼龙纱布等。

二、目的要求1.学习了解蚕豆微核率检测实验的基本原理。

2.掌握蚕豆微核率检测实验的操作要领和评价方法。

三、基本原理蚕豆根尖细胞在分裂时，染色体要进行复制，在染色体的复制过程中常发生断裂，断裂下来的断片在正常情况下能自行复位愈合，这样细胞可以维持正常生活。

如果在细胞分裂是受到外界诱变因子的作用，不仅会阻碍染色体片段的愈合，而且有随因子作用使断裂程度加重的趋势，于是在细胞分裂中会出现一些染色体片段，这些片段由于不具有着丝点而不受纺锤丝牵引，游离在细胞质中。

当新的细胞核形成时，这些片段就独自形成大小不等的小核，即微核。

由于产生的微核数量与外界诱变因子的强弱成正比，所以可以利用微核率来表观环境中毒性物质的毒理情况，如：多环芳烃的影响程度。

四、操作步骤1.浸种松滋青皮豆种子于自来水（或蒸馏水）25℃温箱26 h-30 h，期间至少换水2次（水事先置于25℃中）2.催芽待种子吸胀后，用纱布包裹与解剖盘内，保持湿度，25℃催芽12h-24h。

待初生根露出2-3mm，再选取发芽良好的种子放入尼龙纱网中并将其放入盛有自来水（蒸馏水）的解剖盘中，使根尖与水接触，仍置于25℃温箱继续催芽，每天换水，经36h-48h初生根至2-3cm 时，选择粗细，长短一致且发育良好的种子用于检测。

3.染毒每组6-8粒，放入盛有被测液的培养皿中，根据文献报道，可设置待检液的浓度梯度及对照组。

用被测液浸泡根尖4-6h即可。

4.恢复将处理的种子用自来水（蒸馏水）浸洗3次，每次2-3min。

洗净后的种子再放入铺好脱脂棉的培养皿中25℃温箱恢复22-24h。

5.固定将恢复后的种子从根尖顶端切下1cm的幼根放入烧杯中，加卡诺氏固定液固定24h（固定后的幼根若不及时制片可换入70%乙醇中4℃冰箱保存）。

6.染色1）固定好的幼根用蒸馏水浸洗2次，每次5min。

吸净蒸馏水后，再加5mol/L HCl浸泡，连瓶放入28℃水浴锅中水解幼根10min至幼根软化。

7.脱色用蒸馏水浸洗幼根2次，每次5min。

吸净蒸馏水后，在暗室或遮光条件下加shiff试剂，用量掩住幼根高出2mm为宜，4-6h。

随后，再用SO2洗涤液浸洗幼根2次，每次5min，再用蒸馏水浸洗5min后将幼根放入新换的蒸馏水中4℃冰箱保存，供随时制片。

8.制片将幼根放在干净的载玻片上，用解剖针截下1mm左右根尖，滴上少许45%的醋酸溶液，用解剖针将根尖捣碎后加上盖玻片，并在盖玻片上加一小块滤纸后轻轻敲打压片。

9.镜检先置低倍镜下找到分生组织区且细胞分散均匀，膨大，分裂相较多的的视野，再换高倍镜（物镜40×）下观察。

实验三单细胞凝胶电泳（彗星实验）实验一、实验器材1.细胞K562细胞，来源于第四军医大学免疫学教研室，37 ℃、5％CO2培养箱中培养，取对数期细胞进行实验。

2.培养基培养基：10％新生牛血清，90％RPMI-1640培养液；双抗(青、链霉素，100 UI/ml)；Triton X-100(Genview分装)；二甲基亚砜、肌苷酸钠(Sigma分装)；低熔点琼脂糖(FMC分装)；常熔点琼脂糖(Spanish分装)。

3.溶液、试剂及待测物质Tris-HCl (pH7.5) 缓冲液或双蒸水，溴化乙锭，生化试剂均为分析纯。

4.仪器及其他用品电泳仪；电泳槽；显微镜；彗星图象分析软件：CASP软件(casp-1.2.2，/index.php下载)二、目的要求1.学习了解彗星实验的基本原理。

2.掌握彗星实验的操作要领和评价方法。

三、基本原理彗星实验(Comet assay)，又称单细胞凝胶电泳(Single cell gel electrophoresis，SCGE)，各种理化因子作用细胞后引起的DNA链的断裂可在单细胞水平灵敏、快速地检测DNA 损伤。

可用该方法检测，并在统计学基础上对损伤程度做出评估。

本实验对受类重金属，重金属及有机污染物等污染的实际场地的提取水样进行细胞培养，诱导K562细胞DNA损伤，用彗星实验检测损伤程度，同时筛选并评价DNA损伤的分析指标来评价污染样的毒理特征。

四、操作步骤1. 各种培养的K562细胞用冰冷的PBS 洗1~2次，离心收集，用PBS 0.3 ml重悬，密度为1×105-6个/ml。

2. 铺胶下述各浓度琼脂糖凝胶均用PBS 配制：第1层凝胶的制备：用微波炉加热溶解正常熔点琼脂糖(NMA)，再冷至45～60℃，取适量（100μL~1ml）铺于载玻片上，立即盖上干净盖玻片，再置4℃下至少30min 使NMA 凝固。

也可以先铺胶，晾干后无尘存放，1周内使用。

第2层凝胶的制备: 低熔点琼脂糖LMA在微波炉中加热使之完全溶化，冷至37℃（可以放置于细胞培养箱中或水浴箱冷却至37℃，低熔点琼脂糖LMA在37℃可维持3小时）。

移去盖玻片，将20μL 细胞悬液和75μL的LMA 混合均匀,然后，迅速将适量含细胞的LMA 滴到第1 层琼脂糖上，立即盖上干净盖玻片，置4℃30min 使第2 层LMA 凝固。

注意，使用盖玻片的目的是使琼脂糖平整，显微镜下方便观察。

3. 细胞裂解移去盖玻片，将载玻片置于平皿中，轻轻加入预冷的新鲜配置的细胞裂解混合液(PH 10.0)。