细菌营养缺陷型的诱变和筛选

微生物大实验

细菌营养缺陷型菌株的诱变和筛选

细菌营养缺陷型菌株的诱变和筛选

摘要用某些物理因素或是化学因素，使基因发生突变，丧失合成某一物质的能力，因而它们在基本培养基上不能生长，必须补充某些物质才能生长，这样从野生菌经诱变筛选到的菌株，称为营养缺陷型。紫外线可以诱导细菌发生突变，产生营养缺陷型菌株。筛选营养缺陷型菌株必须经过如下几个步骤：诱变处理、营养缺陷型的检出、划线复证、生长谱鉴定、缺陷型菌株纯化。又因处理的细菌所得到的突变菌仍然是很少的部分，因此必须采用有效的筛选方法，才能分离到突变型。

关键词紫外诱变营养缺陷型营养缺陷型的检出划线复证生长谱鉴定

引言

营养缺陷型：需要在基本培养基中补加某种营养成分（如氨基酸、维生素、核苷酸等）才能生长的微生物突变体，通过基因突变产生。微生物细胞本身能吸收周围环境中的简单营养物，经过自身代谢合成生长所需的各类营养物质。如果发生基因突变，则细胞失去合成与这些基因有关营养物质的能力，只有在培养基中补加这类营养物质后，突变细胞才能生长，故又名营养缺陷型突变体。此类突变体在理论研究和生产实践中都有重要意义，是研究代谢途径和遗传规律必不可少的标记菌种，亦可直接用于生产氨基酸、核苷酸等代谢产物。为了获得营养缺陷型菌株，需从诱变处理后的菌液中认真筛选，以便检出突变体，常用的方法有：影印接种法、夹层培养法和青霉素浓缩法等。

影印接种法：将待测的浓缩菌悬液涂在完全培养基平板上，待其长好后作为母平板。用一小块灭菌的丝绒固定在直径较平板略小的圆柱形木块上，作为接种工具。用它在母平板上轻轻印一下，再在基本培养基平板上印一下，经培养后，影印平板上长出的菌落与母平板上的菌落位置对应，比较二个平板上菌落的生长状况，即可从相应位置的母平板上选出待测的营养缺陷型菌株。

夹层培养法：先在培养皿中倒一层不含菌的基本培养基，待冷凝后，加一层含菌的基本培养基，冷凝后，再加一层不含菌的基本培养基，经培养出现菌落后，在培养皿底的相应位置做上标记，然后再加一层完全培养基。再经培养后出现的菌落，多数是只能在完全培养基上生长的营养缺陷型。

青霉素浓缩法：利用青霉素特异性的杀死野生型细胞，保留营养缺陷型细胞的方法。青霉素能抑制细菌细胞壁的合成，所以只能杀死生长繁殖中的细菌，而不能杀死停止繁殖的细菌。在基本培养基中添加青霉素，野生型细菌能够生长繁殖，会被杀死，而营养缺陷型不被

杀死，得以浓缩。本实验采取的筛选方法就是青霉素浓缩法。

诱变育种是人为地采用物理、化学的因素，诱导有机体产生遗传变异，并经过人工选择、鉴定、培育新品种的方法。诱变育种的目标是改变或增加一个满意品种的某一特性，而在其他方面保持不变。诱变育种具有以下特点：1）提高突变率，扩大变异谱；2）适于进行个别性状的改良；3）育种程序简单，年限短；4）变异的方向和性质不定。

在诱发突变中，有两类诱变剂被使用：物理的和化学的。物理诱变中应用较多的是辐射诱变，即用α射线、β射线、γ射线、Χ射线、中子和其他粒子、紫外辐射等物理因素诱发变异。近年来又开发了一些新的物理诱变手段，如激光辐射诱变、离子注入诱变、空间诱变等。化学诱变剂在染色体中通过直接的化学作用发挥它们的功能，主要有①烷化剂，如甲基磺酸乙酯(EMS)、、亚硝基乙基脲烷(NEU)、硫酸二乙酯(DES)等，它们含有一个或多个活跃的烷基，能转移到电子密度较高的分子中去，置换其他分子中的氢原子而使碱基改变；②核酸碱基类似物，如5-溴尿嘧啶(BU)、5-溴去氧尿核苷(BudR)等，为一类与DNA碱基相类似的化合物，渗入DNA后，可使DNA复制发生配对上的错误；③抗生素，如重氮丝氨酸、丝裂毒素C等，具有破坏DNA和核酸的能力，从而可造成染色体断裂。

本实验使用的是紫外线诱变，紫外线诱变处理的有效波长为200-300 nm，最适波长为254nm(此为核酸的最高吸收峰)。DNA和RNA的嘌呤和嘧啶吸收紫外光后，DNA分子易形成嘧啶二聚体，即两个相邻的嘧啶共价连接，二聚体出现会减弱双键间氢键的作用，并引起双链结构扭曲变形，阻碍碱基间的正常配对，从而有可能引起突变或死亡。另外二聚体的形成，会妨碍双链的解开，因而影响DNA的复制和转录。总之紫外辐射可以引起碱基转换、颠换、移码突变或缺失，即是所谓的诱变。需要注意的是诱变要在暗箱中进行，为了防止DNA 的光修复作用。

经过诱变处理的菌株，还需要进行营养缺陷型的检出、划线复证、生长谱鉴定、缺陷型菌株纯化等步骤才能获得想要的营养缺陷型菌株。本实验使用紫外线来诱发突变，并采用青霉素法淘汰野生型，最后经生长谱法鉴定细菌的营养缺陷型。

材料与方法

1、材料

（1）实验菌种 E.coil K12 SF+

（2）培养基

LB液体培养基：酵母粉0.5克，蛋白胨1.0克，NaCl 1.0克，蒸馏水100毫升，pH7.2

LB固体培养基：LB液体培养基100毫升，琼脂粉2.0克

2×LB液体培养基：酵母粉1.0克，蛋白胨2.0克，NaCl 2.0克，蒸馏水100毫升，pH 7.2

基本液体培养基Vogel 50×（即浓缩50倍）：MgSO4•7H2O 10克，柠檬酸100克，NaNH4HPO4•4H2O 175克，K2HPO4•2H2O 599.88克（K2HPO4•3H2O 656.319克）蒸馏水600ml。

Vogel 50×2毫升，葡萄糖2克，蒸馏水98毫升，琼脂2克，pH 7.0 基本固体培养基基本液体培养基100毫升，琼脂2克，pH7.0，

无N基本液体培养基K2HPO4 O.7克（或K2HPO4•3H2O 0.92克），KH2PO4 0.3克，柠檬酸钠•3H2O 0.5克，MgSO4•7H2O 0.01克，葡萄糖2克，蒸馏水100毫升，pH 7.0 2N基本液体培养基K2HPO4 0.7克（或K2HPO4•3H2O 0.92克），KH2PO4 0.3克，柠檬酸钠•3H2O 0.5克，MgSO4•7H2O 0.01克，（NH4）2SO4 0.2克，葡萄糖2克，蒸馏水100毫升，pH 7.0

（3）试剂和仪器

试剂生理盐水，混合氨基酸，混合维生素

仪器试管、试管架、锥形瓶（500ml、100ml）、酒精灯、接种环、涂布棒、移液枪、1ml枪尖、200μl枪尖、牙签、培养皿、5ml离心管、离心机、超净台、恒温摇床、恒温培养箱

2、方法

（1）紫外诱变

接种E.coil K12 SF+于5ml LB液体培养基中，37℃培养过夜→6000rpm，5min，离心收集菌体→生理盐水洗涤二次→用4ml生理盐水悬浮→将7cm的培养皿放到超净台中，紫外照射1min→取3ml菌悬液加入培养皿中并轻摇使菌液平铺开，不加盖，放到试管加上，紫外照射2min→迅速加入3ml 2×LB液体培养基并混匀，盖上皿盖→用黑布将培养皿包好，放到37℃的恒温培养箱中培养12h以上

（2）营养缺陷型的检出和划线复证

6000rpm，5min，离心收集诱变后的菌体→生理盐水洗涤二次→用4ml生理盐水悬浮→取0.1ml菌悬液至5ml的无N培养基中，37℃恒温摇床中培养12h→按1:1加入5ml 2N基本培养基和终浓度为20μg/ml的Amp，37℃恒温摇床培养→从培养12h、16h、24h的菌液中，分别取0.1ml到二个培养皿中→向二个培养皿中分别倒入冷却至45-50℃的基本及完全