等温滴定量热法应用
等温滴定量热法（ITC）
等温滴定量热法（ITC）等温滴定量热技术摘要：⽣物⼤分⼦可以和很多配体特异性结合，当物质结合时，热量要么产⽣，要么吸收。
⽣物⼤分⼦与配体相互作⽤的定量描述需要确定反应过程中热⼒学参数的变化。
相互作⽤过程中产⽣的热量变化可以⽤量热计定量监测。
等温滴定量热技术（Isothermal Titration Calorimetry, ITC）是⼀种监测由结合成分的添加⽽起始的任何化学反应的热⼒学技术，它已经成为鉴定⽣物分⼦间相互作⽤的⾸选⽅法。
它通过⾼灵敏度、⾼⾃动化的微量量热仪连续、准确地监测和记录⼀个变化过程的量热曲线，原位、在线和⽆损伤地同时提供热⼒学和动⼒学信息，如结合常数（Ka）、结合位点数（n），结合焓（△H）、熵（△S）、恒压热容（△Cp）和动⼒学数据（如酶促反应的Km和kcat ）。
这些信息提供了⽣物分⼦相互作⽤的真实写照。
由于⼏乎所有的⽣化反应过程都有热量变化，所以ITC具有很⼴泛的应⽤，它可以应⽤于蛋⽩质-蛋⽩质相互作⽤、蛋⽩质折叠/去折叠、蛋⽩质-⼩分⼦相互作⽤、酶-抑制剂相互作⽤、酶促反应动⼒学、药物-DNA/RNA相互作⽤、RNA折叠、蛋⽩质-核酸相互作⽤、核酸-⼩分⼦相互作⽤、核酸-核酸相互作⽤、⽣物分⼦-细胞相互作⽤等⽅⾯。
关键字：等温滴定量热技术、相互作⽤、热⼒学商业化的测量⽣物分⼦相互作⽤热量的灵敏的量热计出现在上世纪80年代后期[1]。
从此这种技术被⼴泛应⽤。
在过去的20年中，等温滴定量热技术（ITC）成为研究相互作⽤的常⽤⽅法。
随着现代ITC仪器的发展，ITC更加灵敏、快速、易⽤。
分⼦识别是⼀个复杂的过程，是⽣命活动的基础。
⽣物分⼦识别过程需要结合反应的热⼒学参数来阐明。
等温滴定微量量热法可以直接定量检测滴定反应过程中的热量变化，确定反应的结合常数K B 、结合计量⽐（n）、反应焓变（?H）、熵变（? S）、恒压热容（△Cp）和动⼒学数据（如酶促反应的Km和kcat ）等热⼒学参数，⽤来表征⽣物分⼦间的相互作⽤。
ITC等温滴定量热法的操作说明解读
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在恒温下，注射器中的“配体”溶液滴定到包含“高分子”溶液的池中。当配体 注射到池中，两种物质相互作用，释放或吸收的热量与结合量成正比。当池中的 高分子被配体饱和时，热量信号减弱，直到只观察到稀释的背景热量。
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独特特点：
– 它对被研究体系的溶剂性质、光谱性质和电学性质等没有任何限制条件，即 具有非特异性的独特优势，
– 样品用量小，方法灵敏度和精确度高(仪器最小可检测热功率2 nW，最小可 检测热效应0.125uJ，生物样品最小用量0.4ug，温度范围2 ℃ - 80 ℃，滴 定池体积(1.43 ml)。
等温滴定量热法
(Isothermal Titration Calorimetry, ITC)
2011-10-13
Isothermal Titration Calorimetry, ITC
等温滴定量热技术（ITC）是一种监测由结合成分的添加而起始的任何
化学反应的热力学技术，即用一种反应物滴定另一种反应物，随着加 入滴定剂的数量的变化，测量反应体系温度的变化
ITC提供了（△G）以及（△H） 和（△S），产生了结合机理的真 实图像。
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ITC：用生物相关模型系统架起桥梁
ITC的关键优势之一是创建生物相关实验的独特能力。再没有其他技术 能提供完全无标记且液相的分析环境，同时无需靶点高分子或配体的固 定。ITC的应用在相关模型生物系统的建立和验证中起了重要的作用。
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INS
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典型的ITC数据
（完整版）等温滴定量热法在生命科学研究中应用
（完整版）等温滴定量热法在生命科学研究中应用等温滴定量热法在生命科学研究中应用等温滴定量热法(Isothermal Titration Calorimetry, ITC)是近年来发展起来的一种研究生物热力学与生物动力学的重要方法，它通过高灵敏度、高自动化的微量量热仪连续、准确地监测和记录一个变化过程的量热曲线，原位、在线和无损伤地同时提供热力学和动力学信息。
微量热法具有许多独特之处。
它对被研究体系的溶剂性质、光谱性质和电学性质等没有任何限制条件，即具有非特异性的独特优势，样品用量小，方法灵敏度和精确度高(本仪器最小可检测热功率2 nW，最小可检测热效应0.125uJ，生物样品最小用量0.4ug，温度范围2 0C - 80 0C，滴定池体积1.43 ml)。
实验时间较短(典型的ITC实验只需30-60分钟，并加上几分钟的响应时间)，操作简单(整个实验由计算机控制，使用者只需输入实验的参数，如温度、注射次数、注射量等，计算机就可以完成整个实验，再由Origin软件分析ITC得到的数据)。
测量时不需要制成透明清澈的溶液, 而且量热实验完毕的样品未遭破坏，还可以进行后续生化分析。
尽管微量热法缺乏特异性但由于生物体系本身具有特异性，因此这种非特异性方法有时可以得到用特异方法得不到的结果，这有助于发现新现象和新规律，特别适应于研究生物体系中的各种特异过程。
ITC的用途获得生物分子相互作用的完整热力学参数，包括结合常数、结合位点数、摩尔结合焓、摩尔结合熵、摩尔恒压热容，和动力学参数(如酶活力、酶促反应米氏常数和酶转换数)。
ITC的应用范围蛋白质-蛋白质相互作用(包括抗原-抗体相互作用和分子伴侣-底物相互作用)；蛋白质折叠/去折叠；蛋白质-小分子相互作用以及酶-抑制剂相互作用；酶促反应动力学；药物-DNA/RN A相互作用；RNA折叠；蛋白质-核酸相互作用；核酸-小分子相互作用；核酸-核酸相互作用；生物分子-细胞相互作用；……加样体积：（实际体积）cell：1.43 ml，syringe：300 μl准备样品体积（最少量）cell：2 ml，syringe：500 μl样品浓度cell：几十μM到几mMsyringe：几百μM到几十mM测量Kb范围102-1012 M-1滴定实验前恒温30-60 min等温滴定量热实验所需时间，一般1.5-4 hr微量热技术(Microcalorimetry)(2008-05-27 19:58:14)标签：杂谈微量热法(包括等温滴定量热和差示扫描量热)是近年来发展起来的研究生物热力学与生物动力学的重要结构生物学方法，它通过高灵敏度、高自动化的微量量热仪连续和准确地监测和记录一变化过程的量热曲线，原位(in situ)、在线(on-line)和无损伤地同时提供热力学和动力学信息。
化学反应的热力学分析方法新技术
化学反应的热力学分析方法新技术一、引言化学反应的热力学分析是研究化学反应过程中能量变化的重要手段。
随着科技的发展，热力学分析方法也在不断更新和创新。
本文将介绍近年来涌现的化学反应热力学分析的新技术，并探讨其应用和优势。
二、等温滴定量热法等温滴定量热法是一种利用量热仪测量化学反应热的方法。
其原理是在恒温条件下，将反应物逐滴加入反应釜中，通过测量反应釜中温度的变化来计算反应热。
相比传统的等温量热法，等温滴定量热法具有较高的灵敏度和准确性，可以更精确地测量反应热。
三、热流量仪测定法热流量仪测定法是一种利用热流量仪测量化学反应热的方法。
热流量仪通过测量流过试样的热量，间接计算出反应热。
与传统的量热法相比，热流量仪测定法具有较高的灵敏度和快速响应的特点，可以实时监测反应过程中的热量变化。
四、微流控技术微流控技术是一种利用微流控芯片进行热力学分析的方法。
通过在微流控芯片中控制反应物的流动速度和反应时间，可以实现对反应过程的精确控制。
微流控技术在化学反应热力学分析中具有快速、自动和高效的优势，可以大大提高实验的效率和准确性。
五、差示扫描量热法差示扫描量热法是一种基于差示扫描量热仪的热力学分析方法。
其原理是将待测样品与参比样品同时加热，通过测量两者之间的温差来计算反应热。
相比传统的量热法，差示扫描量热法具有更高的敏感性和准确性，可以测量相对较小的反应热。
六、计算机模拟方法计算机模拟方法是一种通过数值计算来分析化学反应热力学的方法。
通过建立反应物的分子动力学模型，可以模拟和预测反应过程中的能量变化。
计算机模拟方法具有高度灵活性和可扩展性，可以在实验之前进行预测和优化，为实验提供理论指导。
七、结论近年来，化学反应的热力学分析方法得到了快速发展和创新。
等温滴定量热法、热流量仪测定法、微流控技术、差示扫描量热法和计算机模拟方法等新技术的出现，不仅提高了热力学分析的精确性和灵敏度，还加快了实验的速度和提高了效率。
随着科学技术的不断进步，我们相信这些新技术将会在热力学研究领域发挥更大的作用，并推动化学反应的热力学分析取得更多的突破。
等温滴定量热法浓度优化
等温滴定量热法浓度优化等温滴定量热法（Isothermal Titration Calorimetry，ITC）是一种广泛应用于生物化学、药物研发和生物医学领域的实验技术。
通过测量反应在等温条件下产生或吸收的热量，ITC可以帮助研究人员了解溶液中分子之间的相互作用，如配体和受体的结合、酶催化反应以及protein-protein 相互作用。
通过优化等温滴定量热法的浓度参数，可以提高实验结果的质量和可靠性。
在优化等温滴定量热法的浓度时，有几个关键因素需要考虑。
首先是实验物质的浓度范围。
选择适当的浓度范围可以确保反应产生的热量在仪器检测范围内，同时减少背景噪音的干扰。
一般来说，对于正常的反应热量，推荐使用0.1-2.0 mM的溶液浓度。
然而，对于特殊的反应系统，需要事先进行一些初步实验，以确定最佳的溶液浓度范围。
其次是选择合适的滴定量。
滴定量是指每一次滴加到反应体系中的试剂量。
在进行等温滴定量热法实验时，滴定量的选择将直接影响到实验的敏感性和准确性。
一般来说，滴定量应尽量小，以确保每一次反应的热效应可以被仪器检测到，同时避免反应溶液的剧烈稀释或稀释不足。
通常情况下，滴定量为0.5-2.5 μL。
还需要考虑实验温度和缓冲溶液的选择。
实验温度应根据实验系统的特性和要研究的反应进行合理的选择。
对于生物体系来说，一般选择25℃或37℃作为实验温度。
而对于非生物体系，可根据需要进行调整。
缓冲溶液的选择应该使得反应体系在所选温度下保持稳定，并且不对测量结果产生干扰。
在实施等温滴定量热法浓度优化实验时，以下是一些有效的实践经验和技巧：1. 从简单到复杂地确定浓度范围。
首先可以进行一些初步实验，选择几个不同浓度的溶液进行测试，进而找到适合体系的浓度范围。
可以根据实验结果调整溶液的浓度，并逐渐扩大范围。
2. 手动混匀溶液，确保均匀分布。
在进行实验前，用手动混匀的方法将溶液均匀混合，以确保反应物质在整个试验过程中处于均一的状态。
等温滴定量热仪(ITC)在分子相互作用中的应用
HO
O
O
O
O
N H
N
NH
OH
S
Kd = 0.5 nM ∆H = -5.5 kcal/mol
∆∆H = -4.3 kcal/mol -T∆∆S = 2.2 kcal/mol
Freire, Drug Disc. Today, 13 869 (2008)
酶反应动力学的研究
令人郁闷的公式说明了什么？
1. 相同的KD有着相同的∆G； 2. 相同的∆G却有着不同的∆H与∆S组合。
引发焓变和熵变的主要因素
Enthalpy (-∆H) 焓变
Hydrogen bonds 氢键
Ionic interactions 离子作用
特异性结合
Entropy (+∆S) 熵变
Hydrophobic interactions 疏水作用
抗疟疾新药就这样放弃吗？
Optimize Enthalpy, Minimize Entropy Compensation
O
O
O
O
N H
N
N
H
OH
S
Kd = 16 nM ∆H = -1.2 kcal/mol
HO
O
O
O
O
N H
N
NH
OH
S
Kd = 76 nM ∆H = -6.0 kcal/mol
PlmII Inhibitor Optimization ∆∆H = -4.8 kcal/mol
Conformational freedom 构象自由度
非特异性结合
ITC 技术的应用领域
分子相互作用：
ITC等温滴定量热法的操作说明
ITC等温滴定量热法的操作说明ITC等温滴定量热法的操作说明1：概述ITC（Isothermal Titration Calorimetry）等温滴定量热法是一种常用于测量化学反应热效应和热力学参数的实验技术。
本文档将详细介绍ITC等温滴定量热法的操作步骤，以及常见问题的解决方案。
2：实验前准备2.1 仪器准备- 确保ITC仪器处于良好的工作状态，并进行必要的校准和检修。
- 检查仪器和相关设备的供电和冷却系统，确保正常运行。
- 准备实验所需的试剂和溶液，确保其纯度和浓度符合要求。
2.2 样品准备- 准备待测样品，确保样品的纯度和浓度符合实验要求。
- 储存样品时，注意避免暴露在空气中，以免影响实验结果。
- 如有需要，进行样品的预处理或稀释，以适应实验要求。
3：实验操作3.1 基本操作步骤- 打开ITC仪器，并进行必要的初始化设置。
- 准备试样，通常包括两种液体：溶剂和待测样品。
- 启动实验程序，并按照程序指导添加试样。
- 进行实验过程中，根据实验需要，调整实验参数，如温度、压力、浓度等。
- 当实验结束后，关闭仪器，保存实验数据。
3.2 添加试样的注意事项- 添加试样时，应尽量避免形成气泡，以免影响测量结果。
- 在添加试样前，应将样品和溶剂在相同工作温度下达到热平衡。
- 添加样品时，应使用精确的加样装置，控制加样速度和时间。
4：数据分析4.1 数据处理与解读- 对实验数据进行处理和分析，包括热流曲线的积分和差分操作等。
- 利用数据做曲线拟合，计算反应热和其他热力学参数。
- 根据数据分析结果，解释实验现象和反应机制。
4.2 出现问题的解决方案- 如实验数据异常或与理论不符，可检查实验操作是否正确，并逐步排除可能的问题。
- 如仪器出现故障或异常，应及时联系厂家进行维修或咨询专业人员的意见。
5：附件本文档附带以下附件：- ITX仪器操作手册6：法律名词及注释本文档中涉及的法律名词及其注释如下：- 1：涉及附件: 本文档所附带的相关文件或资料。
等温滴定微量热仪(ITC)简介
等温滴定微量热仪(ITC)简介等温滴定量热法在生命科学研究中应用申明：本资料来源于网络，版权归原作者所有！等温滴定量热法(Isothermal Titration Calorimetry, ITC)是近年来发展起来的一种研究生物热力学与生物动力学的重要方法，它通过高灵敏度、高自动化的微量量热仪连续、准确地监测和记录一个变化过程的量热曲线，原位、在线和无损伤地同时提供热力学和动力学信息。
微量热法具有许多独特之处。
它对被研究体系的溶剂性质、光谱性质和电学性质等没有任何限制条件，即具有非特异性的独最小可检测热效应0.125uJ，生物样品最小用量0.4ug，温度范围2 0C - 80 0C，滴定池体积1.43 ml)。
实验时间较短(典型的ITC实验只需30-60分钟，并加上几分钟的响应时间)，操作简单(整个实验由计算机控制，使用者只需输入实验的参数，如温度、注射次数、注射量等，计算机就可以完成整个实验，再由Origin 软件分析ITC得到的数据)。
测量时不需要制成透明清澈的溶液, 而且量热实验完毕的样品未遭破坏，还可以进行后续生化分析。
尽管微量热法缺乏特异性但由于生物体系本身具有特异性，因此这种非特异性方法有时可以得到用特异方法得不到的结果，这有助于发现新现象和新规律，特别适应于研究生物体系中的各种特异过程。
ITC的用途获得生物分子相互作用的完整热力学参数，包括结合常数、结合位点数、摩尔结合焓、摩尔结合熵、摩尔恒压热容，和动力学参数(如酶活力、酶促反应米氏常数和酶转换数)。
ITC的应用范围蛋白质-蛋白质相互作用(包括抗原-抗体相互作用和分子伴侣-底物相互作用)；蛋白质折叠/去折叠；蛋白质-小分子相互作用以及酶-抑制剂相互作用；酶促反应动力学；药物-DNA/RNA相互作用；RNA折叠；蛋白质-核酸相互作用；核酸-小分子相互作用；核酸-核酸相互作用；生物分子-细胞相互作用；……加样体积：（实际体积）cell：1.43 ml，syringe：300 μl准备样品体积（最少量）cell：2 ml，syringe：500 μl样品浓度cell：几十μM到几mMsyringe：几百μM到几十mM测量Kb范围102-1012 M-1滴定实验前恒温30-60 min等温滴定量热实验所需时间，一般1.5-4 hrSample Preparation Guidelines (ITC).Proper sample preparation is essential for successful ITC testing. In particular, the minimal guidelines below must be strictly followed to insure an accurate estimate of stoichiometry (n), heat of binding (H), and binding constant (Kb) (or dissociation constant Kd = 1/Kb).1.) The macromolecule solution (the sample to be placed in the reaction cell) must have a volume of at least2.1 ml. The lowest concentration which can be studied is 3 M and this is adequate only for tight binding where Kd is smaller than 1 M. For weaker interactions, the macromolecule concentration should be 5 times Kd, or higher if possible. Preferably, the macromolecule solution should be dialyzed exhaustively against buffer for final equilibration.2.) The ligand solution (the sample to be placed in the injection syringe) must have a volume of at least 0.7 ml. Its concentration should be at least 10 times higher than the concentration of macromolecule (if the macromolecule has multiple binding sites for ligand, then the ligand concentration must be increased accordingly). The buffer solution in which the ligand is dissolved should be exactly the same buffer against which the macromolecule has been equilibrated.3.) After both solutions have been prepared, the pH of each should be checked carefully. If they are different by more that 0.05 pH units, then one of the solutions must be back-titrated so they are within the limit of 0.05 pH units. If any particles are visible in either solution, they should be filtered out.4.) If possible, the concentrations of both solutions should be accurately determined after final preparation. Accurate determination of binding parameters is only possible if concentrations of binding components are known precisely.5.) At least 20 ml of buffer must be sent along with the two samples, since this is used for rinsing the cell and for dilution if necessary.6.) If possible, DTT should be avoided as a disulfide reagent and replaced by -mercaptoethanol or TCEP.等温滴定微量热仪（ITC）基本介绍等温滴定微量热仪（ITC）基本介绍（美国MicroCal ，美国微量热公司）仪器设备名称：等温滴定微量热仪制造国别：美国制造厂商：美国微量热公司规格型号：VP-ITC品牌：MicroCal总代理商：华嘉（香港）有限公司技术指标：短期噪音水平：0.5纳卡/秒(2 纳瓦)。
等温滴定量热法
等温滴定量热法
等温滴定量热法是一种非常重要的实验方法，它可以用来测量溶液中温度与单位时间内所吸收的热量之间的关系。
自发明以来，它已经成为热力学实验中的一种重要方法，并在诸如热力学、物理化学等学科中得到广泛应用。
等温滴定量热法是一种相对简单的实验方法，它需要根据温度上升和下降的情况，来衡量溶液中的热量吸收情况。
它的实验原理是：在一段时间内，将溶液放置在可控温度的实验箱中，当温度提高时，溶质被溶液吸收的热量会比温度降低时要大，从而可以测量热力学的参数。
等温滴定量热法是一种比较常用的热力学实验方法，它不仅能够测量某一特定溶液的吸热或放热情况，而且可以用于测量热力学参数，如比热容、汽化温度、沸点等。
等温滴定量热法是一种比较有效的实验方法，它的测量结果可以反映出物理化学的实际状况。
它的实验过程比较简单，可以在室温下完成，而且测量的精确度很高，因此在化学、物理、热力学等学科中得到了广泛应用。
另外，等温滴定量热法在现代化工程中也得到了广泛应用。
比如，它可以用来测量热负荷和用于进行蒸汽锅炉安全运行时的安全参数，也可以用于溶剂萃取、蒸发空气冷却、热交换量的测量等，以及热分析中的热容量、热导率和热稳定性的测定等。
因此，等温滴定量热法是实验测量技术中的一种重要方法，它可以用来测量某一特定溶液的吸热或放热情况，以及热力学参数，如比
热容、汽化温度等。
它的简单性、精确度和准确性使其在化学、物理、热力学等学科中非常具有重要的意义，也使得它在现代化工程中得到了广泛的应用。
等温滴定量热技术
等温滴定量热技术等温滴定量热技术是一种能够研究溶解热、反应热、吸附热等反应热效应的实验技术，它可以定量测定物质的热化学性质，包括热力学参数、化学反应动力学参数等，是化学和材料学等领域重要的实验手段。
等温滴定量热技术的基本原理是利用微量热法，即将被测样品在等温条件下加入到反应池中，在一定时间间隔内持续注入滴定液，从而发生显著反应，这种反应释放或吸收能量，导致反应体系温度发生变化，采用高精度量热仪测量反应热效应，从而获得样品的热化学性质。
等温滴定量热技术主要分为平衡热量法和动态热量法两种方法。
平衡热量法是通过将反应池维持在等温状态，在一段时间内等待反应体系达到平衡状态，然后进行滴定，测量反应热量。
这种方法可以减小反应过程中外部因素的影响，同时也可以消除热失控导致的误差。
而动态热量法则是在滴定过程中，实时测量反应体系的温度变化，以获得较高的实验精度。
等温滴定量热技术具有以下优点：首先，利用等温条件进行反应，保证了反应的可重复性。
其次，在不需求外热量或热量损失的情况下，可以实现精确测量反应热，避免了因加热或冷却而导致的额外的误差。
最后，由于等温滴定量热技术对样品量非常少，因此可以进行昂贵或危险的试剂或实验条件下的实验。
应用等温滴定量热技术可以获得广泛的信息，例如热容、热力学参数、化学反应速率、表面化学结构和气体吸附等。
在实践中，等温滴定量热技术用于研究各种类型的化学反应，例如溶解、复分解、离子交换等。
它还可以应用于催化剂、生物大分子、纳米材料等重要领域的研究。
总之，等温滴定量热技术是一种非常强大的实验手段，它可以准确地测定物质的热化学性质，从而为学术研究和工业生产提供关键的信息。
随着技术的不断完善，这种实验技术将会发挥越来越重要的作用。
等温滴定量热仪和差示扫描量热仪在生物制剂研发中的应用
等温滴定量热仪和差示扫描量热仪在生物制剂研发中的应用液剂中蛋白药物的稳定的一个重要因素是适当的辅料的选择，适宜的辅料浓度能够在延长药物保质期的同时确保患者的最高的用药安全。
尽管过去十年间的文献报道了维持稳定性的一般准则，但是在存储期间辅料如何提升蛋白药物的稳定性，其机制尚未完全明晰。
为能合理优化蛋白制剂，掌握有关蛋白-辅料相互作用机理的知识十分重要。
通过微量热技术来研究来探索蛋白-辅料的相互作用，因而被越来越多的应用于生物制剂的研发和优化。
通过使用等温滴定量热仪（ITC）和差示扫描量热仪（DSC）等技术，评估与相互作用有关的热力学参数，例如辅料-蛋白的结合，辅料参与下蛋白质伸展等，揭示研发最优制剂所需的重要机理信息。
这里我们列举两个ITC和DSC是怎样辅助蛋白制剂研发的例子。
在第一个例子中，使用ITC揭示了聚山梨酯80（常用表面活性剂，通过降低蛋白表面吸附和聚集以稳定蛋白性质）与蛋白X（ProX）之间的相互作用。
使用单位点模型拟合ITC数据计算得出结合亲和常数（K A）=1430±260 M-1，结合焓（△H）=-6.3±1.1 kcal/mol，每个ProX 分子结合位点数（n）=2.6±0.3。
另外一个例子中，使用DSC和ITC产生的数据集显示在抗菌防腐剂，苯酚存在的条件下，ProX在pH5.7时结构最稳定。
因而在上述两个研究中，来自于GE Healthcare生命科学部的等温滴定量热仪ITC200 和差示扫描量热仪VP-Capillary DSC在探寻制备ProX最佳制剂方法方面提供了非常重要的信息。
由于蛋白质分子内在的不稳定性，包括物理不稳定性（伸展、聚集、吸附）和化学降解性（氧化、脱酰胺、断裂），以基于蛋白质的治疗发展面临着巨大的挑战。
蛋白的不稳定可以导致蛋白活性降低甚至可能产生潜在的免疫原性。
为增加蛋白的稳定性，可以尝试改变蛋白所在溶剂的性质，包括选择缓冲液系统，调节pH值，添加辅料/添加剂，即研发最佳剂型。
生物物理化学实验报告——ITC
结构化学实验报告等温滴定量热法测定两种蛋白质间相互作用2012/5/5实验目的：了解MicroCal iTC200等温滴定量热仪在测量蛋白质相互作用中的应用，了解仪器基本工作原理，学习蛋白质相互作用的测定步骤和仪器操作，简要分析实验结果。
实验原理：在研究两种或两种以上的蛋白质的功能时，相关蛋白质之间常常存在相互作用（常常是氢键或范德华力），如果两蛋白可以彼此结合，则结合的过程中会放出一定的热量。
所以，通过测定蛋白质相互作用时放出热量的大小，可以得到蛋白相互作用时的结合常数K D、化学计量比N和焓变ΔH，从而由热力学公式ΔG = RT lnK D和ΔG = ΔH -TΔS可以进一步得到反应的自由能变化。
MicroCal iTC200等温滴定量热仪的基本原理就是实现了蛋白质之间的微量滴定操作和微小热量的精密测量。
通过滴定操作和热量的测量，量热仪可以给出热量-摩尔比曲线：图像中曲线的突跃中点对应的化学计量比就是两种蛋白质相互作用的化学计量数N ，突跃中点处曲线的斜率就是两种蛋白相互作用的结合常数K D 。
决定曲线形状的主要参数是C 值：C = 滴定池中的蛋白浓度/ KD = [M]tot/ KD × NC 值越大，曲线越陡；C 值越小，曲线越平缓，没有明显的突跃。
一般C 值在10-100之间实验效果最好。
实验材料：蛋白质tse1（17KD）蛋白质tsi1（16KD）实验步骤：1.使用紫外分光光度计在280nm检测波长下测定蛋白质溶液中蛋白质的浓度，根据所需要的蛋白质浓度比稀释蛋白质溶液。
2.在量热仪的注射器和样品池中分别加入两种不同的蛋白质样品。
⑴注射器加样①将装有约100微升样品的PCR管放入样品试管槽。
②注射器移到“Rest Position”；然后左手转动注射器上端，使注射器的连接孔对准支架上的孔。
右手将白色细管顶部的连接头水平对准注射器连接孔，先轻轻将乳白色连接头旋入连接孔，随后将乳白色连接头后的金属连接头轻轻拧紧即可。
等温滴定量热仪(ITC)在分子相互作用中的应用
无与伦比的数据分析软件--Origin 7
多种独特的分析模式 •酶动力学分析模式 •替代模式 •二聚体解离模式 …….
我们的客户—国内用户超过30家，全球超过1500家
大学
中国科学技术大学 2台 复旦大学 2台 清华大学 2台 武汉大学 南开大学 中山大学 华中师范大学 浙江工商大学 香港科技大学 香港理工大学……
ITC 产品
VP-ITC 样品池体积 1.4 ml ~4-5 实验/8 小时
iTC200 样品池体积 0.2 ml 10-15 实验 /8 小时 样品消耗是VP-ITC的1/7
Auto-iTC200 ~50 实验/天 384 个样品, 无人化操控 可由ITC200升级 Available Mid 2008
Kamiya et al., JACS 118,4532-4538
药物结合的热动力学特征
10
5
kcal/mole
0
∆G
-5
∆H
-T∆S
-10
-15
-20
一样的亲合力，不一样的微观世界
MicroCal Application Note: ITC and Drug Design
Unfavorable
等温滴定量热仪（ITC）在分子相互作用中的应用
陈雍硕
Yongshuo.Chen@
Isothermal Titration Calorimetry 等温滴定量热
ITC: 测定分子相互作用的方法
在一次实验中, ITC 可以测定
• 结合的亲和力常数 (K), • 结合反应中的焓变和熵变 (∆ H,
Conformational freedom 构象自由度
非特异性结合
ITC 技术的应用领域
等温滴定量热仪的那些优势 量热仪如何操作
等温滴定量热仪的那些优势量热仪如何操作等温滴定量热法（Isothermal Titration Calorimetry, ITC）是近年来进展起来的一种讨论生物热力学与生物动力学的紧要方法等温滴定量热法（Isothermal Titration Calorimetry, ITC）是近年来进展起来的一种讨论生物热力学与生物动力学的紧要方法；它通过高灵敏度、高自动化的微量量热仪连续、精准地监测和记录一个变化过程的量热曲线；原位、在线和无损伤地同时供应热力学和动力学信息。
微量热法具有很多独特之处。
它对被讨论体系的溶剂性质、光谱性质和电学性质等没有任何限制条件；即具有非特异性的独特优势，样品用量小，方法灵敏度和精准明确度高（本仪器最小可检测热功率 2 nW，最小可检测热效应0.125uJ；生物样品最小用量0.4ug，温度范围2 ℃ —80 ℃，滴定池体积（1.43 ml）。
试验时间较短（典型的ITC试验只需30—60分钟，并加上几分钟的响应时间），操作简单（整个试验由计算机掌控；使用者只需输入试验的参数，如温度、注射次数、注射量等，计算机就可以完成整个试验，再由Origin软件分析ITC得到的数据）。
测量时不需要制成透亮清亮的溶液, 而且量热试验完毕的样品未遭破坏，还可以进行后续生化分析。
尽管微量热法缺乏特异性但由于生物体系本身具有特异性，因此这种非特异性方法有时可以得到用特异方法得不到的结果；这有助于发觉新现象和新规律，特别适应于讨论生物体系中的各种特异过程。
等温滴定量热仪具备了新奇的ITC技术及好的应用弹性，极适合于分子间交互作用之热力学驱动力的表征。
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等温滴定量热法对镇痛药与止吐药术后联合应用的相互作用研究
等温滴定量热法对镇痛药与止吐药术后联合应用的相互作用研究龚丽娜;李天佐【摘要】目的:采用等温滴定量热法探讨镇痛药与止吐药术后联合应用的相互作用,并明确可否同一装置给药.方法:根据临床用药习惯把试验样品分成四组,采用等温滴定量热法观察临床常用的术后镇痛药舒芬太尼、曲马多、羟考酮、氟比洛芬酯、右美托咪定及止吐药昂丹司琼的相容性.模拟手术室温度为25℃,测定各药物的热力学参数吉布斯自由能ΔG和结合常数焓变ΔH和熵变ΔS,得到相应的反应活性图谱,通过比较|ΔH|与T|ΔS|,结合数据绘图定性分析来判断溶合反应类型.结果:四组试验样品两两溶合过程中均为|ΔH|<T|ΔS|,反应活性谱热量变化(<0.05μJ)为熵驱动反应,未发生质变.结论:舒芬太尼、曲马多、羟考酮、氟比洛芬酯、右美托咪定及昂丹司琼结合未发生化学反应,临床上的联合应用是安全可靠的,可在同一给药装置配泵给药.【期刊名称】《中国医院用药评价与分析》【年(卷),期】2019(019)004【总页数】7页(P393-398,402)【关键词】术后镇痛药;同一装置给药;相容性;等温滴定量热法【作者】龚丽娜;李天佐【作者单位】首都医科大学附属世纪坛医院麻醉科,北京 100089;首都医科大学附属世纪坛医院麻醉科,北京 100089【正文语种】中文【中图分类】R969.2随着外科手术量的逐年增长、快速康复外科理念的影响及人们对术后舒适度的要求不断提高，术后镇痛泵的应用越来越多，应用的药物种类也在增加，多模式镇痛和联合用药已成为趋势[1-2]。
目前主要使用阿片类药物[3]、非甾体药及止吐药等。
理论上，根据不同药物的作用靶点不同的机制可使镇痛更加完善，减少各药物的不良反应[4]。
但临床实际应用中，各药物之间是否发生成分的改变尚不清楚，特别是术后镇痛泵中经常加入4种甚至更多药物在同一装置给药。
联合用药在具有优势的同时[5-7],也存在着风险和危害[8-9]。
等温滴定量热法
等温滴定量热法等温滴定量热法是一种利用液体滴定量热时所产生的温度变化来测量液体的热容量的测试方法。
为了更准确的测量液体的热容量，需要采取一些特殊的措施来确保滴定量热和温度测量的准确性，这种方法被称为等温滴定量热法。
等温滴定量热法可以分为实验设备搭建和数据处理两部分。
实验设备搭建方面，需要将液体装入一个可以精确控制温度的容器中，容器需要覆盖一个透明的盖子，以便能够直接观察液体的变化情况。
接下来，需要设置一个精密的热量传感器，将其安装到液体容器上，用于记录每次滴定量热的时间和温度变化情况。
最后，还需要安装一个仪表，用于实时监测液体温度的变化，以便在进行滴定量热实验时能够准确控制温度。
数据处理方面，首先，要确定每次滴定量热的温度变化，并记录每次滴定量热的温度变化；其次，要确定液体的热容量，在这一步，会使用一种称为伊曼纽尔定律的理论，根据每次滴定量热的温度变化，来计算液体的比热容量，从而确定液体的热容量。
等温滴定量热法一般应用于测量液体的比热容量，如水、油、乙醇等，可以精确测量液体的比热容量，提供准确的数据。
这一测试方法有利于实验室和工厂中精准检测液体热容量，是利用物理原理来进行测试的经典实验方法。
此外，等温滴定量热法也常常被用来与其他测试方法进行比较。
比如，它可以与蒸发法进行比较，以对比两种测试方法在测量液体热容量时的准确性。
比较的结果通常会发现等温滴定量热法更加准确，这也说明该方法在测量液体热容量方面有着更广泛的应用价值。
综上所述，等温滴定量热法是一种灵活的、准确的测试方法，可以帮助实验室和工厂精确测量液体的热容量，这一测试方法在许多物理和化学实验中被广泛应用，也为人们提供了更多可能性来研究液体热容量的具体变化情况。
itc等温滴定量热法
itc等温滴定量热法
ITC (等温滴定量热法) 是一种热学技术，用于测量液相或溶液
中化学反应、相互作用或结合反应的热量变化。
ITC 使用等温操作模式，通过将试剂溶液注入样品细胞中，然
后测量样品细胞中的温度变化，从而确定反应或相互作用发生时的热量变化。
ITC 可以提供关于反应或相互作用的热力学参数，例如焓变、
溶解热、结合热以及反应的热力学常数等。
这些参数可以用于揭示反应机理、评估配体-受体结合亲和力、研究酶动力学等。
ITC 技术在生物化学、药学、材料科学和环境科学等领域具有
广泛的应用。
它可以用于研究化学反应、生物分子的相互作用、药物与靶标之间的结合等。
兰州等温滴定量热
兰州等温滴定量热
摘要：
1.兰州等温滴定量热法的背景和原理
2.兰州等温滴定量热法的实验装置和步骤
3.兰州等温滴定量热法的应用领域和优势
4.兰州等温滴定量热法的发展前景和挑战
正文：
兰州等温滴定量热法是一种在等温条件下，通过滴定热量来测定物质热性质的实验方法。
该方法基于热力学原理，利用热电偶等温度传感器和精密热力学测量仪器，在特定的温度和压力下，通过滴定热量，来测量物质的比热容、热导率、相变潜热等热物性参数。
兰州等温滴定量热法的实验装置主要包括温度控制系统、滴定系统、数据采集和处理系统等部分。
实验步骤主要包括：样品准备、温度设定、滴定过程、数据采集和处理等。
首先，需要将待测物质溶解在特定溶剂中，然后将溶液注入滴定系统。
通过精密热力学测量仪器，实时监测溶液温度变化，根据热力学原理计算出物质的比热容、热导率、相变潜热等热物性参数。
兰州等温滴定量热法广泛应用于化学、石油、材料、环境等领域，为科学研究和工程设计提供了重要的热物性数据。
该方法具有高精度、高灵敏度、快速响应等优势，对于研究物质的热性质和热行为具有重要意义。
然而，兰州等温滴定量热法在实际应用中还存在一些挑战，如测量误差、设备稳定性、样品制备复杂等问题。
为了进一步提高测量精度和效率，未来需
要在实验装置的改进、数据处理方法的优化、样品制备技术等方面进行深入研究。
总之，兰州等温滴定量热法作为一种重要的热物性测量方法，在我国相关领域的科学研究和工程应用中发挥了重要作用。
等温滴定量热法应用
Example 2：Isothermal Titration Calorimetry for AIDS Drug Development艾滋病药物的等温滴定量热法人们付出了大量努力，试图利用药物帮助艾滋病受害者减少艾滋病流行所造成病毒感染。
热力学通过热力学解释实验热-滴定数据为此作出了贡献。
如图2-1所示，在艾滋病毒感染人体细胞后，产生一系列艾滋病毒的复制步骤。
受感染的细胞表达蛋白和蛋白酶；蛋白酶的作用在于蛋白酶切割聚蛋白，裂解的蛋白重新组装得到一个新的艾滋病病毒。
图2-1 HIV蛋白酶在病毒复制过程中合成新的病毒为了防止形成新的病毒，可通过引入药物使使HIV蛋白酶失活。
这种药物叫做蛋白酶抑制剂，可阻止多聚蛋白的分裂，如图2 – 2所示。
图２-２通过一直HIV蛋白酶从而组织新病毒的生成蛋白酶和抑制剂的关系可以用传统的锁钥机制描述，如图2 – 3所示。
抑制剂必须有正确的形状才能进入艾滋病毒蛋白酶的活性位点，其中，抑制剂是“钥匙”，必须保证适合蛋白酶这把“锁”。
然而，因为突变，艾滋病毒蛋白酶的活性位点可以以不同的形式存在，如图2 - 3所示；原株的活性位（锁）用“十”字表示，突变株活性位点（锁）用六边形表示。
我们需要寻找一种同时适合这两种形状的“锁”的药物（钥匙），不仅可以和原株蛋白酶的活性位点结合也与突变株蛋白酶的活性位点结合。
热力学可以帮助识别最佳候选药物。
图２-３传统“锁-匙”机制图2-4列出两种候选药物1和2。
药物2比1具有更好的适应性，同药物1相比的，它具有不对称的功能；甲苯基团的称性比叔丁基弱。
此外，药物2更灵活，因为它有两个可旋转的键，而药物1只有一个。
不对称和灵活性为药物提供了额外的构象，可以适应一个艾滋病毒突变位点。
图２-４两种候选药物１和２为定量衡量药物的效果，Ｏhtaka和Freire利用等温滴定量热（ITC）的热力学分析数据得到所需结果。
用A表示艾滋病毒蛋白酶，B表示抑制剂（药品）。
ITC(等温量热滴定法)
Q = f (t)
GE Healthcare 公开技术质料
ITC分析仪
ITC重要概念
与TP（左）：
KD = 120 nM, 但∆H异常（高出103倍） n = 0.01 过低
因此研究Y与BSA作对比 与BSA（右）： KD，∆H，n 均同Y与TP 的接近
与TP
与牛血清白蛋白BSA
Æ Y与TP无特异性结合，不适于进一步研究
GE Healthcare 公开技术质料
PL shrinkage NP-PL binding
∆H影响曲线与y-轴的截距
n影响积分曲线的拐点
K与结合位点总浓度n [Mt]影响积分曲线的整体形状
GE Healthcare 公开技术质料
ITC曲线分析：反应的结合推动力
吉布斯自由能（∆G）与结合常数（KD）相同、 但结合机理不同的两个结合反应 等温：∆G = ∆H -T ∆S
∆G < 0主要由-T ∆S贡献，该 反应为熵增推动的结合反应
GE Healthcare 公开技术质料
原始数据
ITC实验
积分结果
• 原始数据： 显示随着滴定进行，补偿加热丝补偿给样品池和参比池的热量速率差
• 积分结果： 将每次滴加所产生的热流差对时间进行积分，并以在对应时间点样品 池内反应物反应物的摩尔比为横轴 实线为最佳拟合曲线
ITC分析法能提供哪些信息？
ITC曲线积分结果 GE Healthcare 公开技术质料
反应导致熵减小（ -T ∆S > 0）， 但∆H减小很多，使∆G < 0反应
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Example 2：Isothermal Titration Calorimetry for AIDS Drug Development
艾滋病药物的等温滴定量热法
人们付出了大量努力，试图利用药物帮助艾滋病受害者减少艾滋病流行所造成病毒感染。
热力学通过热力学解释实验热-滴定数据为此作出了贡献。
如图2-1所示，在艾滋病毒感染人体细胞后，产生一系列艾滋病毒的复制步骤。
受感染的细胞表达蛋白和蛋白酶；蛋白酶的作用在于蛋白酶切割聚蛋白，裂解的蛋白重新组装得到一个新的艾滋病病毒。
图2-1 HIV蛋白酶在病毒复制过程中合成新的病毒
为了防止形成新的病毒，可通过引入药物使使HIV蛋白酶失活。
这种药物叫做蛋白酶抑制剂，可阻止多聚蛋白的分裂，如图2 – 2所示。
图２-２通过一直HIV蛋白酶从而组织新病毒的生成
蛋白酶和抑制剂的关系可以用传统的锁钥机制描述，如图2 – 3所示。
抑制剂必须有正确的形状才能进入艾滋病毒蛋白酶的活性位点，其中，抑制剂是“钥匙”，必须保证适合蛋白酶这把“锁”。
然而，因为突变，艾滋病毒蛋白酶的活性位点可以以不同的形式存在，如图2 - 3所示；原株的活性位（锁）用“十”字表示，突变株活性位点（锁）用六边形表示。
我们需要寻找一种同时适合这两种形状的“锁”的药物（钥匙），不仅可以和原株蛋白酶的活性位点结合也与突变株蛋白酶的活性位点结合。
热力学可以帮助识别最佳候选药物。
图２-３传统“锁-匙”机制
图2-4列出两种候选药物1和2。
药物2比1具有更好的适应性，同药物1相比的，它具有不对称的功能；甲苯基团的称性比叔丁基弱。
此外，药物2更灵活，因为它有两个可旋转的键，而药物1只有一个。
不对称和灵活性为药物提供了额外的构象，可以适应一个艾滋病毒突变位点。
图２-４两种候选药物１和２
为定量衡量药物的效果，Ｏhtaka和Freire利用等温滴定量热（ITC）的热力学分析数据得到所需结果。
用A表示艾滋病毒蛋白酶，B表示抑制剂（药品）。
我们定义一个解离常数Kd和它的倒数，缔合常数Ka，下标d表示分离，ａ表示缔合。
其中，[]代表在水溶液中物质的浓度。
对于好的药物,我们希望Kd很小或者Ka很大。
在A + B ----AB的反应中，A(蛋白酶)和B(抑制剂)的结合由标准焓和标准熵决定。
上o标表示标准状态。
等温滴定量热(ITC)提供了Kd(或Ka)以及∆Ｈo。
从以上数据，我们可以计算∆G o和∆S o。
图2-５显示第一代12种候选药物实验结果∆Go, ∆Ho和T∆So，蛋白酶是原株状态。
在图2 – 5中，第一代药物包含相对刚性分子（不灵活）。
使得它与蛋白酶活性位点相互作用不牢固，组成别的蛋白酶，因此，对这些药物，∆ Ho越小越好；在某些情况下，它是负值，绝对值小，而在其他情况下，∆ho是正值，此时最不利的。
然而，-T∆So是有利的，是因为结合后的疏水性药物释放水合分子，随后的熵的增加。
图２-５１２种候选药物
因为刚性的药物分子没有的灵活药物分子那么适合突变株蛋白酶,第二代药物比第一代药物相对灵活一些，如图２-５所示，这些药物的∆Ｈo是负值，但-T／So不是很好，是因为：当灵活的钥匙进入被限制的锁，它不仅失去平移的自由，同时也失去了旋转的自由，这些损失导致了熵的降低，这是不好的，灵活的药物比刚性药物有更大的熵损失(|-T/So|更小)。
平衡的不利熵损失较好的方法是更有牢固的结合（也就是更大的负值∆Ｈo）。
有图2-5可知，药品11和12是最好的，因为∆Ｈo和∆Go都较大且都是负值。
蛋白酶基因的突变是很常见的，所以我们需要找出一种抑制剂，它对原株蛋白酶有效，同时至少也对一些突变株的蛋白酶有效
从图2-6显示了不同抑制剂对原株蛋白酶和突变株蛋白酶的等温滴定量热的结果，纵坐标是解离常数Kd，我们希望Kd越小越好。
从图中可知大的负值∆Ｈo是很重要的，适应性好的11和12号药物对原株蛋白酶和突变株蛋白酶都具有较小的解离常数。
我们从图2-5的结果可知抑制剂11和12拥有这两种有利的特点∆Ｈo和∆Go都较大且都是负值，但从图2-6我们可以知道，虽然抑制剂11和12对原株蛋白酶的抑制作用都很好，但11对突变株蛋白酶的抑制作用更好，11优于12.
图2-6 10种抑制剂对原株蛋白酶和突变株蛋白酶的解离常数对于灵活的抑制剂，熵损失更大，这个损失是不利的，因为它降低了负值∆Go的绝对值。
我们希望得到一种抑制剂，它既有大的负值∆Ho，同时对突变株的蛋白酶也是有用的。
这种抑制剂不必太灵活，以免熵损失很大。
这个例子表明热力学研究对识别最优的HIV抑制剂有指导作用。