第四章分子生物学酶学及载体部分

(2)反应温度 12.5℃，一般14~16℃。
2.3 DNA聚合 酶
催化以DNA为模板合成DNA的一类酶。
大肠杆菌DNA聚合酶 常 用 的 聚 合 酶 Klenow fragment T7 DNA聚合酶 T4 DNA聚合酶 修饰过的T7 DNA聚合酶 逆转录酶
常用DNA聚合酶的特性比较
Ⅱ型限制性内切酶



1970年，由Smith和Wilcox从流感嗜血菌中分离出 来。分离的第一个酶是Hind Ⅱ。 限制-修饰系统分别由限制酶与修饰酶两种不同酶 分子组成，分子量小，能识别DNA的特殊序列， 种类多，在基因工程中起重要作用。 显著特点：能识别双链DNA的特殊序列，并在这 个序列内进行切割，产生特异的DNA片段。其种 类繁多 在基因工程技术中，I型酶不能用，Ⅲ型酶 基本不用， Ⅱ型酶最有用。
EcoR I等产生的5’粘性末端
粘性末端的意义




不同的DNA双链： 只要粘性末端碱基互补就可以连接,比连接两个平齐末端 容易的多。 同一个DNA分子内连接： 通过两个相同的粘性末端可以连接成环形分子。 凸出的5’末端可用DNA多核苷酸激酶进行32P标记。 凸出的3’端可以通过末端转移酶添加几个多聚核苷酸的尾 巴（如AAA或TTT等）造成人工粘性末端。 补平成平末端：粘性末端可以用DNA聚合酶补平成平齐 末端。
限制酶的分类与命名
限制性内切酶是微生物细胞中用于专门水解外源
DNA的一类酶，其功能是避免外源DNA的干扰或噬 菌体的感染，是细胞中的一种防御机制。 由于R/M现象的发现使得核酸内切酶成为基因工程 重要的工具酶。
根据酶的功能、大小和反应条件，及切割DNA的特
点，可以将限制性内切酶分为三类：Ⅰ型酶、Ⅱ 型酶、Ⅲ型酶。
• 识别双链DNA分子中4～8对碱基的特定序列
• 大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧
• 识别切割序列呈典型的旋转对称型回文结构

EcoR I的切割位点

5’… G C T G A A T T C G A G … 3’ 3’… C G A C T T A A G C T C … 5’
PstI等产生的3’黏性末端



F因子

F质粒，其大小约100kb，这是最早发现的一 种与大肠杆菌的有性生殖现象（接合作用） 有关的质粒。F质粒的存在会赋予宿主细胞 生成性菌毛。
抗性因子（Resistance factor，R因子）
产细菌素的质粒

细菌素一般根据产生菌的种类进行命名： 大肠杆菌（E. coli）产生的细菌素为 colicins（大肠杆菌素），而相应的质粒 被称为Col质粒
基本特性：以RNA为模板聚合 cDNA链
3’AAAAAAAAAAAA 5’TTTTTTTTTTTT AA
12-18
5’mRN oligo (dT) Mg2+ dNTP 5’mRN 3’cDNA A A
反转录 酶 3’AAAAAAAAAAAAA 5’TTTTTTTTTTTT A TT
2.4 修饰酶类
代谢质粒



质粒上携带有有利于微生物生存的基因， 如能降解某些基质的酶，进行共生固氮， 或产生抗生素（某些放线菌）等。 将复杂的有机化合物降解成能被其作为碳 源和能源利用的简单形式，环境保护方面 具有重要的意义。 假单胞菌：具有降解一些有毒化合物，如 芳香簇化合物(苯)、农药、辛烷和樟脑等的 能力。
质粒的不相容性：分子机制

两种含有不同复制子结构的不同质粒，在复制时各受自己 的拷贝数控制系统的调节，致使两种质粒的最终拷贝数恒 定，因此在经过若干复制周期和细胞分裂周期后仍能共处
于同一细胞内；

两种含有相似复制子结构的不同质粒，在复制时受到同一
种拷贝数控制系统的干扰，致使两种质粒的最终拷贝数不
识别序列
切割位点
距识别序列1kb处随机 识别序列内或附近 性切割 特异性切割
距识别序列下游2426bp处
I型限制性内切酶


I型酶属复合功能酶，兼具限制、修饰两种 功能。核酸内切酶、甲基化酶、ATP酶和 DNA解旋酶4种活性。 显著特点：识别位点与切割位点不一致。
酶分子首先由M. Meselson和R. Yuan在1968 年从大肠杆菌 B株和 K株分离的。 代表：EcoB和 EcoK。
三种类型限制酶的主要特性差异 比较
主要特性 限制修饰 蛋白结构 辅助因子 I 型 多功能 异源三聚体 ATP、Mg2+、SAM（S腺苷甲硫氨酸 ） TGAN8TGCT AACN6GTGC Ⅱ 型 单功能 同源二聚体 Mg2+ 旋转对称序列 Ⅲ型 双功能 异源二聚体 ATP、Mg2+、 SAM GAGCC CAGCAG
在基因克隆技术中，除了限制酶、连接酶、聚 合酶这些主要的工具酶外，还经常使用某些酶
的相关功能对DNA或RNA进行分子修饰，以使
操作更加巧妙、简便和高效。
2.4.2 碱性磷酸单酯酶
来自小牛胸腺的碱性磷酸单酯酶（CIP）
来自大肠杆菌的碱性磷酸单酯酶（BAP）
5’p
DNA or RNA
OH 3’
限制酶的命名

1973年Smith和Nathams提出限制酶的命名原则， 1980年Roberts对其系统化，如今简化成：
H i n d Ⅲ，来源菌株

Haemophilus influenzae d 嗜血流感杆菌d株
H
微生物属名
in
种名
d
Ⅲ
发现 序数
株名(品系)
Ⅱ型限制酶的特性与DNA切 割
基本特点
DNA连接酶的连接作用
(1)连接条件
1）必须是两条双链DNA。 2）DNA3’端有游离的-OH， 5’端有一个磷酸基团（P）。 3）需要能量 动物或噬菌体中：ATP 大肠杆菌中： NAD+
连接酶反应条件
试剂 Tris-HCl MgCl2 条件 50～100 mM, pH 7.5 10 mM 试剂 DTT Volume 条件 5 mM 10 - 20 ml
5OH
3’HO
碱性磷酸酶
5OH 3’HO
OH 3’ OH 5’
注意
CIP的比活性比BAP的高出10～20倍
CIP在SDS中68℃就可完全失活
而BAP却是热抗性酶。
载体

载体（vector）：能够将外源DNA或者基因 携带进入宿主细胞的工具。 载体的作用：
运送外源基因高效转入受体细胞

为外源基因提供复制能力或整合能力 为外源基因的扩增或表达提供必要的条件



同序异切酶——识别序列相同，切割位置 不同
KpnⅠ ： GGTAC↓C Acc65Ⅰ ： G↓GTACC


同功多位——识别简并序列的限制酶包含 了另一种限制酶的功能
EcoRⅠ ： G↓AATTC ApoⅠ ： R↓AATTY HpaⅠ： GTT↓AAC HincⅡ ：GTY↓RAC
质粒的不相容性

任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时存在 于一个细胞中，这种现象称为质粒的不相容性，不相容性 的质粒组成不相容性群

以大肠杆菌的质粒为例：
ColE1、pMB1 拥有相似的复制子结构，彼此不相容
pSC101、F、RP4 拥有相似的复制子结构，彼此不相容
p15A及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此不相容
限制酶产生平末端

切割回文对称序列，产生平末端 HaeⅢ（GG↓CC） EcoRV（GAT↓ATC）
同裂酶
同裂酶：来源不同，识别相同的序列的限 制性内切酶。 同序同切酶——识别序列和切割位置都相 同；
HindⅡ 与 HincⅡ 识别切割位点为 GTY↓RAC HpaⅡ 与 HapⅡ 识别切割位点为 C↓CGG MobⅠ 与 Sau3AⅠ 识别切割位点为 ↓GATC
ATP
0.5 - 1 mM
T t
4 - 15 ℃ 4 - 16 h
1 U DNA连接酶的酶活性：在最佳反应条 件下15℃反应 1 h，完全连接 1 mg l-DNA （Hind Ⅲ片段）所需的酶量。
影响连接反应的因素
(1)插入片段与载体的浓度比例
10～20倍。增加插入片段与载体的接触 机会，减少载体自我连接的现象。
5’ HO
OH 3’
5’ppp dN 5’pppN
BAP / CIP
5’HO dN 5’HO N
功能：催化核酸脱5`-磷酸基团，使DNA或RNA片 段5`-P末端转换成5`-OH末端。
碱性磷酸酶的活性
5’p 3’HO p 5’ 碱性磷酸酶 OH 3’ OH 5’ 5’p 3’HO OH 3’ p 5’ OH 3’

在距离特异性识别位点约1000～1500 bp处 随机切开一条单链。
Recognize site
cut 1-1.5kb
Ⅲ类限制性内切酶



有核酸内切酶和甲基化酶作用。酶分子由 两个亚基组成。M亚基负责位点识别与修 饰，R亚基具有核酸酶活性。 在完全肯定的位点切割DNA，但反应需 要ATP、 Mg2+和SAM（S-腺苷甲硫氨 酸 ）。 在基因工程操作中用途不大。

同尾酶



同尾酶：来源不同，识别序列不同，但产 生黏末端相同的限制性内切酶 杂种位点（hybrid site）——由一对同尾酶 分别产生的粘性末端共价结合形成的位点。 一般不能被原来的任何一种同尾酶识别。
星号活性
2. DNA连接酶
修复双链DNA上缺口处的磷酸二酯键。
基本性质
大肠杆菌DNA连接酶 只能催化双链DNA的互补黏性末端，以 NAD+为能量。 T4噬菌体连接酶 黏性、平末端均可连接，以ATP为能量。


绝大多数的质
粒是DNA型的

质粒DNA的分子量
范围：1 - 300 kb
质粒的种类
根据质粒所编码的功能和赋予宿主的表型 效应分类 致育因子（Fertility factor，F因子） 抗性因子（Resistance factor，R因子） 产细菌素质粒（Bacteriocinproduction plasmid） 毒性质粒（virulence plasmid） 代谢质粒（Metabolic plasmid）
基因工程的操作过程
DNA的体外重组（切、接） 重组DNA分子的转化和扩增（转、增） 转化子的筛选和鉴定（检）
基因工程的操作过程
切 接 转
增
检
DNA的体外重组（切、接）
• 限制性核酸内切酶 限制性核酸内切酶的发现及其生物功能；限制酶的分类与命名； Ⅱ型限制酶的特性与DNA切割；影响限制性核酸内切酶活性的 因素； • DNA连接酶 基本性质；连接作用；影响连接反应的因素； • DNA聚合酶 大肠杆菌DNA聚合酶；Klenow fragment；T7 DNA聚合酶；T4 DNA聚合酶；修饰过的T7 DNA聚合酶；逆转录酶； • 核酸修饰酶 核酸酶；碱性磷酸单酯酶；T4多核苷酸激酶；末端转移酶。
质粒的自主复制性

质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行自主复制，质粒 DNA上的复制子结构决定了质粒与寄主的对应关系。

根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为
严紧型复制控制的质粒 1 - 3 拷贝 松弛型复制控制的质粒 10 - 60 拷贝 stringent plasmid stringent plasmid
3’5’外 5’3’外 聚合速 切酶活性 切酶活 率 性 大肠杆菌DNA 低 有 中 聚合酶 Klenow 低 无 中 fragment T4DNA聚合酶 高 无 中 DNA聚合酶 持续 能力 低
低
低
T7DNA聚合酶
化学修饰 T7DNA聚合酶 逆转录酶
高
无
无
无
快
快
高
高
无
无
低
中
2.3.5 反转录酶
Baidu Nhomakorabea
1.限制性核酸内切酶
• 核酸酶是通过切割相邻的两个核苷酸残基间的磷酸二酯键， 导致多核苷酸链共价键断裂的一类水解酶。 • 按水解底物可分为核糖核酸酶(RNase)和脱氧核糖核酸酶
(DNase)。
• 按其水解断裂核酸分子的不同方式： 核酸外切酶(exonuclease)：从核酸末端顺次水解磷酸二酯 键； 核酸内切酶(endonuclease)：从核酸内部磷酸二酯键。
载体应该具备的特征

具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性）
具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位
点

具有较高的外源DNA的载装能力
具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点
具有合适的筛选标记
一 质粒载体

质粒：质粒是生物细胞内固有的、能独立于寄主染色体而 自主复制、并被稳定遗传的一类核酸分子，绝大多数的天 然DNA质粒具有共价、封闭、环状的分子结构，即 cccDNA 质粒常见于细菌和真菌中