条件性基因敲除与敲入ppt课件
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CRISPRCas精细原理基因敲除点突变基因插入(共14张PPT)
第9页，共14页。
2.1 CRISPR-Cas9介导的基因组精确编辑技术
CRISPRs技术是一种由RNA指导Cas蛋白对靶向基因进行修饰的技术。
Mali 等人 利用来自酿脓链球菌和嗜热链球菌中的CRISPR 相关蛋白Cas9，在一段 人为重组的sgRNA( small-guide RNA) 的引导下，针对小鼠和人类基因组的特定 基因片段实现了精确的剪切。这种通过可编程RNA 进行DNA 改造的技术为基因组 编辑开创了一条新的途径。
第6页，共14页。
1.3 CRISPR-CAS 系统的作用机理
CRIPSR 基因座的表达 (包括转录和转录后的成熟 加工)
当该噬菌体再次入侵细菌时， CRISPR 簇首先转录为长的crRNA 前体，然后逐步被加工成小的成 熟的crRNA。 CRISPR/Cas 系统活性的发挥 或者是对外源遗传物质的干扰
DNA序列进行改造的遗传操作技术。 这种技术的原理是构建一个人工内切酶，在预
定的基因组位置切断DNA，切断的DNA在被 细胞内的DNA修复系统修复过程中会产生突变 ，从而达到定点改造基因组的目的。
通过修复途径，基因组编辑技术可以实现 三种基因组改造，即基因敲除，特异突变 的引入和定点转基因
基因组编辑是研究基因功能的重要手段 之一，也可被用于人类遗传性疾病的治 疗，因此这类技术成为现代分子生物学 的研究热点
基因组编辑技术是一种可以在基因组水平上对DNA序列进行改造的遗传操作技术。
C2物C0RR的0II5SSRPP年NRR2A发／s0i技现方C0遗 似术Ca式5sR是9抵I传 于系S一年抗P统种R外物 真用发由的源于R间遗质 核N转现隔传A录指序物高 生C抑导列质制CR度 物(的sa需p入sIa要蛋同 的Sc侵eP白Pr。A)对与源RMR靶宿（N向，３主的A基b菌p推因的）i间进染和方测行色至隔修体少式细饰序外12的抵的b菌p列技遗的抗术传g可(R。物sN外质pA能－高a源Ｄ度c通eＮ同遗rＡ源过)配，与传对推C测宿物R细I主菌质S可P菌能的R通的入过系C染R侵I统SP色。R可系体统能可外能以以的类类似于真核生 3当在、该C转R噬I化S菌2P感体R0受/再0C噬态a7次s，9菌入年的质侵Ⅱ粒体细，型小菌系提入时B统，，中a测侵Cr将序RrCI；验SaaP证snR9。中g簇的年o首切u先割，转等域录M突为首变长a，的次r会crr使Ra发NCfAaf现前si9n体蛋i细，白等然失菌后去发逐对可步Ｄ现被Ｎ能加Ａ细工的利成切菌小割用的活C成性CR熟，RI的但SSc不rPRP影NR响RA。其系系与Ｄ统统ＮＡ能抵结合阻抗的能止力。 3 CRISPR-C外AS源系统质的作粒用机的理 转移，首次利用实验验证了CRISPR 系统的功能
2.1 CRISPR-Cas9介导的基因组精确编辑技术
CRISPRs技术是一种由RNA指导Cas蛋白对靶向基因进行修饰的技术。
Mali 等人 利用来自酿脓链球菌和嗜热链球菌中的CRISPR 相关蛋白Cas9，在一段 人为重组的sgRNA( small-guide RNA) 的引导下，针对小鼠和人类基因组的特定 基因片段实现了精确的剪切。这种通过可编程RNA 进行DNA 改造的技术为基因组 编辑开创了一条新的途径。
第6页，共14页。
1.3 CRISPR-CAS 系统的作用机理
CRIPSR 基因座的表达 (包括转录和转录后的成熟 加工)
当该噬菌体再次入侵细菌时， CRISPR 簇首先转录为长的crRNA 前体，然后逐步被加工成小的成 熟的crRNA。 CRISPR/Cas 系统活性的发挥 或者是对外源遗传物质的干扰
DNA序列进行改造的遗传操作技术。 这种技术的原理是构建一个人工内切酶，在预
定的基因组位置切断DNA，切断的DNA在被 细胞内的DNA修复系统修复过程中会产生突变 ，从而达到定点改造基因组的目的。
通过修复途径，基因组编辑技术可以实现 三种基因组改造，即基因敲除，特异突变 的引入和定点转基因
基因组编辑是研究基因功能的重要手段 之一，也可被用于人类遗传性疾病的治 疗，因此这类技术成为现代分子生物学 的研究热点
基因组编辑技术是一种可以在基因组水平上对DNA序列进行改造的遗传操作技术。
C2物C0RR的0II5SSRPP年NRR2A发／s0i技现方C0遗 似术Ca式5sR是9抵I传 于系S一年抗P统种R外物 真用发由的源于R间遗质 核N转现隔传A录指序物高 生C抑导列质制CR度 物(的sa需p入sIa要蛋同 的Sc侵eP白Pr。A)对与源RMR靶宿（N向，３主的A基b菌p推因的）i间进染和方测行色至隔修体少式细饰序外12的抵的b菌p列技遗的抗术传g可(R。物sN外质pA能－高a源Ｄ度c通eＮ同遗rＡ源过)配，与传对推C测宿物R细I主菌质S可P菌能的R通的入过系C染R侵I统SP色。R可系体统能可外能以以的类类似于真核生 3当在、该C转R噬I化S菌2P感体R0受/再0C噬态a7次s，9菌入年的质侵Ⅱ粒体细，型小菌系提入时B统，，中a测侵Cr将序RrCI；验SaaP证snR9。中g簇的年o首切u先割，转等域录M突为首变长a，的次r会crr使Ra发NCfAaf现前si9n体蛋i细，白等然失菌后去发逐对可步Ｄ现被Ｎ能加Ａ细工的利成切菌小割用的活C成性CR熟，RI的但SSc不rPRP影NR响RA。其系系与Ｄ统统ＮＡ能抵结合阻抗的能止力。 3 CRISPR-C外AS源系统质的作粒用机的理 转移，首次利用实验验证了CRISPR 系统的功能
基因功能研究技术之基因敲除及基因编辑技术ppt课件
Donor plasmid
点突变 Left arm Right arm
Donor plasmid
同源重组发生率升高几个数量级
33
TALEN的最前沿
2011年8月， Nature Biotechnology 上同时发表了用TALEN 技术 进行基因敲除的4篇研究文章，另加一篇综述。
• 一篇人类干细胞 《Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases》
• 但是，该技术制备复杂，成本昂贵，而且其技术 专利被少数几家商业公司控制。
24
（二）
25
崭新的技术解决经典的挑战
崭新的技术 - TALEN 经典的挑战 – 染色体DNA序列的人工编辑修改
• （点）突变：Silent；Missense； Nonsense；Frame shift （基因敲除， Knockout） • 片段删除 • 片段插入 目的与用途：生物模型；表达工具；基因治疗
15
条件型基因打靶的优势： 1. 克服了重要基因被敲除所导致的早期致死 2. 并能客观、系统地研究基因在组织器官发生、发育以及
疾病发生、治疗过程中的作用和机制
这一技术亦存在一些缺点： 1. 费用太高 2. 周期较长 3. 许多基因在剔除后并未产生明显的表型改变，可能是这
些基因的功能为其他基因代偿所致
• 5' - ATAACTTCGTATA - ATGTATGC - TATACGAAGTTAT - 3' • 3' - TATTGAAGCATAT - TACATACG - ATATGCTTCAATA - 5'
9
• Cre-LoxP系统的特性
点突变 Left arm Right arm
Donor plasmid
同源重组发生率升高几个数量级
33
TALEN的最前沿
2011年8月， Nature Biotechnology 上同时发表了用TALEN 技术 进行基因敲除的4篇研究文章，另加一篇综述。
• 一篇人类干细胞 《Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases》
• 但是，该技术制备复杂，成本昂贵，而且其技术 专利被少数几家商业公司控制。
24
（二）
25
崭新的技术解决经典的挑战
崭新的技术 - TALEN 经典的挑战 – 染色体DNA序列的人工编辑修改
• （点）突变：Silent；Missense； Nonsense；Frame shift （基因敲除， Knockout） • 片段删除 • 片段插入 目的与用途：生物模型；表达工具；基因治疗
15
条件型基因打靶的优势： 1. 克服了重要基因被敲除所导致的早期致死 2. 并能客观、系统地研究基因在组织器官发生、发育以及
疾病发生、治疗过程中的作用和机制
这一技术亦存在一些缺点： 1. 费用太高 2. 周期较长 3. 许多基因在剔除后并未产生明显的表型改变，可能是这
些基因的功能为其他基因代偿所致
• 5' - ATAACTTCGTATA - ATGTATGC - TATACGAAGTTAT - 3' • 3' - TATTGAAGCATAT - TACATACG - ATATGCTTCAATA - 5'
9
• Cre-LoxP系统的特性
分子生物学课件：基因敲除
P53 gene P53基因没有被替换
Neo gene Neor基因进入ES细胞的基因组 在G418、单核苷酸类似物的培养 基中，可以存活。
P53 gene Neo gene HSV-Tk
Neor基因和HSV-TK基因同时进入ES 细胞的基因组 在G418培养基中存活，但是含有单核苷 酸类似物培养基中死亡。
2
3A
3B
嵌合体
与阴性小鼠 交配
1
3D
基因敲除的 纯合子小鼠
杂合子小鼠
3C
扩展知识：
上述基因打靶策略虽然实现了目标基因的特异失活， 但基因组中引入了一个外源标记的基因（NeoR), 该基因会 影响机体正常的功能。怎么改进？
有些基因是胚胎生长发育过程中非常重要的基因，一旦被 敲除可导致胚胎发育受损甚至不能发育为一个个体, 针对这 类基因如何采用基因敲除技术进行研究呢？
➢ 如果Tk 基因进入细胞，在含单核苷酸类似物的培养基中生长时会 因为以上分解反应产生的有毒物质而死亡
筛选标志在这个过程中如何发挥作用的？
正负筛选系统பைடு நூலகம்作原理
1. 同源重组
10-5-10-6
Neo HSV-Tk P53 gene
ES cells
P53 gene P53基因被替换
2. 随机插入，非同源重组
如果基因组序列是：
123
待敲除基因
4
基因敲除载体的结构是：
LoxP
TK
4
LoxP
LoxP
Neo
•使待敲除基因位于两个LoxP位点之间
基本流程：
•条件性基因敲除载体的构建 •在ES细胞中进行第一次常规性基因敲除
Genomic DNA:
123
Neo gene Neor基因进入ES细胞的基因组 在G418、单核苷酸类似物的培养 基中，可以存活。
P53 gene Neo gene HSV-Tk
Neor基因和HSV-TK基因同时进入ES 细胞的基因组 在G418培养基中存活，但是含有单核苷 酸类似物培养基中死亡。
2
3A
3B
嵌合体
与阴性小鼠 交配
1
3D
基因敲除的 纯合子小鼠
杂合子小鼠
3C
扩展知识：
上述基因打靶策略虽然实现了目标基因的特异失活， 但基因组中引入了一个外源标记的基因（NeoR), 该基因会 影响机体正常的功能。怎么改进？
有些基因是胚胎生长发育过程中非常重要的基因，一旦被 敲除可导致胚胎发育受损甚至不能发育为一个个体, 针对这 类基因如何采用基因敲除技术进行研究呢？
➢ 如果Tk 基因进入细胞，在含单核苷酸类似物的培养基中生长时会 因为以上分解反应产生的有毒物质而死亡
筛选标志在这个过程中如何发挥作用的？
正负筛选系统பைடு நூலகம்作原理
1. 同源重组
10-5-10-6
Neo HSV-Tk P53 gene
ES cells
P53 gene P53基因被替换
2. 随机插入，非同源重组
如果基因组序列是：
123
待敲除基因
4
基因敲除载体的结构是：
LoxP
TK
4
LoxP
LoxP
Neo
•使待敲除基因位于两个LoxP位点之间
基本流程：
•条件性基因敲除载体的构建 •在ES细胞中进行第一次常规性基因敲除
Genomic DNA:
123
博士专题：基因功能研究技术之基因敲除及基因编辑技术讲课讲稿101页PPT
40、人类法律，事物有规律，这是不 容忽视 的。— —爱献 生
31、只有永远躺在泥坑里的人，才不会再掉进坑里。——黑格尔 32、希望的灯一旦熄灭，生活刹那间变成了一片黑暗。——普列姆昌德 33、希望是人生的乳母。——科策布 34、形成天才的决定因素应该是勤奋。——郭沫若 35、学到很多东西的诀窍，就是一下子不要学很多。——洛克
博士专题：基因功能研究技术之基因 敲除及基因编辑技术讲课讲稿
36、如果我们国家的法律中只有某种 神灵， 而不是 殚精竭 虑将神 灵揉进 宪法， 总体上 来说， 法律就 会更好 。—— 马克·吐 温 37、纲纪废弃之日，便是暴政兴起之 时。— —威·皮 物特
38、若是没有公众舆论的支持，法律 是丝毫 没有力 量的。 ——菲 力普斯 39、一个判例造出另一个判例，பைடு நூலகம்们 迅速累 聚，进 而变成 法律。 ——朱 尼厄斯
博士专题：基因功能研究技术之基因敲除及基因编辑技术 PPT
靶向基因技术
• 经典方法 ：
– 自杀质粒，同源重组 – 几率低(~1 HR event per 106 cells），难！
• 饱含希望与失望的技术：
– ZFN，被Sigma公司垄断
• 新的里程碑：
– TALEN
TALEN技术
基于TALEN (transcription activator-like (TAL) effector nucleases，类转录因子效应物核酸酶)的靶向基因敲除技术是一 种崭新的分子生物学工具，现已应用于细胞、酵母、斑马鱼与大 鼠等各类研究对象。
• 常见的几种诱导型基因敲除类型有：四环素诱导型； 干扰素诱导型；激素诱导型；腺病毒介导型。
III、基因编辑技术
• ZFN系统 • TALEN系统 • CRISPR/Cas 系统
（一）ZFN技术系统
ZFN 技术原理
锌指核酸酶（Zinc-finger nucleases, ZFN）是人工改造的限制性核酸内 切酶，利用不同的锌指结构识别特异DNA序列，利用核酸酶切断靶DNA。
• 一篇人类干细胞 《Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases》
• 一篇大鼠 《Knockout rats generated by embryo microinjection of TALENs》
• 两篇斑马鱼 《Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells using engineered TALENs》
• 条件型基因敲除法可定义为将某个基因的敲除限 制于小鼠某些特定类型的细胞或发育的某一特定 阶段的一种特殊的基因敲除方法。
基因敲除方法专题-郭..55页PPT
生物学家的梦想：随心所欲地操作基因
经典基因操作： 1. Gene trap: 化学诱变； 转座子--------海量的筛选+good Luck 2. 同源重组：一般物种几率低, 10-6 ； ES cell 10-2 难！ 3.突破性的发现： RNAi-Knockdown; 不完全敲除，临时性。
4.充满梦想却幻灭的ZFN： • 难以完全找到匹配的3连子锌指； • Off-target 严重。 美国加州大学Dave Segal教授说： “ With zinc fingers, we have to let the DNA tell us where we target” 5.完美基因靶向操作： 识别特异DNA序列结构+操作DNA的酶 划时代的基因靶向操作技术： TALE与 CRISPR/Cas9使靶向操作不再是梦
前言
Ø什么是基因？
Ø为什么要研究基因？
Ø如何研究？
位置—分类--结构—功能
原核体外表达
蛋白质功能 体外鉴定
真核过表达 转基因
基因敲除
进一步验证
定量表达 表达规律-qPCR
体内蛋白水平 验证
Western blotting
如何获取基因
Ø同源克隆： 已知基因序列比对---保守区---简并引物设计---未知物种中分离 ---RACE获得全长---结构解析---表达分析---功能比较与验证等
杆线虫(Caenorhabditis.elegans)
的par-1基因的表达以探讨该基因 的功能,结果反义RNA的确能够阻断 基因的表达,但是奇怪的是,注入正 义链RNA(sense RNA)作为对照,也 同样阻断了基因的表达。这与传统 上对反义RNA技术的解释正好相反
反义RNA技术
《基因敲除技术》PPT课件
16
1.什么是传统机械按键设计？
传统的机械按键设计是需要手动按压按键触动PCBA上的开关按键来实现功 能的一种设计方式。
传统机械按键结构层图：
按键
PCBA
开关键
传统机械按键设计要点：
1.合理的选择按键的类型，尽量选择 平头类的按键，以防按键下陷。
2.开关按键和塑胶按键设计间隙建议 留0.05~0.1mm，以防按键死键。 3.要考虑成型工艺，合理计算累积公 差，以防按键手感不良。
系统来介导Cre 的表达，则可省去建立携带 Cre 的转基因动物的过程。
15
2.2利用随机插入突变进行基因敲除。
2.2.1 原理：
此法利用某些能随机插入基因序列的病毒，细菌或 其他基因载体，在目标细胞基因组中进行随机插入 突变，建立一个携带随机插入突变的细胞库，然后 通过相应的标记进行筛选获得相应的基因敲除细胞 （原理见图5）[11,12] 。根据细胞的不同，插入载 体的选择也有所不同。逆转率病毒可用于动植物细 胞的插入；对于植物细胞而言农杆菌介导的T-DNA 转化和转座子比较常用；噬菌体可用于细菌基因敲 除。
ｄ．选择筛选已击中的细胞：由于基因转移的同源重组自然 发生率极低，动物的重组概率为10－2～10-5，植物的概率 为10－4～10－5。因此如何从众多细胞中筛出真正发生了同 源重组的胚胎干细胞非常重要。目前常用的方法是正负筛选 法（PNS法），标记基因的特异位点表达法以及PCR法。其中 应用最多的是PNS法。
并且这种效应可以传递到子代细胞中,所以 RNAi的反应过程也可以用于基因敲除。近年 来，越来越多的基因敲除采用了RNAi这种更 为简单方便的方法。
23
2.3.1 RNAi阻断基因表达的机理 双链RNA进入细胞后，能够在Dicer酶的作用下被裂
1.什么是传统机械按键设计？
传统的机械按键设计是需要手动按压按键触动PCBA上的开关按键来实现功 能的一种设计方式。
传统机械按键结构层图：
按键
PCBA
开关键
传统机械按键设计要点：
1.合理的选择按键的类型，尽量选择 平头类的按键，以防按键下陷。
2.开关按键和塑胶按键设计间隙建议 留0.05~0.1mm，以防按键死键。 3.要考虑成型工艺，合理计算累积公 差，以防按键手感不良。
系统来介导Cre 的表达，则可省去建立携带 Cre 的转基因动物的过程。
15
2.2利用随机插入突变进行基因敲除。
2.2.1 原理：
此法利用某些能随机插入基因序列的病毒，细菌或 其他基因载体，在目标细胞基因组中进行随机插入 突变，建立一个携带随机插入突变的细胞库，然后 通过相应的标记进行筛选获得相应的基因敲除细胞 （原理见图5）[11,12] 。根据细胞的不同，插入载 体的选择也有所不同。逆转率病毒可用于动植物细 胞的插入；对于植物细胞而言农杆菌介导的T-DNA 转化和转座子比较常用；噬菌体可用于细菌基因敲 除。
ｄ．选择筛选已击中的细胞：由于基因转移的同源重组自然 发生率极低，动物的重组概率为10－2～10-5，植物的概率 为10－4～10－5。因此如何从众多细胞中筛出真正发生了同 源重组的胚胎干细胞非常重要。目前常用的方法是正负筛选 法（PNS法），标记基因的特异位点表达法以及PCR法。其中 应用最多的是PNS法。
并且这种效应可以传递到子代细胞中,所以 RNAi的反应过程也可以用于基因敲除。近年 来，越来越多的基因敲除采用了RNAi这种更 为简单方便的方法。
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2.3.1 RNAi阻断基因表达的机理 双链RNA进入细胞后，能够在Dicer酶的作用下被裂
分子生物技术《转基因、基因克隆与基因敲除技术》课件
4、转基因大豆、西红柿、玉米等。
我室构建：
ALA过表达小鼠，体内血红素增加。
成功制作内含子Micro-RNA-483过表达转 基因小鼠，证明了其直接靶向细胞因子信 号因子3（Socs3)de 3’UTR.
（博士论文，研究其与宿主基因Igf2的表 达与功能的关系）
成功制作内含子Micro-RNA-483过表达转 基因小鼠—
待剔除基因
克隆载体
克 隆
重组载体
切割基因使待剔 除基因失去活性
连接
阳性标记基因Neor
打靶载体
HSV-tk 转入胚胎肝细胞
这样打靶载体包含了： 1、部分待剔除的基因片段，（用于与野生型的该基因 进行交换重组） 2、阳性筛选标志基因（Neor ，neomycinresistance gene) 、使细胞具有抵抗G418（能被新 霉素抵抗基因的表达产物分解）的能力。 3、阴性筛选标志基因即胸苷酸激酶(thymidine kinase-tk)基因，来自单纯庖疹病毒（HSV），当它 在受体细胞内合成出tk时，可以分解细胞培养液中加入 更昔洛韦，即gangcyclovir（一种环鸟苷酸底物)而产 生有毒的分解物使细胞死亡，为阴性筛选标志。
胚胎干细胞
HSV-tk
褐色大鼠 、 制 备 基 因 敲 除 的 胚 胎 干 细 胞
A
在特定基因剔除时，利用打靶载体上留下的部分待 剔除的基因片段作为基因组上相同基因的同源臂，当打 靶载体与细胞基因组的同源基因发生同源重组时（联 会），打靶载体上的失活基因替代基因组上的基因，同 时利用插入在基因同源臂之间的阳性、阴性标志基因进 行筛选鉴定。
新霉素抗性基因 (neo)是真核表达载体的 常用筛选标志 ,neo基因编码新霉素磷酸转 移酶Ⅱ(NPTⅡ) ,能催化G418、卡那霉素 等多种氨基糖苷抗生素分子磷酸化而使之 失去抗菌活性
我室构建：
ALA过表达小鼠，体内血红素增加。
成功制作内含子Micro-RNA-483过表达转 基因小鼠，证明了其直接靶向细胞因子信 号因子3（Socs3)de 3’UTR.
（博士论文，研究其与宿主基因Igf2的表 达与功能的关系）
成功制作内含子Micro-RNA-483过表达转 基因小鼠—
待剔除基因
克隆载体
克 隆
重组载体
切割基因使待剔 除基因失去活性
连接
阳性标记基因Neor
打靶载体
HSV-tk 转入胚胎肝细胞
这样打靶载体包含了： 1、部分待剔除的基因片段，（用于与野生型的该基因 进行交换重组） 2、阳性筛选标志基因（Neor ，neomycinresistance gene) 、使细胞具有抵抗G418（能被新 霉素抵抗基因的表达产物分解）的能力。 3、阴性筛选标志基因即胸苷酸激酶(thymidine kinase-tk)基因，来自单纯庖疹病毒（HSV），当它 在受体细胞内合成出tk时，可以分解细胞培养液中加入 更昔洛韦，即gangcyclovir（一种环鸟苷酸底物)而产 生有毒的分解物使细胞死亡，为阴性筛选标志。
胚胎干细胞
HSV-tk
褐色大鼠 、 制 备 基 因 敲 除 的 胚 胎 干 细 胞
A
在特定基因剔除时，利用打靶载体上留下的部分待 剔除的基因片段作为基因组上相同基因的同源臂，当打 靶载体与细胞基因组的同源基因发生同源重组时（联 会），打靶载体上的失活基因替代基因组上的基因，同 时利用插入在基因同源臂之间的阳性、阴性标志基因进 行筛选鉴定。
新霉素抗性基因 (neo)是真核表达载体的 常用筛选标志 ,neo基因编码新霉素磷酸转 移酶Ⅱ(NPTⅡ) ,能催化G418、卡那霉素 等多种氨基糖苷抗生素分子磷酸化而使之 失去抗菌活性
基因敲除ppt课件
LoxP
Cre
Target gene
它是将cre 基因与各种组织(位点、时间、发育阶段)
特异性的启动子连接构建载体，获得相应的转基因 小鼠。即可通过诱导表达Cre 重组酶而将lox P 位点 间的基因切除,从而实现特定基因在特定时间的失活。
1.2.3 Cre-LoxP系统的实验方案
（1）在胚胎干细胞（ES ）中通过置换型载体进 行同源重组，向基因组靶位点引入选择标记基因， 并在其两侧引入两个同向排列的Loxp位点。将该 ES细胞打入假孕母鼠中，发育成“floxed小鼠”。
•neo 基因有双重作用,一方面形成靶位基因的插入突 变，同时作为正向筛选的标记。
•HSV - tk 基因是负选择基因，含有HSV - tk (胸苷 激酶蛋白)的重组细胞在GANC 培养基中不能存活。
胸苷激酶蛋白（TK）可使无毒性的丙氧鸟苷（GANC）转变为毒性核苷酸而 杀死细胞。
外源 基因
整合到染色体 的其他位置
基因转座常伴随着基因缺失、重排等，因而可以 应用到基因敲除。
1.3.2 基因敲除与RNAi的关系
•RNAi是指通过双链RNA介导特异性降解靶mRNA， 导致转录后水平基因沉默的现象。 •RNAi是从转录水平抑制基因的作用，也可以看作是 基因敲除的一种形式。
DNA mRNA
（2）显微注射方法获得转基因“Cre 小鼠”，此 转基因小鼠在特定的启动子下表达Cre重组酶。 （3）“Cre小鼠”跟“floxed小鼠”交配，Cre 重组酶会切掉Loxp位点之间的靶基因和1个 Loxp位点，从而达到靶基因的失活或敲除。
此外，还可以从细胞水平进行Cre-LoxP系统实验。
1.3 其他基因敲除技术
3’ 5’
Exo蛋白 3’ 5’
基因功能研究技术之基因敲除及基因编辑技术ppt课件
.
5
（二）条件型基因敲除
• 条件型基因敲除法可定义为将某个基因的敲除限 制于小鼠某些特定类型的细胞或发育的某一特定 阶段的一种特殊的基因敲除方法。
• 该系统在80年代被引入后，已成功被应用于酵母 菌、植物、哺乳动物细胞及小鼠身上。
• 现阶段条件型基因敲除以噬菌体的Cre/Loxp系统 和酿酒酵母的FLP/FRT系统应用最为广泛。
.
11
.
12
.
13
Cre/loxP系统作. 用原理示意图
14
FLP／FRT 系统
• 该系统与Cre／loxP系统相同，也是由一个重组酶 和一段特殊的DNA 序列组成。从进化的角度上考虑，Flp／FRT系统是Cre／loxP系统在 真核细胞内的同源系统。其中，重组酶Flp是酵母细胞内的一个由423 个氨基酸组成的单体蛋白。与Cre相似，Flp发挥作用也不需要任何辅 助因子，同时在不同的条件下具有良好的稳定性。该系统的另一个成 分Flp识别位点(Flp recognition target，FRT)与loxP位点非常相似， 同样由两个长度为13bp的反向重复序列和一个长度为8 bp的核心序 列构成。在该系统发挥作用时，FRT位点的方向决定了目的片段的缺 失还是倒转。这两个系统比较明显的区别是它们发挥作用的最佳温度 不同，Cre重组酶发挥作用的最佳温度为37℃，而Flp重组酶为30℃。 因此，Cre／loxP系统最适宜在动物体内使用。loxP和FRT位点的序 列如图所示
博士专题：基因功能研究技术之 ——基因敲除、基因编辑技术
.
1
II、基因敲除：可以使基因的功能完全缺失
• 基因敲除，又称基因打靶，是一种遗传工程技术，是在转染细 胞中发生外源打靶基因与核基因组目标基因之间的DNA同源重 组，能够使外源基因定点地整合到核基因组的特定位置上，从 而达到改变细胞遗传特性的目的。
条件性敲除的原理
条件性敲除的原理（图2，3）：利用Cre／LoxP 和来自酵母的FLP—frt 系统可以研究特定组织器官或特定细胞中靶基因灭活所导致的表型[7]。
通过常规基因打靶在基因组的靶位点上装上两个同向排列的1oxP，并以此两侧装接上loxP 的(“loxP floxed”)ES 细胞产生“loxPfloxed”小鼠,然后，通过将“lo xP floxed”小鼠与Cre 转基因鼠杂交(也可以其他方式向小鼠中引入Cre 重组酶)，产生靶基因发生特定方式(如特定的组织特异性)修饰的条件性突变小鼠。
在“loxP floxed”小鼠，虽然靶基因的两侧已各装上了一个loxP，但靶基因并没有发生其他的变化，故“1oxP noxed”小鼠表型仍同野生型的一样。
但当它与Cre 转基因小鼠杂交时，产生的子代中将同时带有“loxP floxed”靶基因和Cre 基因。
Cre 基因表达产生的Cre 重组酶就会介导靶基因两侧的1oxP 间发生切除反应，结果将一个loxP 和靶基因切除。
这样，靶基因的修饰(切除)是以Cre 的表达为前提的。
Cre 的表达特性决定了靶基因的修饰(切除)持性：即Cre 在哪一种组织细胞中表达，靶基因的修饰(切除)就发生在哪种组织细胞；而Cre 的表达水平将影响靶基因在此种组织细胞中进行修饰的效率。
所以只要控制Cre 的表达特异性和表达水平就可实现对小鼠中靶基因修饰的特异性和程度[9,10]。
在生理学研究中，为了明确某一组织或器官的功能，常将实验动物体内所要研究的组织或器官切除，进而根据实验动物的生理指标或功能的变化来推测切除部分的功能。
生命科学发展到今天，人们对于生命现象的认识已经逐步深入到了分子水平，而上述的“部分切除—观察整体—推测功能”的研究思想仍然有效。
具体地说，就是在分子水平破坏想要研究的基因，然后观察生物体的生理指标、功能、整体形态、组织结构、发育过程的变化等，进而推测相应基因的功能。
这种研究过程称为基因敲除(gene knock out)。
条件性敲除的原理
条件性敲除的原理（图2，3）：利用Cre／LoxP 和来自酵母的FLP—frt 系统可以研究特定组织器官或特定细胞中靶基因灭活所导致的表型[7]。
通过常规基因打靶在基因组的靶位点上装上两个同向排列的1oxP，并以此两侧装接上loxP 的(“loxP floxed”)ES 细胞产生“loxPfloxed”小鼠,然后，通过将“lo xP floxed”小鼠与Cre 转基因鼠杂交(也可以其他方式向小鼠中引入Cre 重组酶)，产生靶基因发生特定方式(如特定的组织特异性)修饰的条件性突变小鼠。
在“loxP floxed”小鼠，虽然靶基因的两侧已各装上了一个loxP，但靶基因并没有发生其他的变化，故“1oxP noxed”小鼠表型仍同野生型的一样。
但当它与Cre 转基因小鼠杂交时，产生的子代中将同时带有“loxP floxed”靶基因和Cre 基因。
Cre 基因表达产生的Cre 重组酶就会介导靶基因两侧的1oxP 间发生切除反应，结果将一个loxP 和靶基因切除。
这样，靶基因的修饰(切除)是以Cre 的表达为前提的。
Cre 的表达特性决定了靶基因的修饰(切除)持性：即Cre 在哪一种组织细胞中表达，靶基因的修饰(切除)就发生在哪种组织细胞；而Cre 的表达水平将影响靶基因在此种组织细胞中进行修饰的效率。
所以只要控制Cre 的表达特异性和表达水平就可实现对小鼠中靶基因修饰的特异性和程度[9,10]。
在生理学研究中，为了明确某一组织或器官的功能，常将实验动物体内所要研究的组织或器官切除，进而根据实验动物的生理指标或功能的变化来推测切除部分的功能。
生命科学发展到今天，人们对于生命现象的认识已经逐步深入到了分子水平，而上述的“部分切除—观察整体—推测功能”的研究思想仍然有效。
具体地说，就是在分子水平破坏想要研究的基因，然后观察生物体的生理指标、功能、整体形态、组织结构、发育过程的变化等，进而推测相应基因的功能。
这种研究过程称为基因敲除(gene knock out)。
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实现基因敲除的方法有多种，但基本上都是采用同 源重组或随机整合的方法，让一段没有生理功能的 DNA片段在细胞内取代正常基因，从而破坏正常基 因的功能。基因敲除主要是在胚胎干细胞 (embryonic stem cells，ESC)水平进行操作。胚胎干 细胞是早期胚胎细胞经体外培养建立的全能细胞系， 在体外培养时保持了未分化状态，可以传代增殖， 在发育上类似于早期胚胎细胞团的细胞，具有与早 期胚胎细胞相似的分化潜能和正常整倍体核型两大 特点，是研究哺乳动物个体发育、胚胎分化以及性 状遗传机制的理想模型。首先在这种细胞内进行分 子水平的基因操作，之后再使这种已经发生了基因 改变的细胞发育成为一个完整的生物体。这样就可 以在整个生物体内实现预期的基因改变。
体不同的组织、不同的生理条件下发挥作用； ④Cre重组酶的编码基因可以置于任何一种启动子的调控
之下，从而使这种重组酶在生物体不同的细胞、组织、器 官，以及不同的发育阶段或不同的生理条件下产生，进而 发挥作用，这一点也是该系统在应用过程中最为重要的一 点。
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3．Cre/loxP系统的工作流程
利用Cre/loxP系统实现体内某特定基因在特定条件 下的敲除，需要两只转基因小鼠。
条件性基因敲除与敲入
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在科学研究中，为了明确某一组织或器官的功能， 常将实验动物体内所要研究的组织或器官切除，进 而根据实验动物的生理指标或功能的变化来推测切 除部分的功能。生命科学发展到今天，人们对于生 命现象的认识已经逐步深入到了分子水平，而上述 的“部分切除—观察整体—推测功能”的研究思想 仍然有效。具体地说，就是在分子水平破坏想要研 究的基因，然后观察生物体的生理指标、功能、整 体形态、组织结构、发育过程的变化等，进而推测 相应基因的功能。这种研究过程称为基因敲除(gene knock out)。此外，为了研究某种疾病与某个基因之 间的关系，常向生物体内人为引入某个基因，然后 观察实验动物出现的各种变化，从而推测疾病与基 因的关系，这种研究方法称为基因敲人(gene knock in)。
第一只小鼠一般采用胚胎干细胞技术获得，首先在 体外构建一个在目的基因两端分别含有一个loxP位 点的基因序列，之后将体外构建好的这段基因序列 转入胚胎干细胞内，使其通过同源重组替代细胞基 因组内原来的基因序列。经过这样处理的胚胎干细 胞被重新植入到假孕小鼠的子宫内，使其重新发育 成为一个完整的胚胎，最终成为一只转基因小鼠。 在这只转基因小鼠中，loxP位点被引入到相应基因 的内含子内，理论上不会对相应基因的功能产生影 响，因此一般情况下，该小鼠的表型是正常的。
7
Байду номын сангаас
loxP（locus of X-over P1）序列：来源于P1噬菌 体，是由两个13bp反向重复序列和中间间隔的 8bp序列共同组成，8bp的间隔序列同时也确定 了loxP的方向。Cre在催化DNA链交换过程中与 DNA共价结合，13bp的反向重复序列是Cre酶的 结合域。其序列如下：
8
Cre重组酶介导两个loxP位点间的重组是一个动 态、可逆的过程，可以分成三种情况： 1、如果两个loxP位点位于一条DNA链上，且方 向相同，Cre重组酶能有效切除两个loxP位点间 的序列； 2、如果两个loxP位点位于一条DNA链上，但方 向相反，Cre重组酶能导致两个loxP位点间的序 列倒位； 3、如果两个loxP位点分别位于两条不同的DNA 链或染色体上，Cre酶能介导两条DNA链的交换 或染色体易位。
9
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2．Cre/loxP系统优点
Cre/loxP系统之所以在基因敲除中获得了非常广泛的应用， 是由该系统的诸多优点决定的：
①Cre重组酶与具有loxP位点的DNA片断形成复合物后， 可以提供足够的能量引发之后的DNA重组过程，因此该系 统不需要细胞或者生物体提供其他的辅助因子；
②loxP位点是一段较短的DNA序列，因此非常容易合成； ③Cre重组酶是一种比较稳定的蛋白质，因此可以在生物
5
一、条件性基因敲除的策略 ——Cre/loxP重组系统
6
1．Cre/loxP系统的原理
Cre重组酶：于1981年从P1噬菌体中发现， 属于λ Int酶超基因家族。Cre重组酶基因编 码区序列全长1029bp（EMBL数据库登录号 X03453），编码38kDa蛋白质。是一种位 点特异性重组酶，能介导两个loxP位点（序 列）之间的特异性重组，使loxP位点间的基 因序列被删除或重组。
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通过上述方法所获得的基因敲除小鼠模型，其身体的各种 组织、器官以及小鼠生存的各个时期都携带有突变基因， 相应基因的功能也发生了变化。这是一种非常经典的基因 敲除方法，该方法对阐明某些基因的功能做出了十分重要 的贡献。但是，对于某些特殊的基因，该方法往往显得无 能为力，这些基因在胚胎发育过程中或者在成熟生物体内 具有至关重要的功能。当这些基因突变后，胚胎往往不能 发育至正常分娩，或者即使能够出生也会因为过于严重的 生理缺陷而过早夭亡，无法开展后续研究，或者这些基因 突变后影响到实验动物的繁殖功能而不能产生后代，进而 不能获得携带突变基因的纯合子动物模型。针对上述问题， 近年来出现了一种特殊的基因敲除或敲入方法，被称为条 件性基因敲除或敲入(conditional gene knock out or knock in)。这种方法是指在特定的组织细胞或者细胞发育的特 定阶段敲除某一特定基因的实验技术。其优势在于克服了 经典基因敲除手段所遇到的上述问题，对于在特定的组织 细胞和(或)特定的时间研究特定基因的功能，以及更好地 建立人类疾病的动物模型都具有十分重要的意义。
3
经典的基因敲除的具体实施方法可以简述如下： 选择需要研究的目的基因的部分或全部DNA片 段，通过分子生物学方法使其产生突变，然后 与相应的载体进行重组，成为靶载体。分离试 验动物的胚胎干细胞，在体外将上述靶载体导 入到胚胎干细胞内，使其与细胞内相似或相同 的序列进行同源重组，替代细胞内原来的基因。 通过一定的筛选方法筛选出发生同源重组的细 胞，再将其注入囊胚腔内；把经过上述处理的 囊胚重新植入到假孕小鼠的子宫内，使其发育 成为一个完整的个体。含有相应突变基因的嵌 合体雄性小鼠与正常雌性小鼠进行交配后，通 过筛选可获得携带该突变基因的纯合子小鼠。
实现基因敲除的方法有多种，但基本上都是采用同 源重组或随机整合的方法，让一段没有生理功能的 DNA片段在细胞内取代正常基因，从而破坏正常基 因的功能。基因敲除主要是在胚胎干细胞 (embryonic stem cells，ESC)水平进行操作。胚胎干 细胞是早期胚胎细胞经体外培养建立的全能细胞系， 在体外培养时保持了未分化状态，可以传代增殖， 在发育上类似于早期胚胎细胞团的细胞，具有与早 期胚胎细胞相似的分化潜能和正常整倍体核型两大 特点，是研究哺乳动物个体发育、胚胎分化以及性 状遗传机制的理想模型。首先在这种细胞内进行分 子水平的基因操作，之后再使这种已经发生了基因 改变的细胞发育成为一个完整的生物体。这样就可 以在整个生物体内实现预期的基因改变。
体不同的组织、不同的生理条件下发挥作用； ④Cre重组酶的编码基因可以置于任何一种启动子的调控
之下，从而使这种重组酶在生物体不同的细胞、组织、器 官，以及不同的发育阶段或不同的生理条件下产生，进而 发挥作用，这一点也是该系统在应用过程中最为重要的一 点。
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3．Cre/loxP系统的工作流程
利用Cre/loxP系统实现体内某特定基因在特定条件 下的敲除，需要两只转基因小鼠。
条件性基因敲除与敲入
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在科学研究中，为了明确某一组织或器官的功能， 常将实验动物体内所要研究的组织或器官切除，进 而根据实验动物的生理指标或功能的变化来推测切 除部分的功能。生命科学发展到今天，人们对于生 命现象的认识已经逐步深入到了分子水平，而上述 的“部分切除—观察整体—推测功能”的研究思想 仍然有效。具体地说，就是在分子水平破坏想要研 究的基因，然后观察生物体的生理指标、功能、整 体形态、组织结构、发育过程的变化等，进而推测 相应基因的功能。这种研究过程称为基因敲除(gene knock out)。此外，为了研究某种疾病与某个基因之 间的关系，常向生物体内人为引入某个基因，然后 观察实验动物出现的各种变化，从而推测疾病与基 因的关系，这种研究方法称为基因敲人(gene knock in)。
第一只小鼠一般采用胚胎干细胞技术获得，首先在 体外构建一个在目的基因两端分别含有一个loxP位 点的基因序列，之后将体外构建好的这段基因序列 转入胚胎干细胞内，使其通过同源重组替代细胞基 因组内原来的基因序列。经过这样处理的胚胎干细 胞被重新植入到假孕小鼠的子宫内，使其重新发育 成为一个完整的胚胎，最终成为一只转基因小鼠。 在这只转基因小鼠中，loxP位点被引入到相应基因 的内含子内，理论上不会对相应基因的功能产生影 响，因此一般情况下，该小鼠的表型是正常的。
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Байду номын сангаас
loxP（locus of X-over P1）序列：来源于P1噬菌 体，是由两个13bp反向重复序列和中间间隔的 8bp序列共同组成，8bp的间隔序列同时也确定 了loxP的方向。Cre在催化DNA链交换过程中与 DNA共价结合，13bp的反向重复序列是Cre酶的 结合域。其序列如下：
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Cre重组酶介导两个loxP位点间的重组是一个动 态、可逆的过程，可以分成三种情况： 1、如果两个loxP位点位于一条DNA链上，且方 向相同，Cre重组酶能有效切除两个loxP位点间 的序列； 2、如果两个loxP位点位于一条DNA链上，但方 向相反，Cre重组酶能导致两个loxP位点间的序 列倒位； 3、如果两个loxP位点分别位于两条不同的DNA 链或染色体上，Cre酶能介导两条DNA链的交换 或染色体易位。
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2．Cre/loxP系统优点
Cre/loxP系统之所以在基因敲除中获得了非常广泛的应用， 是由该系统的诸多优点决定的：
①Cre重组酶与具有loxP位点的DNA片断形成复合物后， 可以提供足够的能量引发之后的DNA重组过程，因此该系 统不需要细胞或者生物体提供其他的辅助因子；
②loxP位点是一段较短的DNA序列，因此非常容易合成； ③Cre重组酶是一种比较稳定的蛋白质，因此可以在生物
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一、条件性基因敲除的策略 ——Cre/loxP重组系统
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1．Cre/loxP系统的原理
Cre重组酶：于1981年从P1噬菌体中发现， 属于λ Int酶超基因家族。Cre重组酶基因编 码区序列全长1029bp（EMBL数据库登录号 X03453），编码38kDa蛋白质。是一种位 点特异性重组酶，能介导两个loxP位点（序 列）之间的特异性重组，使loxP位点间的基 因序列被删除或重组。
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通过上述方法所获得的基因敲除小鼠模型，其身体的各种 组织、器官以及小鼠生存的各个时期都携带有突变基因， 相应基因的功能也发生了变化。这是一种非常经典的基因 敲除方法，该方法对阐明某些基因的功能做出了十分重要 的贡献。但是，对于某些特殊的基因，该方法往往显得无 能为力，这些基因在胚胎发育过程中或者在成熟生物体内 具有至关重要的功能。当这些基因突变后，胚胎往往不能 发育至正常分娩，或者即使能够出生也会因为过于严重的 生理缺陷而过早夭亡，无法开展后续研究，或者这些基因 突变后影响到实验动物的繁殖功能而不能产生后代，进而 不能获得携带突变基因的纯合子动物模型。针对上述问题， 近年来出现了一种特殊的基因敲除或敲入方法，被称为条 件性基因敲除或敲入(conditional gene knock out or knock in)。这种方法是指在特定的组织细胞或者细胞发育的特 定阶段敲除某一特定基因的实验技术。其优势在于克服了 经典基因敲除手段所遇到的上述问题，对于在特定的组织 细胞和(或)特定的时间研究特定基因的功能，以及更好地 建立人类疾病的动物模型都具有十分重要的意义。
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经典的基因敲除的具体实施方法可以简述如下： 选择需要研究的目的基因的部分或全部DNA片 段，通过分子生物学方法使其产生突变，然后 与相应的载体进行重组，成为靶载体。分离试 验动物的胚胎干细胞，在体外将上述靶载体导 入到胚胎干细胞内，使其与细胞内相似或相同 的序列进行同源重组，替代细胞内原来的基因。 通过一定的筛选方法筛选出发生同源重组的细 胞，再将其注入囊胚腔内；把经过上述处理的 囊胚重新植入到假孕小鼠的子宫内，使其发育 成为一个完整的个体。含有相应突变基因的嵌 合体雄性小鼠与正常雌性小鼠进行交配后，通 过筛选可获得携带该突变基因的纯合子小鼠。