水产品中己烯雌酚快速检测方法试验分析
HPLC法测定己烯雌酚乳膏中己烯雌酚的含量
HPLC法测定己烯雌酚乳膏中己烯雌酚的含量张建国;何婧【摘要】Objective To determine the content of diethylstilbestrol in diethylstilbestrol cream by HPLC. Methods The HPLC was used with a Hypersil ODS C18( 150 mm × 2. 5 mm,5 μm )column,the mobile phase was methyl alcohol-water( 70: 30 ),the detective wavelength was 254 nm with the flow rate of 0. 5 mL/min,the column temperature was 25 ℃ ,the injection volume was 20 μL. Results The linear range of diethylstilbestrol was 0. 013 -0. 114 mg/mL( r =0. 999 7,n =5 )and the average recovery rate was 99. 8% ,RSD =0. 25% . Conclusion The method is simple with good sensitivity and good reproducibility. It can be used for the determination of diethylstilbestrol in diethylstilbestrol cream.%目的应用高效液相色谱法测定己烯雌酚乳膏中己烯雌酚的含量.方法采用高效液相色谱法,色谱柱为Hypersil O DS C18(150 mm×2.5 mm,5 μm);流动相:甲醇-水(70:30);流速:0.5 mL/min;检测波长:254 nm;柱温:25 ℃;进样量:20 μL.结果己烯雌酚的线性范围为0.013～0.114 mg/mL;r=0.999 7(n=5),平均加样回收率为99.8%,RSD=0.25%.结论该法操作简便,灵敏度高,重复性好,可用于己烯雌酚乳膏中己烯雌酚的含量测定.【期刊名称】《实用药物与临床》【年(卷),期】2012(015)010【总页数】2页(P655-656)【关键词】HPLC;己烯雌酚;己烯雌酚乳膏;含量测定【作者】张建国;何婧【作者单位】湖北医药学院附属东风医院,湖北,十堰,442008;湖北医药学院附属东风医院,湖北,十堰,442008【正文语种】中文己烯雌酚是人工合成的非甾体雌激素物质，为无色结晶或白色结晶性粉末［1］，可用于绝经期综合征、卵巢功能不全引起的各种疾病、前列腺癌及老年性阴道炎等，也可用于前列腺癌［2］。
一种简单快速的己烯雌酚定性检测方法研究
一种简单快速的己烯雌酚定性检测方法研究作者：罗板鑫陈昌云来源：《中国教育技术装备》2012年第06期摘要己烯雌酚是一类严重危害人体健康的兽药，简单快速的检测方法研究具有重要意义。
从浓度、温度、酸碱性等方面研究己烯雌酚使高锰酸钾褪色的最佳反应条件。
结果表明：己烯雌酚使高锰酸钾褪色的最佳条件是中性条件下，温度在40 ℃以上，己烯雌酚的最低检测限为0.1 ppm。
这是一种适合于快速筛选的定性检测方法。
关键词己烯雌酚；快速检测；褪色反应中图分类号：G642.423 文献标识码：B 文章编号：1671-489X(2012)06-0126-03Simple and Rapid Qualitative Detection Method for Diethylstilbestrol//Luo Banxin1, Chen Changyun2Abstract To study the optimum reaction conditions of diethylstilbestrol qualitative color reaction. Because diethylstilbestrol molecule contains double-bond and it can react with potassium permanganate, we discuss the optimum reaction conditions of diethylstilbestrol with potassium permanganate’s color reaction from concentration, temperature, acid and alkaline three aspects. The optimal condition of diethylstilbestrol with potassium permanganate’s color reaction is neutral condition, temperature above 40 ℃, and the lowest detectable limit of diethylstilbestrol is 0.1 ppm.Key words diethylstilbestrol; rapid detection; color-fading reactionAuthor’s address1 No.13 High Middle School of Nanjing, Nanjing, China 2100082 School of Biochemical & Environmental Engineering, Nanjing Xiaozhuang University, Nanjing, China211171食品安全是一个国家涉及国民健康、社会稳定、经济利益和国际贸易、国家形象甚至国际外交的重大战略问题。
水产品中己烯雌酚快速检测方法试验分析
水产品中己烯雌酚快速检测方法试验分析摘要对一种快速检测水产品中己烯雌酚残留量ELISA方法进行试验分析,结果表明:在0.15~9.00ng/mL浓度范围内,回归方程y=-13.141Ln(x)+43.52,相关系数R2=0.994 8;相对平均偏差为3.0%~11.6%;回收率为73%~96%;样品检测下限为0.075ng/g;定量下限为0.25ng/g;操作过程简单,检测成本低,检测时间短,因而该方法适用于大批量水产品中己烯雌酚残留量快速检测。
关键词水产品;己烯雌酚;ELISA;快速检测己烯雌酚(Diethylstilbestrol,DES)是一种人工合成的雌性激素,应用于水产养殖中能够促进蛋白质同化,提高饲料转化率,同时促进鱼虾类生长。
但因其在水产动物中代谢较慢且作用顽强,极小的残留都会对人体生理功能产生影响,主要危害是扰乱人体激素平衡,并具有致癌性,现已被禁止应用于水产养殖中,规定水产品中不得检出己烯雌酚[1]。
为此,从2002年开始我国要求水产品中己烯雌酚残留量的检出限为0.6 μg/kg,欧盟要求以2μg/kg为阳性下限。
目前,己烯雌酚常用的检测方法有高效液相色谱法(HPLC)和酶联免疫法(ELISA),但是HPLC法[2]在检出限上不能满足要求;ELISA法[3]是目前水产品中DES残留检测的标准方法,但也存在样品处理过程复杂、检测时间长、成本高等不足。
为了寻求一种经济、简便、灵敏、特异性强的测定方法,笔者对一种快速检测水产品中己烯雌酚残留量的ELISA方法进行试验分析,现将结果报告如下。
1材料与方法1.1仪器与试剂Lab system MK3型酶标仪、METTLER PB602-N电子天平、N- EV AP氮吹仪、LRH-150S恒温培养箱、移液器(10μL、20μL、100μL和1mL各1支)、多道移液器(50~300μL)。
美国Bioo MaxSignalTM己烯雌酚ELISA试剂盒、乙酸乙酯、正己烷、无水CaCl2。
一种新的酶联免疫法检测水产品中的己烯雌酚
２５
我们 在 比较 德国 、意大利 、荷 兰 、英 国 、美 国等
生产 的多个 己烯雌酚酶联 免疫检 测试剂盒 的基础 上 ， 选择 一种新 的试 剂盒 应用 于水 产品 中 己烯雌 酚 的检 测 ，经过对罗非 鱼和对 虾的加标 回收试验 ，发现新的
转蒸 发 、Ｃ ，固相萃取 等 多个 步骤 ，且酶 联免疫 反应
步骤需要 过夜孵育 ，耗时长 、对 技术人 员 的要求 高 ， 检测精密度较难 把握 ，是检测 人员普遍 反映难度较大 的一个药残检测项 目。因此 ，采用新 的快速 、准确 的 检验方法显得尤 其迫切和必要 。
试剂盒从 冰箱拿 出来 回温 ３ ｍｎ以上。根据样品 ０ｉ 数量确定所需的微孔板数 ，设计好标 准品和样品的排 布 。分别 加入 ５ Ｌ 准 品和样品 于所 设定 的孔 中； Ｏ 标
１２ 检 测步 骤 ＿
１２１ 样 品前 处 理 ．．
度 ，液相 色谱法检测 限无法满 足需要 ，而液 相色谱 串
联质谱法 因为仪器价格 昂贵无法推广普及 ，因此 利用 抗 原抗 体反 应 的高特 异性 而设 计 的高 灵 敏度检 测 方 法 一酶联 免疫法 ，在食品 中己烯雌酚 的检测 中 泛使 用 ，其 中水产行业标准 产品 中己烯雌酚残 留量 的 测 定 一酶联 免疫 法》 （Ｃ ＂ ０ ０ ２ ０ ） 是 目前 我 国 Ｓｆ ３２—０４ ｌ
甲醇 （ ：２ ）混合 物 ；漩 涡振 荡 ２ ｉ，４ ０ ｇ ３ ，Ｖ ｍ ｎ ０ ０
离 心 １ｍｎ ０ ｉ。离心后得 到的下清液 即为待 测 的样品提
取液 。
１ ． Ｅ ＩＡ检 测 步骤 ， ２ ＬＳ ２
高效液相色谱法测定水产品中己烯雌酚的残留量
高效液相色谱法测定水产品中己烯雌酚的残留量
吴红军;成强;臧素娟;陈红燕
【期刊名称】《安徽农业科学》
【年(卷),期】2014(000)014
【摘要】[目的]建立用高效液相色谱法测定水产品中己烯雌酚的分析方法.[方法]样品经甲醇提取,以保留时间定性,外标法定量.[结果]己烯雌酚峰面积与其质量分数有着良好的线性关系(r =0.999),最低检测限为0.05 mg/kg,加标回收率为89.0％～98.5％,RSD为1.1％～4.1％.[结论]该试验建立的方法能快速、准确地检测出水产品中的己烯雌酚残留量,适用于水产品质量检测工作.
【总页数】2页(P4447-4448)
【作者】吴红军;成强;臧素娟;陈红燕
【作者单位】扬州市农产品质量监督检测中心,江苏扬州225101;扬州市农产品质量监督检测中心,江苏扬州225101;扬州市农产品质量监督检测中心,江苏扬州225101;扬州市农产品质量监督检测中心,江苏扬州225101
【正文语种】中文
【中图分类】S917
【相关文献】
1.鳗鱼肉中己烯雌酚残留量的高效液相色谱法测定 [J], 林红英;蒋天梅;沈子龙
2.酶联免疫法测定水产品中己烯雌酚残留量 [J], 张瑞凌;许亦真;刘建萍;李福伟;张冲
3.分散固相萃取-高效液相色谱串联质谱法测定水产品中氯霉素类药物的残留量 [J], 张桂云;杨伟强
4.超高效液相色谱法测定水产品中喹乙醇的残留量 [J], 黄鸾玉;杨姝丽;韦信贤;童
桂香;吴祥庆;黄玉柳;蒙源
5.超高效液相色谱-串联质谱法测定水产品中瑞他莫林的残留量 [J], 马剑锋; 张小军; 陈雪昌; 严忠雍; 宗婧婧; 曾军杰
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水产品中氯霉素和己烯雌酚快速检测方法初探
水产品中氯霉素和己烯雌酚快速检测方法初探作者：易鸣朱志强曾智来源：《渔业致富指南》 2017年第13期在标准《NY 5070-2002 无公害食品水产品中渔药残留限量》中氯霉素和己烯雌酚因其对人体的危害已被列为不得检出的药物残留项目。
检测氯霉素和己烯雌酚的方法主要有酶联免疫法、气相法、液质联用法，其中酶联免疫法耗时最短且操作最简单，也是笔者检测工作的主要项目之一。
结合笔者的实际工作，本文详述了酶联免疫法测定水产品中氯霉素和己烯雌酚含量的原理、方法和注意事项。
一、材料和方法１. 氯霉素和己烯雌酚氯霉素属抑菌性广谱抗生素，能对多种细菌微生物产生作用，常用于对水生动物各种传染病的治疗，曾在水产养殖业中得到广泛应用，同时也带来了水产品中氯霉素残留的严重问题。
因其会引起人类的再生障碍性贫血、新生儿灰婴综合症等严重毒副作用，作为渔药已禁用。
己烯雌酚为人工合成的非甾体雌激素，对水生动物有提高繁育率等作用。
但人食用了残留有己烯雌酚的水产品后会造成体内激素失调，对人体健康产生危害，作为渔药也已禁用。
因此对水产品中氯霉素和己烯雌酚的检测对于食品安全有重要意义。
2. 酶联免疫法1971年瑞典学者Engvail和Perlmann，荷兰学者Van Weerman和Schuurs分别报道将免疫技术发展为检测体液中微量物质的固相免疫测定方法，即酶联免疫吸附测定法（Enzyme-Linked ImmunoSorbentAssay，ELISA）。
它的中心原理就是让抗体与酶复合物结合，然后通过显色来检测。
具体步骤是使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，然后与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。
在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。
用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。
荧光光度法测定己烯雌酚
荧光光度法测定己烯雌酚杜凌云;朱琳;王术皓【摘要】In 0.4 mmol · L-1 B-R buffer medium of pH 4.1,butyl-rhodamine B (BRMB) was rapidly oxidized by hydroxyl free radical produced by the reaction between Fe(Ⅱ) and H2O2,leading to significant decrease of fluorescence intensity of BRMB.When diethylstilbestrol (DES) was present in the above reaction system,due to the elimination action of DES toward OH free radical,the magnitude of decrease of fluorescence intensity was decreased,and values of fluorescence difference (△F =F-F0) were found to keep linear relationship with mass concentration of DES in the range of 0.1-50 μg · L-1.Based on these facts,a method of fluorophotometric determination of DES was proposed.Optimum conditions for this reaction were found as follows:① mass concn.of BRMB:2.0 mg · L-1 ; ② concn.of FeSO4:0.05 mmol · L-1 ; ③ concn.of H2O2:(ψ) 0.000 3％and ④ time of reaction:6 min.Detection limit (3s/k) of the method was found to be 0.045 μg · L-1.Test for recovery was made by standard addition method,giving results in the range of 91.0 ％-106 ％,with values of RSD's (n=5) less than%在0.4 mmol·L-1 B-R缓冲介质(pH 4.1)中,丁基罗丹明B(BRMB)被Fe(Ⅱ)与H2O2反应所产生的羟自由基迅速氧化而导致其产生的荧光强度明显减弱.当有己烯雌酚(DES)存在时,由于其对羟自由基有清除作用,而使上述反应体系的荧光减弱程度降低,即对BRMB-Fe(Ⅱ)-H2O2反应体系有抑制作用,而且反应体系的△F值(F-F0)与DES的质量浓度在0.1～50 μg·L-1范围内呈线性关系.据此提出了测定DES 的荧光光度法.反应体系的最佳条件如下:①BRMB的质量浓度:2.0 mg·L-1;②硫酸亚铁的浓度:0.05 mmol·L-1;③过氧化氢浓度:(ψ)0.000 3％及④反应时间:6 min.方法的检出限(3s/k)为0.045 μg·L-1.以水样作基体,做加标回收试验,测得回收率在91.0％～106％之间,测定值的相对标准偏差(n=5)均小于5％.【期刊名称】《理化检验-化学分册》【年(卷),期】2013(049)008【总页数】3页(P985-987)【关键词】荧光光度法;己烯雌酚;丁基罗丹明B;羟自由基【作者】杜凌云;朱琳;王术皓【作者单位】聊城大学化学化工学院,聊城252059;青岛第十五中学,青岛266023;聊城大学化学化工学院,聊城252059【正文语种】中文【中图分类】O657.32己烯雌酚（DES）是一种人工合成的雌激素，化学名为1，2－双（4－羟苯基）－1，2－二乙基乙烯，俗名为乙底酚，为无色结晶或白色结晶性粉末。
固相萃取-高效液相色谱法测定水产品中的乙烯雌酚残留量
冷 撩
本 次 试 验 使 用 的试 剂 有 ： （ １）
好 地 促 进 各 类 水 生 动 物 生 长 发 育 ， 但 烷 ／ 磷 酸氢 二程海燕 钠／ 氯化 钠： （ ３）色 谱 口 胡燕杰 周诗瑾 宁海县食品检测中心 最大 的问题就是 该物质存 有致癌风 险。 纯 ，乙腈 ／ 甲醇 ／ 乙酸 乙 酯 。 最 后 是 此 中称 取 ５ ． Ｏ ｇ ，并将 称 取 的鳗 鱼 肉置 人 们 在 市 场 购 买 的水 产 生 鲜 ， 如鱼 、 次 使 的 乙 烯 雌 酚 标 准 溶 液 ， 称 取 乙 于 ５ ０ ｍ Ｌ的 离 心 管 中 ， 之 后 加 甲 醵 ２ ０
步 操 作 完 成 之 后 ，再 次 将 肉 浆 蕾 入 振 添 加 存 鱼 饲 料 中 ， 使 得 不 能 被 完 全 最 终 得 到 了 此 次 试 验 使 用 的 乙 烯 雌 酚 荡 器 中 振 荡 ５ ｍ ｉ ｎ ，４ ０ ０ ０ ｒ ／ ａ ｒ ｉ ｎ离 心 消化 吸 收 ，存在 于水生 动物 的肝 脏 、 标准 储 备液 （ 浓度 为 １ ∞ ｇ ／ ｍ Ｌ） 。 １ ０ ｍ ｉ ｎ ，最 终通过 吸液 管将 ｒ 清液 转 ｇ ／ ｍ Ｌ 。 肌 肉 中 ，严 重 危 害 人 们 的 身 体 健 康 其 中 ，标 准 中 间 液 浓 度 为 ２
该 化 学 物 质 与 水 不 相 溶 ，但 是 与 有 机 ／ 步琦 Ｒ ２ １ Ｏ（ 瑞士 ） 。
雌 酚这 一雌 激 素类 物质 ，被越 来越 多 纯 度达 到 ９ ９ ％的 乙 烯 雌 酚 标 准 样 品 应 用 于 水 产 养 殖 中。 乙 烯 雌 酚 可 以 更
（ Ｓ ｉ ｇ ｍ ａ公 司 ）： （ ２） 分 析 纯 ， 正 己
就 是此 次所 要测 定 的试样 品 ，做 高效
一种简单快速的己烯雌酚定性检测方法研究
食 品 安全 是 一 个 国 家涉 及 国 民健 康 、 社会 稳 定 、经 济 利益 和 国际 贸易 、国家形 象甚 至 国际外 交的重 大 战略 问
题 。我 国 的食 品安全 问题十 分严 重 ，频频 出现 的食 品安全 事件不 仅成 了老 百姓 日常 生活 中挥之 不去 的阴影 ，严 重危
基层 检 验 检 疫 工 作 ；操 作 复 杂 、检 测 时 间长 ，不 利 于 大
批量 样 品 的快 速测 定 ；等 等 。因此 ，现场 快 速 的初 筛
害人们 的 身体健 康和 社会稳 定 ， 同时也极 大地损 害 了我 国
农产 品的 国际声誉 和 贸易 ，经济损 失难 以估 量 。 己烯 雌 酚 （ ｉ ｔ ｙ ｓ ｉ ｂ ｓ ｒ ｌ Ｅ ）是 二苯 乙烯 ｄ ｅ ｈ ｌ ｔ Ｉ ｅ ｔ ｏ ，Ｄ Ｓ
（ ×１ ｍ ｌ Ｌ ． ５ ｍ ，然 后 分别 加入０ １ ／ 、０ ０ １ ０ ｏ ／ ）Ｏ ２ １ ． ｇ Ｌ ． １ ｇ Ｌ １ ｇ Ｌ ． ｍ ／ 的 己烯雌 酚和 蒸 馏 水０ ７ ｌ （ ／ 、 ｍ ／ 、０ １ ｇ Ｌ ． ５ｍ 空
— 中ｃ
幕
实验教 学
罗 鑫 陈 云 一 简 快 的烯 酚 性 测 法 究 板 昌 ： 种 单 速 己 雌 定 检 方 研
表 １ 不同 浓度 的 己烯雌 酚在 中性环 境下 不 同温度 时 的褪色 反应 时 间
１７ ２
表２ 不 同浓 度 的己烯 雌酚 在酸 碱 环境 下 的褪色 反应
入 ０ １ｇ Ｌ ． １ｇ Ｌ ｇ Ｌ ． ｇ Ｌ 己烯雌 酚和 蒸 ． ／ 、Ｏ Ｏ ／ 、１ｍ ／ 、０ １ｍ ／ 的
｝ 金 项 目 ： 江 苏 省 教 育 厅 高 新 技 术 产 业 化 项 目 （ Ｈ Ｄ ９ １ ） ； 南 京 大 学 生 命 分 析 化 学 教 育 部 重 点 实 验 室 开 放 课 题 基 Ｊ Ｚ ０ ８
酶联免疫法测定水产品中己烯雌酚残留量
山东科学ＳＨＡＮＤＯＮＧＳＣＩＥＮＣＥ第３２卷第３期２０１９年６月出版Ｖｏｌ.３２Ｎｏ.３Ｊｕｎ.２０１９ＤＯＩ:１０.３９７６/ｊ.ｉｓｓｎ.１００２￣４０２６.２０１９.０３.０１２ʌ环境与生态ɔ收稿日期:２０１８￣０６￣０８作者简介:张瑞凌(１９８３ )ꎬ女ꎬ实验师ꎬ研究方向为食品检测和环境检测ꎮＥ￣ｍａｉｌ:ｚｈａｎｇｒｌ＠ｓｄａｔｃ.ｃｏｍ.ｃｎ酶联免疫法测定水产品中己烯雌酚残留量张瑞凌１ꎬ许亦真１ꎬ刘建萍２ꎬ李福伟１ꎬ张冲１(１.齐鲁工业大学(山东省科学院)ꎬ山东省分析测试中心ꎬ山东济南２５００１４ꎻ２.山东蓝城分析测试有限公司ꎬ山东济南２５００１４)摘要:采用酶联免疫法测定水产品中残留己烯雌酚的含量ꎬ并采用液相色谱￣质谱联用法验证阳性结果ꎮ实验结果表明ꎬ该方法对水产品中己烯雌酚的检出限为０.３５μｇ/ｋｇꎬ回收率达７７％~９１％ꎬ具有良好的灵敏度和准确度ꎮ关键词:酶联免疫ꎻ己烯雌酚ꎻ水产品中图分类号:Ｏ６５７.６３㊀㊀㊀文献标识码:Ａ㊀㊀㊀文章编号:１００２￣４０２６(２０１９)０３￣００８０￣０５开放科学(资源服务)标识码(ＯＳＩＤ):ＤｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｄｉｅｔｈｙｌｓｔｉｌｌｂｅｓｔｒｏｌｒｅｓｉｄｕｅｓｉｎａｑｕａｔｉｃｐｒｏｄｕｃｔｓｂｙｅｎｚｙｍｅｌｉｎｋｅｄｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔａｓｓａｙＺＨＡＮＧＲｕｉ￣ｌｉｎｇ１ꎬＸＵＹｉ￣ｚｈｅｎ１ꎬＬＩＵＪｉａｎ￣ｐｉｎｇ２ꎬＬＩＦｕ￣ｗｅｉ１ꎬＺＨＡＮＧＣｈｏｎｇ１(１.ＳｈａｎｄｏｎｇＡｎａｌｙｓｉｓａｎｄＴｅｓｔＣｅｎｔｅｒꎬＱｉｌｕＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ(ＳｈａｎｄｏｎｇＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓ)ꎬＪｉｎａｎ２５００１４ꎬＣｈｉｎａꎻ２.ＳｈａｎｄｏｎｇＢｌｕｅｔｏｗｎＡｎａｌｙｓｉｓａｎｄＴｅａｔＣｏ.ꎬＬＴＤꎬＪｉｎａｎ２５００１４ꎬＣｈｉｎａ)ＡｂｓｔｒａｃｔʒＴｈｅｃｏｎｔｅｎｔｏｆｄｉｅｔｈｙｌｓｔｉｌｂｅｓｔｒｏｌ(ＤＥＳ)ｒｅｓｉｄｕｅｓｉｎａｑｕａｔｉｃｐｒｏｄｕｃｔｓｗａｓｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄｂｙｅｎｚｙｍｅｌｉｎｋｅｄｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔａｓｓａｙ(ＥＬＩＳＡ)ꎬａｎｄｔｈｅｐｏｓｉｔｉｖｅｒｅｓｕｌｔｓｗｅｒｅｖｅｒｉｆｉｅｄｂｙｌｉｑｕｉｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ￣ｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ(ＬＣ￣ＭＳ).ＴｈｅｆｉｎａｌｔｅｓｔｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｔｈａｔｔｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｌｉｍｉｔｏｆＤＥＳｉｎａｑｕａｔｉｃｐｒｏｄｕｃｔｓｉｓ０.３５μｇ/ｋｇａｎｄｔｈｅｒｅｃｏｖｅｒｙｒａｔｅｉｓ７７％~９１％.Ｔｈｉｓｍｅｔｈｏｄｈａｓｇｏｏｄｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙａｎｄａｃｃｕｒａｃｙ.ＫｅｙｗｏｒｄｓʒＥｎｚｙｍｅｌｉｎｋｅｄｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔａｓｓａｙ(ＥＬＩＳＡ)ꎻｄｉｅｔｈｙｌｓｔｉｌｂｅｓｔｒｏｌ(ＤＥＳ)ꎻａｑｕａｔｉｃｐｒｏｄｕｃｔｓ㊀㊀己烯雌酚(ｄｉｅｔｈｙｌｓｔｉｌｂｅｓｔｒｏｌꎬＤＥＳ)是一种非甾体雌激素ꎬ能产生与天然雌激素相同的药理与治疗作用ꎬ于１９３８年由Ｄｏｄｄｓ等[１]合成ꎮ己烯雌酚广泛用于妇科病的治疗ꎬ也作为动物促生长剂应用于畜禽生产中ꎬ同时在水产养殖等方面也有使用ꎮ多年研究证明ꎬ己烯雌酚对生物体具有致畸[２]㊁致癌[３]等危害ꎮ欧美等国从２０世纪７０年代开始先后颁布禁令ꎬ限制己烯雌酚的使用ꎮ１９７９年ꎬ世界各国开始严格控制己烯雌酚作为治疗药物使用[４]ꎮ２００２年ꎬ«禁止在饲料和动物饮用水中使用药物品种目录»(农业部公告第１７６号)中１８第３期张瑞凌ꎬ等:酶联免疫法测定水产品中己烯雌酚残留量禁止在饲料和动物饮用水中使用己烯雌酚及其盐㊁酯和制剂[５]ꎬ«食品动物禁用的兽药及其它化合物清单»(农业部公告第１９３号)将其列为食品动物禁用兽药[６]ꎮ在经济利益驱使下ꎬ国内仍有将己烯雌酚用于水产养殖的现象ꎮ因此ꎬ选取一种快速㊁准确㊁灵敏的检测方法检测己烯雌酚残留量ꎬ对于水产品的食品安全有重要意义ꎮ目前用于己烯雌酚检测的方法主要有高效液相色谱法[７]㊁液相色谱￣质谱联用法(ＬＣ￣ＭＳ/ＭＳ)[８]㊁气相色谱￣质谱联用法[９]㊁放射免疫法[１０]等ꎮＬＣ￣ＭＳ/ＭＳ法分析结果准确ꎬ但前处理较为繁琐ꎬ所需仪器设备使用和维护费用昂贵ꎬ且需专业人员操作ꎬ检测成本高ꎮ酶联免疫法是我国水产行业中己烯雌酚检测的标准方法ꎬ具有灵敏度高㊁操作安全㊁检测速度快㊁仪器成本低等优点ꎮ酶联免疫法会出现假阳性结果ꎬ对操作人员的技术水平有一定要求ꎬ检出限也相对较高ꎮ本实验使用酶联免疫法对大量实际样品进行检测ꎬ选取ＬＣ￣ＭＳ/ＭＳ法验证阳性样品中己烯雌酚的含量ꎬ以提高样品结果的准确性ꎮ１㊀实验材料和仪器１.１㊀仪器多功能酶标仪及操作软件(美国ＢｉｏＴｅｋ公司)ꎻ氮吹仪(北京普立泰科仪器有限公司)ꎻ高速冷冻离心机(美国ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ公司)ꎻ旋转蒸发仪(日本东京理化公司)ꎻ高速分散均质机(上海标本模型厂)ꎻＡｇｉｌｅｎｔ１２００ＲＲＬＣ￣６４１０型三重四级杆串联质谱仪(美国Ａｇｉｌｅｎｔ公司)ꎻＡｇｉｌｅｎｔ１２００液相色谱仪(美国Ａｇｉｌｅｎｔ公司)ꎻＥｃｌｉｐｓｅＸＤＢ￣Ｃ１８色谱柱ꎬ２.１ｍｍˑ１５０ｍｍꎬ５μｍ(美国Ａｇｉｌｅｎｔ公司)ꎮ１.２㊀试剂己烯雌酚ＥＬＩＳＡ试剂盒(江苏美正生物科技有限公司)ꎻ氯化钠(上海国药有限公司)ꎻ乙腈(美国ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ)ꎻ乙醇(上海国药有限公司)ꎮ组织样品为市售鱼类ꎬ均来源于山东省内多地市超市及农贸市场ꎮ１.３㊀仪器工作参数质谱使用离子源:ＥＳＩꎬ第一级四极杆温度:１００ħꎬ第二级四极杆温度:１００ħꎬ雾化压力:２０６.８４４ｋＰａꎬ干燥气温度:３５０ħꎬ干燥气流量:１２Ｌ/ｍｉｎꎬ离子极性:负ꎬ质量扫描模式:ＭＲＭ模式ꎬ母离子质荷比为２６７ꎬ子离子质荷比分别为２５１和３７１ꎬ碎裂电压均为１４０Ｖꎬ碰撞能量分别为２３Ｖ和２６Ｖꎮ液相色谱条件:以水(Ａ相)和乙腈(Ｂ相)为流动相进行线性梯度洗脱ꎬ流速为３００ｍＬ/ｍｉｎꎬ柱温３０ħꎬ进样体积１０μＬꎮ梯度洗脱条件:０~５ｍｉｎꎬ２０％~５０％Ｂꎻ５~７ｍｉｎꎬ５０％~９５％Ｂꎻ７~８ｍｉｎꎬ９５％~９５％Ｂꎻ８~８.０１ｍｉｎꎬ９５％~２０％Ｂꎻ８.０１~１２ｍｉｎꎬ２０％~２０％Ｂꎮ２㊀实验方法２.１㊀样品制备取出样品肌肉部分ꎬ剔除脂肪和结缔组织ꎬ切成小块后混匀ꎬ置冰箱中冷冻备用ꎮ样品解冻后匀浆ꎬ准确称取１.０ｇ匀浆后的组织样本到离心管中ꎬ加入１ｍＬ３０％氯化钠溶液和１ｍＬ乙腈震荡１ｍｉｎꎬ再加１ｇ中性氧化铝和４ｍＬ乙腈ꎬ震荡５ｍｉｎ后ꎬ４０００ｒ/ｍｉｎ离心５ｍｉｎꎻ取上清液２ｍＬ于５０ħ氮气流下吹干ꎻ加入１００μＬ无水乙醇ꎬ震荡３０ｓꎬ再加入９００μＬ标品/样本稀释液震荡混匀后ꎬ取上清作为样本溶液ꎮ２.２㊀检测方法将所需试剂及样品置于室温(２０~２５ħ)平衡３０ｍｉｎ以上ꎻ取５０μＬ标准品/样本到对应的微孔中ꎬ然后每孔加入工作浓度酶标物５０μＬꎬ于２５ħ避光反应３０ｍｉｎꎻ将孔内液体甩干ꎬ每孔加３００μＬ洗涤液ꎬ充分洗涤５次后ꎬ拍干ꎻ每孔分别加入底物液Ａ液和Ｂ液各５０μＬꎬ避光于２５ħ反应１５ｍｉｎꎻ加入终止液５０μＬ/孔ꎬ用双波长４５０ｎｍ/６３０ｎｍ检测ꎬ在５ｍｉｎ内读完数据ꎮ２８山㊀东㊀科㊀学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀２０１９年２.３㊀灵敏度实验分别做６次标准曲线ꎬ得出半抑制浓度(ＩＣ５０)ꎮ分别测定１０个阴性鱼肉样品ꎬ测定结果的平均值加上３倍标准偏差ꎬ即为检出限ꎮ２.４㊀准确度实验在空白样品中进行低㊁中㊁高浓度加标回收实验ꎬ共进行７批检测ꎮ３㊀结果与讨论３.１㊀灵敏度测定结果以计算的标准溶液相对吸光度值为纵坐标ꎬ以己烯雌酚０.０㊁０.１㊁０.３㊁０.９㊁２.７μｇ/Ｌ浓度的对数为横坐标ꎬ分别做６次己烯雌酚标准液相对吸光度值与浓度的标准曲线ꎬ线性关系良好ꎬ如表１所示ꎮ表１㊀己烯雌酚测定过程随行工作曲线及相关系数Ｔａｂｌｅ１㊀ＳｔａｎｄａｒｄｃｕｒｖｅｏｆＤＥＳａｎｄＩＣ５０序号标准曲线回归系数ＩＣ５０/(μｇ Ｌ－１)１ｙ＝－１４.００８４ｘ＋１９.００９６０.９８７７０.１１２ｙ＝－１９.０１０５ｘ＋１５.３０８７０.９８１７０.１６３ｙ＝－１６.１０５４ｘ＋１５.６４０４０.９８８９０.１２４ｙ＝－１８.１０１６ｘ＋１７.３３６４０.９７１７０.１６５ｙ＝－１７.１６５７ｘ＋１５.９７９１０.９７５３０.１４６ｙ＝－１７.２９５５ｘ＋１５.７８２７０.９６７００.１４㊀㊀实验测得１０个阴性鱼肉样品中己烯雌酚含量分别为０.２５㊁０.２７㊁０.２１㊁０.２８㊁０.１５㊁０.２４㊁０.２６㊁０.１７㊁０.２９㊁０.１８μｇ/ｋｇꎬ平均值为０.２３μｇ/ｋｇꎬ标准偏差为０.０４μｇ/ｋｇꎬ则该方法检出限为０.３５μｇ/ｋｇꎮ３.２㊀准确度测定结果取阴性实际样品加入相应浓度的标准溶液制备质控样品ꎬ进行实际样品加标回收率实验ꎬ共进行７次加标ꎬ测得结果如表２所示ꎮ表２㊀己烯雌酚加标回收率Ｔａｂｌｅ２㊀ＲｅｃｏｖｅｒｙｒａｔｅｏｆＤＥＳ序号添加浓度/(μｇ ｋｇ－１)己烯雌酚测定值/(μｇ ｋｇ－１)回收率/％０.２８０.２３８１１２.６９２.３６８８７.６３６.９０９００.２８０.２３８１２２.６５２.２１８３７.５８６.１３８１０.２８０.２５８８３２.６１２.２２８５７.８９７.１６９１０.２９０.２２７７４２.６６２.５０９４７.９２６.４２８１０.２７０.２２８２５２.６０２.２６８７７.９３６.３２８０第３期张瑞凌ꎬ等:酶联免疫法测定水产品中己烯雌酚残留量续表２序号添加浓度/(μｇ ｋｇ－１)己烯雌酚测定值/(μｇ ｋｇ－１)回收率/％０.２９０.２３８０６２.６７２.２９８６７.８２６.１６７９０.２９０.２３８１７２.６７２.３２８７７.６０５.８８７７㊀㊀７批阴性样品在３个添加浓度的平均回收率在７７％~９１％ꎬ相对标准偏差２.２０％~４.４５％ꎬ说明该方法准确度良好ꎮ３.３㊀假阴性率用ＬＣ￣ＭＳ/ＭＳ验证随机抽取的２０份ＥＬＩＳＡ检测得到的阴性样品ꎬ均未检出己烯雌酚残留ꎬ则假阴性率为０ꎬ说明本方法具有良好的特异性ꎮ３.４㊀假阳性率检测水产样品２６０份ꎬ有１个阳性样品ꎬ测定浓度为１.２μｇ/ｋｇꎮ对该样品用ＬＣ￣ＭＳ/ＭＳ验证ꎬ质谱结果见图１ꎮ由图１可以看出该阳性样品经ＬＣ￣ＭＳ/ＭＳ测定结果为阴性ꎮ图１㊀己烯雌酚标准品及样品的ＭＲＭ色谱图Ｆｉｇ.１㊀ＭＲＭｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍｏｆｓｔａｎｄａｒｄＤＥＳａｎｄｓａｍｐｌｅ该方法假阳性率＝阳性结果样品量ˑ１００％＝０.３８％ꎮ３８４８山㊀东㊀科㊀学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀２０１９年４㊀结论本文对酶联免疫法定量检测水产品中己烯雌酚的方法进行了验证ꎮ该方法中己烯雌酚检出限为０.３５μｇ/ｋｇꎬ加标回收率为７７％~９１％ꎬ方法满足农业部发布的«动物性食品中兽药最高残留限量»[１１]的要求ꎮ本文采用的ＬＣ￣ＭＳ/ＭＳ法避免了假阳性结果ꎬ酶联免疫法灵敏㊁分析快速㊁操作简单㊁检测效率高ꎬ适合大批量样品中己烯雌酚残留的筛查ꎮ参考文献:[１]ＤＯＤＤＳＥＣꎬＧＯＬＤＢＥＲＧＬꎬＬＡＷＳＯＮＷꎬｅｔａｌ.Ｏｅｓｔｒｏｇｅｎｉｃａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｃｅｒｔａｉｎｓｙｎｔｈｅｔｉｃｃｏｍｐｏｕｎｄｓ[Ｊ].Ｎａｔｕｒｅꎬ１９３８ꎬ１４１(３５６２):２４７￣２４８.ＤＯＩ:１０.１０３８/１４１２４７ｂ０.[２]ＦＡＮＱＪꎬＷＡＮＧＸＨꎬＺＨＯＵＱＢꎬｅｔａｌ.Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓｏｆａｒｔｉｆｉｃｉａｌａｎｔｉｇｅｎｓｏｆｄｉｅｔｈｙｌｓｔｉｌｂｅｓｔｒｏｌａｎｄｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｏｆｉｔｓａｎｔｉｂｏｄｙ[Ｊ].ＦｒｏｎｔＡｇｒｉｃＣｈｉｎａꎬ２０１０ꎬ４(２):１８８￣１９４.ＤＯＩ:１０.１００７/ｓ１１７０３￣０１０￣００９７￣８.[３]ＨＥＲＢＳＴＡＬꎬＵＬＦＥＬＤＥＲＨꎬＰＯＳＫＡＮＺＥＲＤＣ.Ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａｏｆｔｈｅｖａｇｉｎａ:ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｏｆｍａｔｅｒｎａｌｓｔｉｌｂｅｓｔｒｏｌｔｈｅｒａｐｙｗｉｔｈｔｕｍｏｒａｐｐｅａｒａｎｃｅｉｎｙｏｕｎｇｗｏｍｅｎ[Ｊ].ＮＥｎｇｌＪＭｅｄꎬ１９７１ꎬ２８４(１５):８７８￣８８１.ＤＯＩ:１０.１０５６/ＮＥＪＭ１９７１０４２２２８４１６０４. [４]邓省亮ꎬ李平ꎬ于洪侠ꎬ等.己烯雌酚残留检测技术的研究进展[Ｊ].中国畜牧杂志ꎬ２０１０ꎬ４６(２４):５６￣６０.[５]中华人民共和国农业部.中华人民共和国农业部公告第１９３号[ＥＢ/ＯＬ].[２０１８￣０５￣１２].ｈｔｔｐ://ｊｉｕｂａｎ.ｍｏａ.ｇｏｖ.ｃｎ/ｚｗｌｌｍ/ｔｚｇｇ/ｇｇ/２０１１０４/ｔ２０１１０４２２＿１９７６３２４.ｈｔｍ.[６]中华人民共和国农业部.中华人民共和国农业部公告第１７６号[ＥＢ/ＯＬ].[２０１８￣０５￣１２].ｈｔｔｐ://ｊｉｕｂａｎ.ｍｏａ.ｇｏｖ.ｃｎ/ｚｗｌｌｍ/ｔｚｇｇ/ｇｇ/２０１１０４/ｔ２０１１０４２２＿１９７６３０７.ｈｔｍ.[７]王东伟ꎬ陈建华ꎬ周磊.高效液相色谱法测定饲料中己烯雌酚含量的方法学考察[Ｊ].中国草食动物科学ꎬ２０１５ꎬ３５(６):７４￣７６.ＤＯＩ:１０.３９６９/ｊ.ｉｓｓｎ.２０９５￣３８８７.２０１５.０６.０２４.[８]应永飞ꎬ朱聪英ꎬ陈慧华ꎬ等.液相色谱￣串联质谱法测定动物组织中１ꎬ２￣二苯乙烯类药物残留的研究[Ｊ].质谱学报ꎬ２００８ꎬ２９(６):３４３￣３４８.[９]郭志峰ꎬ安秋荣ꎬ刘鹏岩.鸡蛋中己烯雌酚的ＧＣ/ＭＳ法分析测定[Ｊ].质谱学报ꎬ１９９７ꎬ１８(３):３６￣４０.[１０]ＨＯＦＦＭＡＮＮＢꎬＷＥＩＬＥＲＳ.Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎｓｏｎｔｈｅｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｓｔｉｌｂｅｎｅｓｉｎｔｉｓｓｕｅｓａｍｐｌｅｓｆｒｏｍｐｉｇｓ[Ｊ].ＡｒｃｈｉｖＦｕｒＬｅｂｅｎｓｍｉｔｔｅｌｈｙｇｉｅｎｅꎬ１９８６ꎬ３７(６):１３７￣１４２.[１１]中华人民共和国农业部.动物性食品中兽药最高残留限量[ＥＢ/ＯＬ].[２０１８￣０５￣１２].ｈｔｔｐ://ｊｉｕｂａｎ.ｍｏａ.ｇｏｖ.ｃｎ/ｚｗｌｌｍ/ｔｚｇｇ/ｇｇ/２００３０２/ｔ２００３０２２６＿５９３００.ｈｔｍ.。
农产品快速检测技术W1207-4 酶联免疫法快速检测虾中的己烯雌酚-微教材
《农产品/食品快速检测技术》课程-微教材知识讲解1、实验原理采用直接竞争ELISA方法，在微孔板包被有己烯雌酚偶联抗原，加入己烯雌酚标准品或样品，游离己烯雌酚与微孔板上预包被的己烯雌酚偶联抗原相互竞争酶标记的己烯雌酚抗体，用TMB底物显色。
加入终止液后颜色由蓝色变为黄色，用酶标仪在450nm波长下进行检测，吸光值与样品中己烯雌酚含量呈反比，通过标准曲线计算样品中己烯雌酚的含量。
边学边练任务：直接竞争酶联免疫法快速检测虾中的己烯雌酚样品：基围虾肉参考标准：水产行业标准《水产品中己烯雌酚残留量的测定——酶联免疫法》（SC/T3020—2004）ELISA操作技术要点：1、试剂盒组成（1）预包被的己烯雌酚偶联抗原的可拆酶标板：1块（2）己烯雌酚标准品6瓶：0ng/mL，0.1 ng/mL，0.3 ng/mL，0.9 ng/mL，2.7 ng/mL，8.1 ng/mL （3）酶标记的己烯雌酚抗体：1瓶（4）显色液A：1瓶（5）显色液B：1瓶（6）终止液：1瓶（7）浓缩洗涤液（20×）：1瓶（用蒸馏水按1:20稀释备用）2、分析步骤（1）试剂平衡要将所需试剂从冷藏环境中取出，置于室温（20℃~25℃）平衡2h以上，洗涤工作液在使用前也需回至室温。
（2）微孔板的准备取出需要数量的微孔板，将不用的微孔放入自封袋，保存于2℃~8℃。
（3）竞争反应在对应的微孔中加入标准品/样本50μL/孔。
然后加入己烯雌酚抗体酶标物50μL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置37℃温浴反应30min（温浴过程中不时轻拍反应板，以减少反应误差）。
（4）洗板取出微孔板洗板，小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用洗涤工作液250μL/孔，充分洗涤4次~5次，每次间隔10s，用吸水纸拍干（5）显色洗涤后，立即加入显色液A 50μL/孔，再加显色液B 50μL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置37℃温浴10min。
（6）测定最后加入终止液50μL/孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处，测定每孔OD值。
气质检测水产品中己烯雌酚含量的研究
气质检测水产品中己烯雌酚含量的研究
蒋翠红
【期刊名称】《食品安全导刊》
【年(卷),期】2016(0)12
【摘要】己烯雌酚在生物工程中是利用人工合成手段得到的一种雌性激素。
纯度较高的己烯雌酚具有较强的物理性质,还能与各碱性溶液进行相溶,其在临床医学中得到广泛应用。
己烯雌酚加快生物个体成长速度的同时,但也会造成一定危害,当人进食使用含有该物质饲料的动物后会危及人类健康。
因此,选取水产品进行检测,运用试剂盒作为筛选方法之一,液相质谱、色谱共同串联作为主要检测方法,
【总页数】1页(P91-91)
【作者】蒋翠红
【作者单位】长春市水产品质量安全检测中心
【正文语种】中文
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水产品中己烯雌酚快速检测方法试验分析摘要对一种快速检测水产品中己烯雌酚残留量elisa方法进行试验分析,结果表明:在0.15~9.00ng/ml浓度范围内,回归方程
y=-13.141ln(x)+43.52,相关系数r2=0.994 8;相对平均偏差为
3.0%~11.6%;回收率为73%~96%;样品检测下限为0.075ng/g;定量下限为0.25ng/g;操作过程简单,检测成本低,检测时间短,因而该方
法适用于大批量水产品中己烯雌酚残留量快速检测。
关键词水产品;己烯雌酚;elisa;快速检测
中图分类号 s912 文献标识码a文章编号
1007-5739(2009)15-0347-01
己烯雌酚(diethylstilbestrol,des)是一种人工合成的雌性激素,应用于水产养殖中能够促进蛋白质同化,提高饲料转化率,同时促进鱼虾类生长。
但因其在水产动物中代谢较慢且作用顽强,极小的残留都会对人体生理功能产生影响,主要危害是扰乱人体激素平衡,并具有致癌性,现已被禁止应用于水产养殖中,规定水产品中不得检出己烯雌酚[1]。
为此,从2002年开始我国要求水产品中己烯雌酚残留量的检出限为0.6 μg/kg,欧盟要求以2μg/kg为阳性下限。
目前,己烯雌酚常用的检测方法有高效液相色谱法(hplc)和酶联免疫法(elisa),但是hplc法[2]在检出限上不能满足要求;elisa 法[3]是目前水产品中des残留检测的标准方法,但也存在样品处理过程复杂、检测时间长、成本高等不足。
为了寻求一种经济、简便、
灵敏、特异性强的测定方法,笔者对一种快速检测水产品中己烯雌酚残留量的elisa方法进行试验分析,现将结果报告如下。
1材料与方法
1.1仪器与试剂
lab system mk3型酶标仪、mettler pb602-n电子天平、n- evap 氮吹仪、lrh-150s恒温培养箱、移液器(10μl、20μl、100μl和1ml各1支)、多道移液器(50~300μl)。
美国bioo maxsignaltm己烯雌酚elisa试剂盒、乙酸乙酯、正己烷、无水cacl2。
1.2测定方法
1.2.1预处理。
虾、蟹、甲鱼和淡水鱼取肌肉部分,用匀浆器对样品进行匀浆。
1.2.2提取。
称取3.00g匀浆样品(每个样品称2份),加入9ml 乙酸乙酯,0.3g无水cacl2,最大速度振荡3min;20℃,6 000rpm离心5min;移取6ml上清液到另一新的试管,氮气吹干。
1.2.3净化。
加入2ml正己烷溶解样品;加入1ml1×pbs-甲醇(3∶2,v/v),漩涡振荡2min;20℃,6 000rpm离心10min,除去上层正己烷层,部分蟹样再次加入正己烷重新净化1次,取50μl下层溶液进行检测。
1.2.4质控。
取不同批次的南美白对虾和中华绒螯蟹样品,以
20ng/ml的标准溶液分别添加3个不同的浓度水平测试回收率,同时做空白。
提取、净化过程同1.2.2和1.2.3。
1.2.5elisa反应测试步骤。
将bioo试剂盒从冷藏箱取出,并回温至室温。
按说明书稀释抗体、洗液和pbs;根据样品数量确定所需的微孔板数,设计好标准品、质控和样品的排布(每个浓度的标准品和每份处理后待测溶液均设平行双孔);分别加入50μl标准品和样品于所设定的孔中;在每孔中加入100μl一抗,混匀1min;室温(20~25℃)孵育30min;洗板3次,每次加入250μl1×洗液,最后一次将板尽量甩干并在吸水纸上吸干;每孔加入150μl二抗;室温避光孵育30 min;洗板3次,每次加入250μl 1×洗液;加入100μl 的tmb底物,轻敲微孔板边缘混匀1min;在室温下培养15min,加入100μl的终止液终止反应,在450nm下读od值。
2结果与分析
2.1线性范围
分别计算标准、质控和样品的平均吸光度值和相对吸光度值:相对吸光度值(%)=(标准或样品吸光度值/零标准吸光度值)×100;以相对吸光度值为纵坐标,标准浓度为横坐标建立标准曲线(见图1)。
2.2精密度和回收率
从标准曲线上读取质控和样品的浓度值,计算南美白对虾和湖
蟹样品的精密度和回收率(见表1、表2)。
2.3检测限
从图1可知,0.15~9.00ng/ml浓度范围内,标准曲线线性关系良好,因此根据标准曲线范围内最低浓度0.15ng/ml,计算样品检测下限=0.15ng/ml×1ml×6ml/(4ml×3g)=0.075 ng/g;根据标准曲线范围内次低浓度为0.5ng/ml,计算样品定量下限=0.5ng/ml×1ml×
6ml/(4ml×3g)=0.25ng/g。
2.42种方法检测des比较
2种方法检测des的成本、时间比较见表3。
3结论与讨论
通过以上试验可知,快速检测水产品中己烯雌酚的方法在检测限、定量范围、精密度、回收率(73%~96%>70%)等技术指标上都满足标准[3]规定的要求;将其与德国r-biopharm己烯雌酚elisa试剂盒相比,操作过程简单,检测成本低,检测时间短,因而该方法非常适于大批量检测水产品中己烯雌酚残留含量。
同时,在试验中发现中华绒螯蟹样品的回收率比南美白对虾低,而在相同浓度下的相对平均偏差却较高。
这可能与中华绒螯蟹样品脂肪含量相对较高,提取物经过2次净化有关。
4参考文献
[1] 中华人民共和国农业部.ny5070-2002 无公害食品、水产品中鱼药残留限量[s].北京:中国标准出版社,2002.
[2] 中华人民共和国卫生部.gb/t 5009.108-2003 畜禽肉中己烯雌酚的测定[s].北京:中国标准出版社,2002.
[3] 中华人民共和国农业部.sc/t 3020-2004 水产品中己烯雌酚残留量的测定酶联免疫法[s].北京:中国农业出版社,2004.。