人类外周血染色体标本制备及G带观察及核型分析
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实验报告
课程名称:分子医学实验 指导老师: 成绩: 实验名称: 人类外周血染色体标本制备G 带观察及核型分析 同组学生姓名:
一、实验目的及原理
三、实验结果
二、操作步骤 四、讨论分析
一、 实验目的及原理
熟悉人类外周血淋巴细胞的培养方法。
初步掌握人类染色体标本培养和制备的基本方法。
通过实验掌握G带标本制备的基本方法,学会在显微镜下直接观察G 带分裂相。 在细胞周期的不同阶段,染色体的结构不同,在细胞分裂间期,染色体呈现细长的丝状结构,分散于细胞核中,且交织成网状,难以识别其数目和每个染色体特有的结构;在细胞有丝分裂中期,染色体凝缩形成短的棒状结构,排列在赤道板上,此时染色体的形态、数目最清楚,所以一般选择有丝分裂中期的细胞来观察染色体的形态、数目。
在人类遗传分析中,普遍采用外周血培养的方法制备染色体标本。但是在正常情况下,外周血中的淋巴细胞,几乎都处在G1期或G0期,因而外周血细胞中是没有分裂相的。在细胞培养过程中加入植物血凝素(phytohaemagglutinin, PHA) ,可以刺激外周血淋巴细胞转变为淋巴母细胞,进行有丝分裂,再通过秋水仙素处理,将细胞阻断在有丝分离中期。再通过离心、低渗、固定和滴片,就可以获得大量有丝分裂相。最后通过染色就可以观察染色体的结构和数目。本方法已为临床医学、病毒学、药理学、遗传毒理学等方面广泛应用。 有许多显示G带的方法,最常用的是将已经过老化的染色体制片放到37℃胰酶中进行处理,然后用Giemsa 染色。胰酶可以从染色体上抽取蛋白特定的组成部分。通过胰酶处理使G带区的疏水蛋白被除去或使它们构型变为更疏水状态。由此可见在G带区中抽取的蛋白往往是疏水蛋白。 关于显带机理有多种论点,总的来说,还不能完全解释显带的机理问题。
二、操作步骤
人类外周血染色体标本制备
1、采血
2、培养
RPMI1640培养液,37℃ 0.5℃恒温中培养72小时。
3、秋水仙素(colchicine)处理
在终止培养前2-3小时,加入秋水仙素。
4、离心
以1000转/分离心10分钟,弃上清,留沉淀并用吸管打匀。
5、低渗处理
加8毫升预温(37℃)的0.075M KCl低渗液(hypotonic solution),用吸管打匀使细胞悬浮于低渗液中,37℃水浴箱静止25-30分钟。
6、预固定
低渗后,加新配的固定剂(甲醇:冰醋酸, 3:1 )1毫升,打匀。
7、离心
以1000 rpm离心10分钟,弃上清
8、固定
加入5ml新配置的固定液,悬浮细胞,室温固定10-15分钟
9、离心
1000rpm离心10分钟,弃上清
10、再固定,加入5mL固定液(甲醇:冰醋酸=1:3),室温固定10-15分钟
11、再离心
1000转/分离心10分钟,弃去上清液。
12、再固定
加入固定液(甲醇:冰醋酸1:1)5mL,打匀,固定 10-15分钟。
13、制片
固定后,1000转/分离心留下0.2ml沉淀物,吸取细胞悬液滴在已用冰水浸泡的洁净载玻片上,立即用嘴吹散,在洒精灯焰上通过几次,使细胞平铺于载玻片上,空气干燥(air drying)。
14、染色( Giemsa staining)
Giemsa染液染色8分钟,玻片用自来水冲洗,晾干。
15、镜检(microscopic examination)
G带观察及核型分析
1、先将胰酶液水浴加热到37℃。
2、将染色体标本浸入胰酶液中,作用时间几秒到几十秒不等,依样本存放时间长短而定。(标本需预先经60-70℃烤2小时,或37℃恒温老化3-7天)
3、取出玻片标本,在生理盐水中过一下,再经过蒸馏水洗。
4、Giemsa 染色8分钟。
5、自来水洗、晾干。
6、镜检。在低倍镜下选择分散及显带良好的分裂相,然后在油镜下观察。如观察到染色体变粗并显得毛糙边缘,有时甚至呈糊状,是处理过度了。
三、实验结果
四、讨论分析
经过观察,所观察到的染色体数目恰好为46条,且基本上清楚可辨。染色体的边缘也不粗糙模糊。但是带型不清楚,可能是处理不当,与仪器的清晰度不够也有一定关系。
所观察的区域为胰液处理30分钟的区域。其余时间处理的很难找到优良的观察对象。说明在当时实验条件下30分钟为最佳处理时间。
这次实验最大的感触就是需要对片子进行耐心的观察,想要找到合适的容易观测的染色
P.3 体很难,需要有一定的耐心。
注意事项
1、带效果的好坏,主要决定于染色体的标本质量。标本染色体要长,染色体分散合适,背景无胞浆,
标本未老化即保存时间过长。
2、要注意胰酶处理的温度和时间。稳定显带的条件,才能保证显带效果。
3、磷酸缓冲液的pH值不要过碱,否则着色不鲜明。
4、G带制备有许多种方法,各个实验室在细节处理上均不同,最好总结出适合自己实验室采用的方
法。如果使用效果良好,不要轻易更换新方法。
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