过氧化物酶的检测方法
过氧化物酶活性测定
过氧化物酶（POD）活性测定一、原理：过氧化物酶含铁，广泛存在于植物组织中，可催化过氧化氢氧化酚类，产物为醌类化合物，此化合物进一步缩合或与其他分子缩合，产生颜色较深的化合物。
本实验以邻甲氧基苯酚（即愈创木酚）为过氧化物酶的底物，当有H2O2 存在时，过氧化物酶可将邻甲氧基苯酚氧化成红棕色的4-邻甲氧基苯酚，其在470nm处有最大吸收峰，故可用分光光度计在470nm处测定其吸光值，即可求出该酶的活性。
二、实验准备：仪器：分光光度计、离心机、秒表、研钵、磁力搅拌器、移液管、电子天平、冰箱、100ml 容量瓶、试管、胶头滴管、试管架、烧杯、吸水纸、比色皿、剪子试剂：0.05 mol/L愈创木酚；2%H2O2； pH 6.0的磷酸缓冲液；75%酒精；蒸馏水试剂配制:○1pH 6.0的磷酸缓冲液:0.2mol/l NaH2PO4 (27.6g NaH2PO4•H2O 用蒸馏水配成1000ml）取87.7ml和0.2mol/l Na2HPO4 （71.7g Na2HPO4•12H2O 或53.65g Na2HPO4•7H2O 用蒸馏水配成1000ml）取12.3ml后混合，用蒸馏水稀释至200ml即可。
○22%H2O2：取6.7ml 30%H2O2于烧杯中，再加入93.3mL蒸馏水（或加蒸馏水稀释至100mL），搅拌均匀。
○30.05 mol/L愈创木酚：准确称取6.2g愈创木酚，再用95%的乙醇配制定容至100ml即可。
三、步骤：○1粗酶液的提取：称取一定质量的植物材料放入研钵中，加入提取液1 mL(pH 6.0的磷酸缓冲液)，研磨，再加入9 mL提取液，将匀浆全部转入离心管中，于4 000 r/min 4 ℃离心10 min，上清液即为酶的粗提取液，收集上清液于冷处（冰箱4℃保存）。
○2酶活性的测定：将4 mL反应混合液( pH 6.0的磷酸缓冲液2 mL,酶液1 mL,0.05 mol/L 愈创木酚1 mL)和1 mL 2% H202加入试管中立即摇匀并迅速倒入比色皿中，于470 nm波长下用U 2800型紫外可见分光光度计比色，立刻记录吸光度值，以后每15 s记录1次，记录2 min ，另外以缓冲液代替酶液作为较零对照组。
过氧化物酶、过氧化氢酶活性测定方法及试剂配制
过氧化物酶（POD ）活性测定【实验原理】过氧化物酶广泛分布于植物的各个组织器官中，在有H 202存在条件下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶褐色的4-邻甲氧基苯酚，可用分光光度计测生成物的含量来测定活性。
【实验试剂】 愈创木酚、30%过氧化氢、20mmol/LKH2PO4、100mmol/L 磷酸缓冲液（pH6.0）、反应混合液[100mmol/L 磷酸缓冲液（Ph6.0）50mL ，加入愈创木酚28uL,加热搅拌，直至愈创木酚溶解，待溶液溶解冷却后，加入30%过氧化氢19uL ，混合均匀保存在冰箱中]【方法步骤】（1）、粗酶液的提取 称取小麦叶片0.25g ，加20mmol/LKH2PO4 2.5mL ，于研钵中研成匀浆，以4000r/min 离心10分钟，收集上清液保存在冷处，所得残渣再用20mmol/LKH2PO4 2.5mL 提取一次，全并两次上清液，所得的即为粗酶提取液(酶活性过高，稀释10倍)。
（2）、酶活性的测定 取试管3只，于一只中加入反应混合液3mL ，KH2PO41mL ，作为校零对照，另外三只中加入反应混合液3mL ，稀释后的酶液1mL （如表1），立即开启秒表，于分光光度计470nm 波长下测量OD 值，每隔1min 读数一次（4min ）。
以每分钟表示酶活性大小，将每分钟OD 值增加0.01定义为一个活力单位。
表1 紫外吸收法测定POD 酶活性配置表4.结果计算以每分钟吸光度变化值表示酶活性大小，即以 ΔA 470 /[min · g （鲜重） ]表示之。
也可以用每 min内 A 470 变化 0.01 为 1 个过氧化物酶活性单位（ u ）表示。
POD 总活性[u/g(FW)]=式中：POD 总活性以酶单位每克鲜重表示。
其中 △470=ACK-AE比活力单位以酶单位每毫克蛋白表示。
ACK ——照光对照管的吸光度。
AE ——样品管的吸光度。
Vt ——样品液总体积，mL 。
过氧化物酶活性测定
过氧化物酶活性测定
过氧化物酶（peroxidase）是一类广泛存在于各种生物中的酶。
它们能够催化过氧化物与底物之间的氧化还原反应。
此类酶有多种生物功能，其中最重要的是用于废弃物的代谢和细胞保护。
在工业和农业领域中，过氧化物酶也常被用作催化剂。
因此，对于过氧化物酶的活性测定十分重要。
传统的过氧化物酶活性测定方法主要包括光谱分析法、吸光度法、滴定法、电化学法等。
今天我们主要介绍光谱分析法的原理和步骤。
过氧化物酶在酸性pH下的催化活性主要是由其含有的含铁金属离子（Fe3+）决定的。
Fe3+构成的氧桥结构能够与底物发生氧化还原反应，同时产生吸收峰。
因此，利用曲线拟合的方法可以测定样品中过氧化物酶的活性。
具体操作步骤如下：
1. 处理样品。
将待测样品加入一定比例的磷酸盐缓冲液（pH 5.0）。
若含有颜色物质需添加过滤效果的吸附剂。
2. 加入反应液。
向样品中加入过氧化氢，使其浓度为0.1%。
3. 反应后读取吸收度。
反应结束后，利用紫外-可见光谱仪读取其吸收值。
4. 分析数据。
根据吸收峰的强度和波长，利用标准曲线计算出过氧化物酶的活性。
总之，过氧化物酶活性的测定对于研究生物学和工业化学等领域都具有重要的意义。
随着科学技术的不断发展，相信在未来，这一领域的研究也将不断深入，为我们带来更多的新发现和应用。
过氧化物酶含量的测定(比色法)
过氧化物酶含量的测定（比色法）过氧化物酶含量测定是一种常用的生物学和化学学科中的实验方法。
该方法被广泛应用于生物体内氧化应激、氧化物解毒和氧化物代谢等方面的研究。
该方法利用底物的氧化还原反应，通过检测产生的表观色素的变化来测定过氧化物酶的酶活性。
实验原理：过氧化物酶是一种催化酯类和醇类底物的氧化还原反应酶，其底物是一种含有双键的多不饱和酯类及多酚类物质。
这些底物的氧化作用需要过氧化物酶及辅助成分，通过产生艳蓝色淀粉和牛肉素的氧化还原反应来表现出来。
常见的底物是喹啉及其衍生物类化合物。
这些化合物在钠盐和钾盐的存在下，可以和以均等量的0.02%-0.05%的过氧化氢溶液配合使用，产生表观色素（θ=100nm），其中颜色的强度与底物氧化的程度成正比。
过氧化物酶的酶活性是测定过程中的关键要素，一定的酶浓度可以帮助底物迅速氧化。
实验步骤：1.提取组织过氧化物酶，制备1%避光标准物质。
2.在底部添加适量的底物，并加入0.02%-0.05%的过氧化氢溶液（90min内完成剩余测定）。
第一个反应必须使反应均匀发生，并加入适量的怡宝那和氢氧化钾调节酸度和盐度，然后按照程序进行反应。
最大吸收波长：613nm；试管增量：每5秒；试管量：1ml。
3.利用磁性制动器将试管定在这个位置并将它们降到盘子中心，当酶浓度很低时可以通过上下弯曲试管使溶液更加均匀。
4.测量反应后溶液的吸光度，并确定吸收峰的位置。
根据标准曲线计算出样品中过氧化物酶的浓度，如图所示。
实验注意事项：1.所有的耗材都必须干燥，并且必须在实验过程中保持干燥状态。
2.测定前，必须使用透明质酸纯化介质和亚硫酸钠而不是硫酸钠进行预防性清洁。
3.在进行试管反应时，必须将试管置于盘子的中心位置。
如果实验中涉及液体转移，请务必谨慎操作。
4.严格按照各步骤操作，以保证实验结果的准确性。
总结：通过比色法测定过氧化物酶的酶活性是一种可靠、快速、简便的方法。
该方法的步骤简单，有助于对生物体内的氧化应激、氧化物解毒和氧化物代谢等方面的研究。
材料类过氧化物酶检测步骤
材料类过氧化物酶检测步骤1.将透析膜依次浸泡于50%乙醇1小时,10mmol/L NaHCO31小时, 1 mmol/LEDTA1小时,在蒸馏水中洗两次并放于含0.01%(m/V)叠氮钠的0.1mol/L磷酸钠缓冲液于4℃保存。
2.取≥1mg/ml抗体溶液(A280=1.44mg lgG/ml)对2L0.1mol/L pH6.8的磷酸钠缓冲液透析，于4C缓慢搅动下过夜。
3. 10mgHRP 溶解于1ml 0.1mol/L pH9.2的碳酸盐缓冲液，取0.25ml 加入0.25ml新配制的1.71 mg/ml NalO4溶液中，盖紧混匀，于室温下避光放置2h。
4.取1ml透析后的抗体溶液和0.25g SephadexG-25加至0.5mlHRP/NalO4混合腑中。
用玻璃棉塞紧巴斯德吸管管尖并用Parafilm 封口膜封好。
将抗体/葡聚糖凝胶/HRP混合物加人巴斯德吸管，室温下避光放置3h。
5.柱子用0.75ml碳酸盐缓冲液洗脱偶联物。
加38ul 5mg/ml NaBH4溶液至洗脱物中，室温下避光孵育30min。
再加112ul 5mg/ml NaBH4溶液继续孵育60min。
6.加0.9ml饱和硫酸铵溶液，于4℃下温和搅拌30min。
于4℃,10000g离心15min。
7.弃上清。
沉淀重溶于0.75 ml TEN缓冲液中，装人透析袋于4C对2LTEN 缓冲液透析过夜。
更换TEN缓冲液再继续透析4h。
8.从透析袋中取出偶联物，加BSA 至20mg/ml。
加等体积甘油，于-20℃保存。
过氧化物酶与抗体标记之后,可以进行抗原抗体的检测,这使得Trinder's 试剂检测、酶联免疫、鲁米诺化学发光分析这些检测方法与抗原抗体的免洗分析相结合起来,使各种检测方法适应性更广。
德晟是血液检测相关试剂的生产厂家，研发并销售有多种酶制剂、色原底物、发光底物。
过氧化物酶活性的测定
实验六：过氧化物酶活性的测定左哥一、实验目的：过氧化物酶是植物体内重要的呼吸酶类，其活性高低与酶类物质代谢，植物抗性密切相关。
通过实验掌握提取POD和测定其活性方法和原理。
二、实验原理：过氧化物酶催化H2O2氧化酶类，生成醌类化合物，此化合物进一步缩合或与其它分子缩合，产生颜色较深产物。
本实验以愈创木酚为底物，过氧化物酶催化H2O2将愈创木酚氧化成茶褐色产物，次产物在470nm波长处有最大吸收峰，故可通过测定470nm波长下的吸收光度变化得知过氧化物酶的活性。
三、材料与试剂材料：马铃薯试剂：20m mol/L KH2PO4,反应混合液四、方法步骤：1、酶液制备：称取材料1.079g，加入20m mol/L KH2PO4 5ml,于研钵中研磨成匀浆，在3000r/min，下离心10min,上清液转入25ml,容量瓶，残渣再用5ml, KH2PO4,提取一次，定容，混匀，贮于冷凉处备用。
2、比色测定：光径1cm比色杯两只，1只先加1ml KH2PO4，再加3ml混合液作参比液；另一只加1ml,酶液，3ml混合液，立即计时并置于分光光度计中，在470nm下测定光密度，每隔1min读数一次，连续测8min，每次测定前重新对照校准。
五、实验结果酶活力（0.01 A470/L）=(A2-A1)/0.01(t2-t1)*(V2/V1)=328.2μ酶的比活力（μ/g）=酶活力/样品重=304.2μ/g实验七：种子生活力快速测定一、实验目的：种子生活力即种子发芽潜力，是鉴定种子力量研究种子储藏生理的重要指标，本实验运用TTC，红墨水发快速测定种子生活力。
二、实验原理：1、TTC法：有生活力的种子呼吸作用产生的NADH能还原TTC，生产的红色的TPE，将胚染成红色，无生活力的种子，无呼吸代谢活动，不能还原TTC，肧不着色。
2、红墨水法：植物活细胞的原生质膜有选择透性，某些染料分子不能透过。
如红墨水，因而不能将种肧染色，而死的种肧，其细胞膜结果破坏，选择透性丧失，因而染料分子能透过膜进入细胞将种肧染色。
实验五_过氧化物酶酶活性的测定
实验五_过氧化物酶酶活性的测定一、实验原理1. 过氧化物酶（POD）在植物生长过程中发挥重要作用。
在压力、紫外线辐射、微生物侵入和病原体感染等外界刺激下，植物组织中的过氧化物酶活性会显著增加，以保护植物免遭伤害。
2. 过氧化物酶是一种氧化酶，催化产生氧气的反应（如下）：ROOR′+ 酶———> R′OH + O23. 过氧化物酶活性的测定实验基于上述反应，利用巴尔的显色方法测定过氧化物酶催化下的氧化反应速率。
二、实验步骤1. 将100mL的3% H2O2（v/v）制成浓度为60mmol/L的过氧化氢溶液。
2. 按0.5mL、1mL、1.5mL、2mL、2.5mL 5个等份，取出浓度分别为6、12、18、24、30mmol/L的H2O2溶液，放入5个试管中。
4. 将1mL的20mg/mL酶溶液加入中等浓度（12mmol/L）的H2O2溶液中，混合均匀。
缓慢倾斜试管，使溶液彻底混合。
5. 取出一根手指，将其浸泡于硫酸铁铵溶液中。
将试管倾斜，瓶口与硫酸铁铵溶液接触，放入深100°C的水浴中加热2min。
将溶液混合均匀。
6. 将试管移出水浴，冷却到室温后，再加入1mL的硼酸缓冲液，混合均匀。
7. 测定吸收值（深紫色的铁化合物阴离子形成）。
利用光度计在546nm处测量。
8. 按照如上步骤分别测定不同浓度下的H2O2溶液。
三、结果分析1. 计算各试管中产生的氧气量，并绘制曲线（以5mmol/L，10mmol/L，15mmol/L，20mmol/L，25mmol/L的浓度为横坐标）。
2. 计算过氧化物酶活性（OD/min/mg）。
四、实验注意事项1. 检查瓶塞和试管，确保没有损坏。
2. 操作过程中，需严格按照试剂用量来添加试剂。
3. 热水浴器的温度应为100°C。
4. 硫酸铁铵溶液应略微加热一会儿，以充分溶解。
5. 实验过程中避免强光照射。
过氧化物酶活性的测定
过氧化物酶活性的测定一、实验目的掌握酶活性的测定方法和原理。
二、实验原理过氧化物酶是一种含铁卟啉的氧化酶，是利用H2O2将代谢中一些化合物氧化,其活性与呼吸作用、光和作用等一些生理过程有关。
测定过氧化物酶的活性变化是植物生理和病历上一个常用的指标。
在有过氧化氢存在下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶褐色物质，该物质在470 nm 处有最大吸收，可用分光光度计测量470 nm的吸光度变化测定过氧化物酶活性。
三、材料、设备和试剂新鲜马铃薯块茎容量瓶（25ml）、量筒（25ml）、移液管（1ml）、研钵、试管架UV-9200紫外可见分光光度计、天平、秒表0.2M磷酸缓冲液（pH6.0）：将0.2M NaH2PO4溶液87.7ml与0.2M Na2HPO4溶液12.3ml混合反应混合液四、实验方法4.1制备酶液：4.2活性测定：值为纵坐标，绘制酶促反应曲线，计算酶的相对活性。
过氧化物酶活性=(△OD470*Vt)/(W*Vs*0.01*t)[u/(g·min)]其中：△OD470为反应时间内吸光值的变化；W为样品质量；t为反应时间；Vt为提取酶液总体积；Vs为测定时酶液体积。
聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分离种子蛋白质一、实验目的学习聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理，掌握聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳的操作技术。
二、实验原理SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS(十二烷基磺酸钠), SDS能断裂分子内和分子间氢键,破坏蛋白质的二级和三级结构,强还原剂能使半胱氨酸之间的二硫键断裂,蛋白质在一定浓度的含有强还原剂的SDS溶液中,与SDS分子按比例结合,形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物,这种复合物由于结合大量的SDS,使蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分子大小为特征的负离子团块,从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异,由于SDS与蛋白质的结合是按重量成比例的,因此在进行电泳时,蛋白质分子的迁移速度取决于分子大小.当分子量在15KD到200KD之间时,蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系,符合下式:logMW=K-bX,式中:MW为分子量,X为迁移率,k,b 均为常数,若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图,可获得一条标准曲线,未知蛋白质在相同条件下进行电泳,根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量，从而根据分子量将混合蛋白质分离开。
植物中过氧化物酶的鉴定及其在抗氧化作用中的应用
植物中过氧化物酶的鉴定及其在抗氧化作用中的应用植物是生命的源头，其生命活动极其复杂且繁忙。
在这个过程中，植物需要应对各种外界环境压力，包括氧化压力。
氧化压力是体内存在的一种现象，与许多疾病的发生有关。
植物中的过氧化物酶（POD）是非常重要的一种酶，在氧化压力中发挥着重要作用。
因此，本文将介绍如何鉴定植物中的POD以及它在抗氧化作用中的应用。
一、过氧化物酶的鉴定POD是一种酸性酶，存在于植物细胞的各个部位，如细胞壁、叶绿体、线粒体、高尔基体等。
鉴定POD的方法有很多，其中主要有以下几种方法：1、活性测定法POD酶的活性可以通过检测其催化的底物的降解速度来测定。
常见的检测底物有过氧化氢、苯酚等，检测方法包括光度法、荧光法等。
这种方法简单易行，较为常用，但无法准确区分不同的POD等级。
2、免疫印迹法免疫印迹法可以测定特定POD蛋白的存在和表达水平。
该方法通过电泳将蛋白分离并转移到固体载体上，再使用特异性抗体与POD结合，然后用荧光素二磷酸酯显色，最后用胶片等媒介记录。
与活性测定法不同，免疫印迹法可以区分不同的POD等级。
3、PCR法PCR法是通过扩增特定的POD基因序列进行鉴定。
通过PCR扩增出的目的产物可以直接克隆到表达载体中，然后进行蛋白表达测定。
这种方法准确度高，但需要PCR技术的支持。
二、POD在抗氧化中的应用氧化作用是许多疾病和老化的修补过程，但如果氧化作用过度，则会产生有害的自由基，对细胞造成严重的损害。
植物中的POD可以将过氧化氢转化为水和氧，从而减轻氧化压力。
POD的应用也成为了目前研究的热点领域。
1、抗菌过氧化物酶在植物病害中起到了很大的作用。
POD能够作为抗病机制的一部分。
吲哚乙酸是一种有效的植物生长调节剂，可以提高POD的活性，从而增加植物抵抗菌虫的能力。
2、抗氧化POD是植物细胞内重要的抗氧化酶之一，能够清除氧化物质，维持细胞稳态。
然而，在氧化环境下，POD的活性会降低或失去，导致过氧化氢等有害物的累积，从而引发细胞损伤。
酶活性的测定
超氧阴离子自由基（O2-），后者氧化羟胺形成亚 硝酸盐，在显色剂的作用下呈紫红色，用可见光 分光光度计测其吸光度。当被测样品中含SOD时， 则对超氧阴离子自由基有专一性的抑制作用，使 形成的亚硝酸盐减少，比色时测定管的吸光度值 低于对照管的吸光度值，通过公式计算可求出被 测样品中的SOD活力。
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整理课件
抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性测定 ——在茶叶中
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整理课件
实验原理
APX（抗坏血酸过氧化物酶）催化AsA与H2O2反 应而使H2O2:2AsA+ H2O2→2MD-AsA( 单脱氢抗坏血 酸)+2H2O。抗坏血酸过氧化物酶是以抗坏血酸为 电子供体的，APX首先与H2O2形成中间复合物，中 间复合物接着氧化AsA形成产物，当AsA未被复合 物利用时，APX失活。只要AsA能够再生，APX就 能充分进行催化反应，从而保护叶绿体维持正常 的光合能力。
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整理课件
过氧化氢酶(Hydrogen Peroxidase)又名 触酶(Catalase，CAT)，是一类以铁卟琳为 辅基的结合酶，由4个亚基组成，分子量为 240 000。存在于动植物组织与细胞中的氧 化还原酶类，它专一性地将细胞代谢产生 的过氧化氢分解成H2O和02，避免了H202在体 内积累，从而可维持体内正常的活性氧水
平。是最早发现的与种子活力有关的氧化 酶类之一.
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过氧化氢酶的应用：
被用于食品包装，防止食物被氧化。 在纺织工业中，被用于除去纺织物上的过氧化氢，以保证成品是不含
过氧化物的。 它还被用在隐形眼镜的清洁上：眼镜在含有过氧化氢的清洁剂中浸泡
后，使用前再用过氧化氢酶除去残留的过氧化氢。 近年来，过氧化氢酶开始使用在美容业中。一些面部护理中加入了该
测定过氧化物酶的原理
测定过氧化物酶的原理过氧化物酶（peroxidase）是一类催化反应的酶，它能够催化过氧化物（如过氧化氢、过氧化甲苯）与底物间的氧化还原反应。
测定过氧化物酶的原理主要涉及到它与底物之间的反应以及产品的检测。
测定过氧化物酶的方法之一是通过测定样品中底物氧化产生的颜色变化来间接测定过氧化物酶的活性。
一般情况下，加入底物和过氧化物酶后，在适宜的条件下（如适宜的温度和pH 值），底物会被过氧化物酶催化氧化，生成氧化产物，并伴随着颜色的变化。
这种颜色的变化可以通过比色法、荧光法或者发光法来测定，从而获得过氧化物酶的活性。
比色法是最常用的一种测定过氧化物酶活性的方法。
一般使用底物TMB（3,3',5,5'-四甲基苯基二胺）或者DAB（二氨基苯）等，它们在过氧化物酶的作用下氧化，生成带有颜色的产物。
通过测定产生的颜色的强度，可以反映出过氧化物酶的活性。
常见的测定方法包括吸光度测定、荧光强度测定等。
除了比色法外，还可以使用荧光法来测定过氧化物酶。
该方法基于过氧化物酶催化底物产生的荧光变化来测定酶的活性。
底物一般为氨基酚类荧光底物，如APF（2',7'-二羟基荧光素）等。
荧光强度的变化可以通过荧光仪来监测，从而测定过氧化物酶的活性。
此外，还可以使用发光法来测定过氧化物酶的活性。
该方法利用底物与非载体的酶标记结合，通过酶催化产生的发光信号来测定过氧化物酶的活性。
底物通常是发光底物，如Luminol。
在酶催化下，底物产生的发光信号强度可以通过发光仪来检测，从而获得过氧化物酶的活性。
综上所述，测定过氧化物酶的原理主要是通过底物与过氧化物酶的催化反应产生的氧化产物的颜色、荧光或发光强度的变化来间接测定酶的活性。
这些方法在生物医学研究、食品安全监测、环境保护等领域中有广泛的应用。
过氧化物酶活性的测定POD
过氧化物酶活性的测定POD一、原理： 过氧化物酶催化过氧化氢氧化酚类的反应，产物为醌类化合物，此化合物进一步缩合或与其他分子缩合，产生颜色较深的化合物。
本实验以邻甲氧基苯酚（即愈创木酚）为过氧化物酶的底物，在此酶存在下，H 2O 2可将邻甲氧基苯酚氧化成红棕色的4-邻甲氧基苯酚红棕色的物质可用分光光度计在470nm 处测定其消光值，即可求出该酶的活性。
，二、实验准备仪器：分光光度计、离心机、秒表、天平、研钵、磁力搅拌器试剂：愈创木酚、30%H 2O 2、0.2mol/L 磷酸缓冲液（7.8）、0.1mol/L 磷酸缓冲溶液（PH6.0，见附录） 反应混合液[100mmol/L 磷酸缓冲溶液（PH6.0）50ml ，加入愈创木酚28μl ，于磁力搅拌器上加热搅拌，直至愈创木酚溶解、待溶液冷却后，加入（待溶液冷却后再加入，否则引起分解）30%H 2O 2 19μl ，混合均匀，保存于冰箱中。
]三、步骤：1、粗酶液的提取：称取植物材料0.4-0.5g ，加磷酸缓冲液（7.8）5ml （分几次加入），于研钵中研磨成匀浆，以8000r/min 离心10min ，收集上清液于冷处（冰箱4度保存）。
2、酶活性的测定：一个试管入反应混合液3ml ，磷酸缓冲液（7.8） 1ml ，作为校零对照，另外加入反应混合液3ml ，上述酶液1ml （龙麦26酶液稀释10倍，克旱16酶液稀释15倍），立即开启秒表计时，于470nm 测OD 值，每隔15秒读1次值，读45秒，以为每15秒钟OD 变化值测酶活性的大小，以△OD/min.mg 蛋白质表示。
四、计算公式W t t ⋅⋅⋅∆=01.0V VA 活性POD 470 ΔA 470：反应时间内吸光值的变化W ：样品重量V ：提取液总体积，即5mlVt ：测定时所用体积,即1mlt ：反应时间注意：一般来说，都需要稀释，如果酶液稀释了，应在计算时乘上相应的倍数。
——张志良，瞿伟菁，P 123-124,2004高教版《植物生理学实验指导》——李玲主编，P 97-98，科学出版社，2009,《植物生理学模块实验指导》磷酸缓冲液配置A 0.2mol/l NaH2PO4 27.8g NaH2PO4•H2O 1000mlB 0.2mol/l Na2HPO4 71.7g Na2HPO4•12H2O 1000mlA(ml) B(ml)PH7.8 8.5 91.5200mlPH6.0 87.7 12.3。
过氧化物酶活性的测定
测定过氧化物酶的方法_概述说明以及解释
测定过氧化物酶的方法概述说明以及解释1. 引言1.1 概述过氧化物酶是一类重要的酶，在生物体内具有广泛的分布和功能。
它们参与了许多生物体内的代谢反应，对于维持细胞内氧化还原平衡、保护生物体免受有毒氧自由基的损害以及调节细胞信号传导等方面起到了重要作用。
因此，准确测定过氧化物酶的活性对于深入研究其功能、解析其催化机制以及探索相关疾病的发生机理具有重要意义。
本篇长文将概述和解释测定过氧化物酶活性的方法。
首先，我们将介绍过氧化物酶的定义、分类及其在生物体内的功能和意义。
然后，我们会详细说明测定过氧化物酶活性的基本原理，包括定义、测定方法概述、底物选择和适用测定技术等内容。
接着，我们将列举常见的测定过氧化物酶活性实验操作步骤，并提供注意事项，涵盖基于底物转变法、电极分析法和光度计法等不同测定方法。
最后，我们将总结各种测定方法，并归纳它们的优缺点及适应范围。
同时，我们还会展望未来过氧化物酶测定方法的发展方向。
本文旨在为读者提供一个全面了解测定过氧化物酶活性的方法的指南，帮助研究者选择合适的实验方法并提高实验准确性和科学价值。
2. 过氧化物酶的作用与重要性2.1 过氧化物酶的定义与分类过氧化物酶是一类广泛存在于生物体内的酶，主要作用是催化过氧化物的降解。
根据其活性中心的类型和反应底物的特点，可以将过氧化物酶分为不同的类别，如超氧歧化酶、过氧化氢酶和过氧化脂质酶等。
2.2 过氧化物酶在生物体内的功能及意义过氧化物酶在生物体内扮演着重要角色。
首先，它们参与抗氧化防御系统，帮助清除产生于细胞代谢中生成的有毒自由基和过量产生的活性氧分子。
这些有害分子会损害细胞膜、DNA和其他细胞结构，因此通过催化其降解来保护细胞免受损伤。
其次，某些类型的过氧化物酶还参与了正常生理活动中关键的代谢途径，例如呼吸链中能量产生以及荷尔蒙合成等。
2.3 过氧化物酶参与的反应类型和催化机制过氧化物酶能够催化多种不同类型的反应，包括超氧阴离子的歧化、过氧化氢的分解以及脂质过氧化等。
酶活性的测定
计算公式
每克鲜叶APX的酶活性U= （X×7.5×1000×60×1000）/ （m×2.8×20×10） 上式中，X：OD值的变化；7.5：每克材料 提取7.5mL粗酶液；1000：将ml转化成µL； 60：将1min转化成60s；1000：将mmol转化 成µmol；m：鲜叶的重量，单位为g；2.8： 吸光系数mmol/L cm；20：用20µL酶液进行 活性测定；10：每10s记录吸光值的变化。
过氧化氢酶的应用：
被用于食品包装，防止食物被氧化。 在纺织工业中，被用于除去纺织物上的过氧化氢，以保证成品是不含 过氧化物的。 它还被用在隐形眼镜的清洁上：眼镜在含有过氧化氢的清洁剂中浸泡 后，使用前再用过氧化氢酶除去残留的过氧化氢。 近年来，过氧化氢酶开始使用在美容业中。一些面部护理中加入了该 酶和过氧化氢，目的是增加表皮上层的细胞氧量。 植物细胞中的过氧化物酶体参与了光呼吸（利用氧气并生成二氧化碳） 和共生性氮固定（将氮气(N2）解离为活性氮原子）。细胞被病原体 感染时，过氧化氢可以被用作一种有效的抗微生物试剂。 其活性也与粮食品质之间有一定的相关性，是一项衡量谷物品质的 重要指标。
方法比较：
研究认为，化学滴定法重复性差、紧密度 低、操作繁琐、检测线低，不适于大批量 的样品测定。其优点是不需要任何特殊的 仪器，适用性比较广泛。 紫外分光光度法具有重现性好，操作简单、 快速、检测线相对较低得到优点。但是对 于测定底物或产物改变量方面不太准确。
总结：
综上所述，过氧化氢酶活性测定的方法大都基于 过氧化氢酶催化过氧化氢的分解反应：根据反应 生成的氧气的量、反应剩余的过氧化氢的量或根 据反应时的电子的转移及电流的变化等。同时， 影响测定结果的因素很多，如过氧化氢的浓度、 酸度、温度及重金属的含量等；并且各种方法的 准确性和灵敏度也有一定差异。因此，在测定CAT 活性时，应该根据具体组织种类及测量要求选择 适合的测定的方法。
过氧化物酶检测标准操作规程
过氧化物酶（pox）检测标准操作规程1.【目的】为了供骨髓涂片及血液细胞涂片染色检查。
2.【职责】1.实验室工作人员均应熟知并严格遵守本SOP，室负责人监督落实。
2.本SOP的改动，可由任一使用本SOP的工作人员提出，并报经下述人员批准签字：室负责人、科主任。
3.【标本类型及实验前准备】1.标本类型1.要求新鲜的骨髓细胞涂片或血液细胞涂片。
2.若样本采集后不能及时测定，可采用95%乙醇固定2分钟后，可保存数天。
亦可使用某些抗凝血（肝素、EDTA）。
3.样本在未染色前切勿沾有甲醇和氧化剂类试剂，以免细胞内的过氧化物被抑制和破坏。
4.溶血样本不宜使用，因涂片中大量游离血红蛋白易使背景产生难以去除的杂质颗粒。
2.患者准备成人一般取骼后、骼前上棘，其次为胸骨、棘突部位。
2岁以下小儿可穿刺胫骨。
3.容器、添加剂类型骨髓液量不宜过多，不需抗凝，迅速置于载玻片上，必要时可用EDTA2K抗凝。
4仪器设备捷达骨髓成像系统，OLYMPUS显微镜5.实验试剂1.快速染液A （ A液）：曙红2.快速染液B （ B液）：天青3.碘化钾溶液（C液）：碘化钾4.WG溶液（D液）：瑞姬氏染料4.【测定原理】细胞中的过氧化物酶分解过氧化物产生新生态氧，后者与KI （碘化钾）作用产生碘，碘与WG等显色剂中的有效成分结合，形成有色颗粒定位于细胞浆中。
5.【程序性操作步骤】本法采用滴染法，滴染工作液配制（1份滴染工作液为2.4ml）使用器材：一次性塑料试管、微量移量液器、一次性吸嘴、滴管。
操作：取C液2.0ml，D液4ul，混匀，2小时内使用。
染色步骤：1.快速染色（核染色）：干燥的骨髓涂片滴加A液（覆盖标本）后，再滴加B液（A液：B液=1:1至1:2）混匀，染色20-30秒，流水冲洗，甩干或滤纸吸干；2.滴加工作液于涂片上，染色40-60秒后倾去（不用水冲洗），滤纸吸干，镜检。
6.【结果计算与判断】呈阳性反应时，可见胞浆中有红棕色至蓝黑色颗粒。
过氧化物酶活性测定方法
过氧化物酶活性测定方法过氧化物酶活性的测定(比色法)过氧化物酶是植物体内普遍存在的、活性较高的一种酶，它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有密切关系，在植物生长发育过程中，它的活性不断发生变化，因此测量这种酶，可以反映某一时期植物体内代谢的变化。
一、原理在有过氧化氢存在下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶褐色物质，该物质在 470 nm 处有最大吸收，可用分光光度计测量 470 nm 的吸光度变化测定过氧化物酶活性。
二、实验材料、试剂与仪器设备(一)实验材料:马铃薯块茎。
(二)试剂1 ( 100 mmol , L 磷酸缓冲液 pH7.0 (见附录)。
磷酸氢二钠。
磷酸二氢钠。
2 (反应混合液: 100 mmol , L 磷酸缓冲液( pH7.0 ) 50 mL 于烧杯中，加入愈创木酚((邻甲氧基苯酚) 28 μl ，于磁力搅拌器上加热搅拌，直至愈创木酚溶解，待溶液冷却后，加入 30 % 过氧化氢19 μl ，混合均匀，保存于冰箱中。
(三)仪器设备分光光度计，研钵，恒温水浴锅， 100 mL 容量瓶，吸管，离心机。
三、实验步骤1 (称取植物材料 1 g ，剪碎，放入研钵中，加适量的磷酸缓冲液研磨成匀浆，以 4000 r , min 离心 10 min ，上清液转入 100 mL 容量瓶中，残渣再用 5 mL 磷酸缓冲液提取一次，上清液并入容量瓶中，定容至刻度，贮于低温下备用。
2 (取光径 1 cm 比色杯 2 只，于 1 只中加入反应混合液3 mL 和磷酸缓冲液 1mL ，作为对照，另 1 只中加入反应混合液 3 mL 和上述酶液 1mL (如酶活性过高可稀释之)，立即开启秒表记录时间，于分光光度计上测量波长 470 nm 下吸光度值，每隔 1min 读数一次。
四、结果计算以每分钟吸光度变化值表示酶活性大小，即以ΔA 470 /[min ? g (鲜重) ] 表示之。
也可以用每 min 内 A 470 变化 0.01 为 1 个过氧化物酶活性单位( u )表示。
谷胱甘肽过氧化物酶检测方法
谷胱甘肽过氧化物酶检测方法
谷胱甘肽过氧化物酶检测方法是一种用于测定生物体内谷胱甘
肽过氧化物酶（GPx）活性的方法。
本方法基于GPx的催化作用，将
过氧化氢还原成水，并在反应过程中消耗还原型谷胱甘肽（GSH），使其转变为氧化型谷胱甘肽（GSSG）。
测定反应前后GSH和GSSG的比例变化，即可计算出样品中GPx的活性。
常用的谷胱甘肽过氧化物酶检测方法包括紫外-可见分光光度法、荧光法和色谱法等。
其中，紫外-可见分光光度法是常用的定量方法，其原理是利用GPx催化剂将过氧化氢还原为水，测定反应前后NADPH 浓度的变化。
荧光法利用GSH与荧光探针的反应性，在荧光信号变化的同时测定GPx活性。
色谱法则是在高效液相色谱仪上使用GSH和GSSG标准品，通过检测样品中这两种化合物的浓度，计算出GPx活性。
总体而言，谷胱甘肽过氧化物酶检测方法是一种有效的检测生物体内GPx活性的方法，适用于疾病诊断和治疗效果评估等领域。
- 1 -。
过氧化物酶的检测方法
POD检测方法
(Horseradish Peroxidase)
1原理
Purpurogallin的产生可以通过420nm的光吸收进行检测。
2试剂：
A.5.0%焦酚溶液
B.0.5% 过氧化氢（H2O2）溶液
C 酶稀释液：100mM PB 缓冲液, pH6.0
3 操作规程：
3.1仪器参数设定
检测方法：时间扫描
测量波长：420nm 系数/因子：2.5 测量温度：20±0.5℃
3.2 样品准备
若待测样品为固体，可以按10mg 样品/1000ul 超纯水比例溶解。
溶解后于2-8度放置30min。
3.3 检测方法
3.3.1在石英比色皿中加入525ul水，80ul试剂A, 40ul试剂B,80ul 试剂C于20度孵育
2min。
3.3.2加入25 ul 样品后, 温和混匀后开始测定。
3.3.3 测定结束后，每隔20秒计算△OD，取△OD最大值
3.3.4 活性值（U/ml）范围为0.3-0.7U/ml，若超出范围，待测样品需经试剂C稀释后再次
进行检测。
3.3.5测定样品前需检测空白反应值，即其他操作不变，用25ulC代替样品，测定OD blank。
3.3.6计算公式
活性（U/ml）。
愈创木酚法测定过氧化物酶活性（准确,无误）
愈创木酚法测定过氧化物酶活性一、实验目的过氧化物酶它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有密切关系，在植物生长发育过程中，它的活性可以反映某一时期植物体内代谢的变化。
通过本实验了解过氧化物酶的作用，掌握愈创木酚法测定过氧化物酶。
二、实验原理在过氧化物酶（POD）催化下，H2O2将愈创木酚氧化成茶褐色产物。
此产物在470 nm处有最大光吸收值，故可通过测470 nm 下的吸光度变化测定过氧化物酶的活性。
三、实验材料马铃薯块茎。
四、设备与试剂分光光度计，离心机，研钵，容量瓶，量筒，试管，吸管。
0.05 mol·L的磷酸缓冲液（pH 5.5）；0.05 mol·L愈创木酚溶液；2％H2O2；20％三氯乙酸五、实验步骤（一）酶液的制备取1.0～5.0 g 洗净去皮的马铃薯块茎，切碎，放入研钵中，加适量的磷酸缓冲液研磨成匀浆。
将匀浆液全部转入离心管中，于3000×g离心10 min，上清液转入25 mL容量瓶中。
沉淀用5 mL 磷酸缓冲液再提取两次，上清液并入容量瓶中，定容至刻度，低温下保存备用。
（二）过氧化物酶活性测定酶活性测定的反应体系：依次加入2.9 mL 0.05 mol·L-1磷酸缓冲液；1.0 mL 2％H2O2；1.0 mL 0.05 mol·L-1愈创木酚和0.1 mL 酶液。
用加热煮沸5 min 的酶液为对照，反应体系加入酶液后，立即于34℃水浴中保温3 min，然后迅速稀释1 倍，470 nm 波长下比色，每隔1 min 记录1次吸光度A470，共记录5次，然后以每分钟内A470变化0.01 为1 个酶活性单位（U）。
六、实验结果以每分钟内A470变化0.01 为1 个过氧化物酶活性单位（U）。
△A470 ×VT过氧化物酶活性(U·g-1·min-1)=──────W×VS×0.01×t式中：△A470——反应时间内吸光度的变化；W——马铃薯鲜重（g）；t——反应时间（min）；VT——提取酶液总体积（mL）；VS——测定时取用酶液体积（mL）。
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POD检测方法
(Horseradish Peroxidase)
1原理
Purpurogallin的产生可以通过420nm的光吸收进行检测。
2试剂：
A.5.0%焦酚溶液
B.0.5% 过氧化氢（H2O2）溶液
C 酶稀释液：100mM PB 缓冲液, pH6.0
3 操作规程：
3.1仪器参数设定
检测方法：时间扫描
测量波长：420nm 系数/因子：2.5 测量温度：20±0.5℃
3.2 样品准备
若待测样品为固体，可以按10mg 样品/1000ul 超纯水比例溶解。
溶解后于2-8度放置30min。
3.3 检测方法
3.3.1在石英比色皿中加入525ul水，80ul试剂A, 40ul试剂B,80ul 试剂C于20度孵育
2min。
3.3.2加入25 ul 样品后, 温和混匀后开始测定。
3.3.3 测定结束后，每隔20秒计算△OD，取△OD最大值
3.3.4 活性值（U/ml）范围为0.3-0.7U/ml，若超出范围，待测样品需经试剂C稀释后再次
进行检测。
3.3.5测定样品前需检测空白反应值，即其他操作不变，用25ulC代替样品，测定OD blank。
3.3.6计算公式
活性（U/ml）。