毕赤酵母的原生质体和分离出的丝状真菌的细胞核融合[外文翻译]
毕赤酵母实验操作技巧介绍材料
颍上新城质差室分分析案例摘要：随着VOLTE百日大会战的开启，我部对阜阳质差室分进行摸排分析，目前质差室分原因主要为馈线问题、室分泄漏、宏站与室分切换等，针对不同原因，采用工程维护、RF及工参优化等手段进行改善。
关键字：馈线问题、室分泄漏、工程维护、RF及工参优化【故障现象】：3月上旬，发现该XY-FY-颍上-颍上新城-HFTA-436961-3小区室分MR 覆盖率仅为90.1%，该室分覆盖东西两栋30层高层，其中1-4F为商场部分，未做室分覆盖，采样点较少。
【原因分析】：此类室分质差主要从以下几点分析原因：（1）是否存在告警及馈线驻波告警；（2）室分泄漏；（3）室内外切换重选参数是否合理；（4）馈线故障。
1.原因排查：（1）对该小区进行告警排查及驻波测试，无异常，驻波均值正常值范围内,如下图所示：（2）针对是否存在室内泄漏，对该小区周边楼宇进行测试，周边楼宇主要占用的信号为1.8G宏站FY-颍上-鑫都华庭-HFTA-437970-61、FY-颍上-颍上荣禾绿园-HFMA-436418-55。
XY-FY-颍上-颍上新城-HFTA-436961-3主要为平层覆盖，为发现室分泄漏。
（3）对颍上新城进行室内摸排，测试过程中，主要占用为室分信号，切换无异常，该楼宇室分覆盖如下所示：根据设计图纸及网管资料，该室分系统主要覆盖东西两单元30F及地下车库，现场摸排中发现，RSRP均值为 -75dbm，SINR均值为28dbm，室分整体覆盖良好，其中东西单元1-4F电梯室分覆盖效果较差，平均RSRP均值为-108dbm，SINR均值为2dbm，西单元的10-11F主要为宏站信号，该层怀疑为室分馈线故障导致，如下所示：并且根据设计图纸，该楼宇存在地下停车场，对该区域进行测试，发现，由于纠纷问题，原覆盖新城1-4F的商场部分的XY-FY-颍上-御水兰庭-HFTA-437017-2室分，未能覆盖该区域，该设备位于负一层电梯口附近的弱电井，设备AB口为临时接的蘑菇头，该设备只能覆盖电梯口至地下停车场之间走廊的部分区域，剩余区域则为弱覆盖区域，主要占用信号为为地下停车XY-FY-颍上-颍上新城-HFTA-436961-3室分覆盖，平均RSRP均值为-105dbm，SINR均值为6dbm。
毕赤酵母(Pichia pastoris)分泌表达牛白细胞介素2
毕赤酵母(Pichia pastoris)分泌表达牛白细胞介素2孙红立;陈芳;于瑞嵩;刘惠莉;曹祥荣;李震【期刊名称】《中国兽医学报》【年(卷),期】2004(24)3【摘要】利用含有强启动子 PAOX1 和α-因子信号肽序列的巴斯德毕赤酵母载体p PICZαA,构建出含牛白细胞介素 2(Bo IL - 2 )基因的重组质粒 Bo IL 2 - p PICZαA。
线性化的重组表达载体转化到巴斯德毕赤酵母 X- 33及 KM71H中 ,筛选Zeocin高抗性酵母菌株 ,甲醇诱导目的蛋白表达。
经 SDS- PAGE和 Western blot检测表明 ,Bo IL- 2以融合蛋白形式在胞内表达 ,但没能分泌到胞外。
通过 Bo IL- 2在巴斯德毕赤酵母中的表达 ,重点讨论了信号肽。
【总页数】4页(P261-263)【关键词】毕赤酵母;分泌表达;牛白细胞介素2;BolL-2;信号肽;基因【作者】孙红立;陈芳;于瑞嵩;刘惠莉;曹祥荣;李震【作者单位】南京师范大学生命科学学院;上海市农业科学院畜牧兽医研究所【正文语种】中文【中图分类】Q78【相关文献】1.巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)高效异源表达脂肪酶研究进展 [J], 李杨;蔡海莺;赵敏洁;李阳;冯凤琴2.海洋球石藻病毒（Coccolithovirus）硫氧还蛋白（Trx）在毕赤酵母（Pichiapastoris）中的表达及其活性分析 [J], 蔡艺钦;张稚兰;罗邦彬;刘静雯3.人清道夫受体AII胞外部分在毕赤酵母(Pichia pastoris)中的分泌表达 [J], 刘明;洪斌;巫晔翔;王丽非;司书毅;李元4.猪白细胞介素-6在巴斯德毕氏酵母(Pichia pastoris)中的分泌表达 [J], 严琳;顾贫;陈焕春5.米根霉(Rhizopus oryzae)脂肪酶基因ProROL在毕赤酵母(Pichia pastoris)中的高效表达 [J], 郭勇亮;喻晓蔚;徐岩因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
毕赤酵母表达载体及宿主菌介绍
毕赤酵母表达载体及宿主菌介绍由于甲醇营养型酵母菌体内无天然质粒，所以携带外源基因的重组体必须整合于染色体中才能实现外源基因的表达。
整合表达的优点在于保持外源基因稳定性并可产生多拷贝基因。
典型的毕赤氏酵母表达载体含有醇氧化酶基因的调控序列，主要的结构包括：5’AOX1启动子片段、多克隆位点(MCS)、转录终止和polyA形成基因序列(TT)、筛选标记(His4或Zeocin)、3’AOX1基因片段，作为一个能在大肠杆菌中繁殖扩增的穿梭质粒，它还有部分pBR322质粒或COLE1序列。
如果是分泌型表达载体，在多克隆位点的前面，外源基因的5’端和启动子的3’端之间插人了分泌作用的信号肽序列。
在这个分泌信号的引导下，外源蛋白在内质网和高尔基体中经修饰和加工后能够由胞内转移至胞外，将成熟的蛋白质分泌到细胞外。
为方便于操作，通常表达载体都是穿梭质粒。
表达载体与酵母染色体有单交换和双交换整合2种方式，单交换整合时，或插入A0X1位点，或插入his位点。
有文献报道，以his4作为整合位点时，染色体突变株与表达盒间存在基因转换，偶而可使Laz表达盒丢失，故AOX1位点更好。
一般认为，单交换转化效率比双交换效率高，且易得到多拷贝整合，其发生机制可能是重复单交换引起的。
携带外源基因的表达载体可通过电穿孔、原生质体生成法或全细胞法转化酵母细胞。
甲醇酵母转化和大肠埃希氏菌转化不同之处是前者较为复杂。
对于大肠埃希氏菌而言，只要把重组表达载体导入细胞体内即可。
因其载体上携带有自身复制原点，可随染色体复制而复制，重组表达载体能够稳定存在。
在甲醇酵母系统中，所有的表达载体均不含酵母复制原点。
这就是说，导入酵母体内的重组表达载体只有和酵母染色体上的同源区发生重组，整合到染色体上，外源基因才能够稳定存在，外源蛋白才能得到稳定表达，这种整合的转化子一旦形成就非常稳定。
如果转化后的重组表达载体未能整合到染色体上，而是以游离的附加体形式存在，这种转化子就不稳定，重组表达载体极易丢失。
重组人Hepassocin在毕赤酵母中的分泌型表达、纯化与活性鉴定
2.1 材 料 ............................................................................................................................................. 11
摘 要......................................................................................................................................................3
2.1.1 菌株和质粒 .............................................................................................................................. 11 2.1.2 引物 .......................................................................................................................................... 11 2.1.3 工具酶及相关试剂 .................................................................................................................. 11 2.1.4 主要仪器设备 .......................................................................................................................... 11 2.1.5 层析柱及填料 ..........................................................................................................................12 2.1.6 常用试剂的配制 ......................................................................................................................13
毕赤酵母产木聚糖酶实验方案
毕赤酵母简介甲醇营养型毕赤酵母(Pichia pastoris) 表达系统是80年代初被开发和研制的一种新型酵母表达系统。
40年前，Ogata等人首次发现有些酵母能够利用甲醇作为唯一的碳源和能源进行生长。
随后，甲醇营养酵母作为潜在的单细胞蛋白(single cell protein, SCP) 来源立即引起广泛关注，最初将其作为高蛋白的动物饲料在市场上销售。
在20世纪70年代，Phillips Petroleum公司开发出毕赤酵母利用甲醇生长的培养基、发酵操作手册和高密度连续培养生产工艺[2]。
70年代的石油危机导致了甲烷价格的急剧上升，与此同时，动物饲料蛋白的主要替代源——大豆价格的下降，导致利用甲醇生产SCP在经济上已不再合适。
在以后的10年中，Phillips Petroleum公司与SIBIA公司合作开发利用毕赤酵母作为生物体表达外源蛋白的研究，研究人员分离了醇氧化酶(alcohol oxidase, AOX) 的基因和启动子，构建了表达载体和菌株，开发了毕赤酵母基因操作相关技术。
成熟的SCP发酵方法的开发，加上醇氧化酶强启动子的可调控表达特性，极大地影响着外源蛋白在毕赤酵母中的高水平表达。
1993年，Phillips Petroleum公司委托Invitrogen公司代理毕赤酵母表达系统产品。
毕赤酵母能在以甲醇为唯一碳源的培养基中快速生长，其中醇氧化酶AOX ——甲醇代谢途径的关键酶可达细胞可溶性蛋白的30％。
而在葡萄糖、甘油或乙醇作为碳源的培养细胞中则检测不到AOX。
AOX的合成是在转录水平调控的。
其基因启动子具有明显的调控功能，可用于调控外源基因的表达。
此调控作用是由一般碳源抑制/解抑制及碳源特殊诱导又重机制控制的。
外源基因在甲醇以外的碳源中处于非表达状态，而在培养液中加入甲醇后，外源基因即被诱导表达。
巴斯德毕赤酵母中存在着一种称为微体的细胞器，其中大量合成过氧化物酶，因此也称为过氧化物酶体。
甲醇毕赤酵母Pichia+methanolica的高效电转化方法
是该菌株在进行外源基因表达时转化效率很 低， 文中针对 . 采用电转 (& $ / 0 的这一缺点， 化的方式， 探索了转化条件， 旨在为转基因酵母 表达系统的研究提供实验基础。 / 材料和方法 ! " ! 材 料
/ 3 / 3 / 菌种和质粒 异源表达的宿主甲醇 毕 赤 酵 母 . (& $ / 0
〔 〕 5 化效 率 的 提 高 。实 验 中 所 构 建 的 4 C 3 > ?
因此采用 ! ( 7 . D为整合型质粒， " # ! 酶切线 -
研究报告
性化。酶切物用 ! " # $ 柱式 % " & 回收试剂盒 进行纯化。
图: 酵母细胞的不同生长状态对转化率的影响
! " $ 感受态细胞冻存方式和冻存时间对转化 率的影响 用上述的电转化参数， 在最优 , 值条 -2 6 6 件下制备感受态细胞， 分装后一部分经液氮速 冻后于 CD 一部分直接放入 CD 6 ; 保存， 6 ;保
8） （& 为@ 含有黄孢原毛 > ? A B C D E ? A 公司产品； 1 平革 菌 木 质 素 过 氧 化 物 酶 基 因 （, ） 的质粒 ’
( ) * & + , ’ ’为本实验室构建。 / 3 / 3 # 酶和试剂 限制 性 内 切 酶、 4 " $ % & 聚 合 酶、 F % @ G 8 柱式 $ 琼脂糖， 购自上海生工 % & 回收试剂盒、 生物工程技术服务有限公司； 其他化学试剂均 为国产或进口分析纯。 / 3 / 3 ! 培养基和溶液 H . & $ 培养基： / I酵母粉， # I蛋白胨， # I 葡萄糖， " 3 " / I腺嘌呤。 8 6 生物 ， ($ 培养基： / 3 ! ; IH % J ;K/ " I 素， # I葡萄糖。 ， H % J 培养基： / 3 ! ; IH % J # I葡萄糖。 J ($ H 培 养 基： / I 酵 母 粉， # I 蛋 白 胨， ／ # I 葡 萄 糖，/ " " 2 2 E L , M . 9 ! ; 缓 冲 液 8 6 （ ） ， ， N 0 3 " / 3 ! ; IH % J ; K / " I生物素。 ’
6毕赤酵母介绍
毕赤酵母及级胰岛素——优思灵巴斯德毕赤酵母(P／ch／a pastor／s)表达系统是目前最优秀、应用最广泛的外源基因表达系统之一，它不但克服了大肠杆菌表达系统不能表达结构复杂的蛋白质、表达的蛋白多形成不溶性包涵体、背景蛋白多、表达产量低等缺陷，弥补了哺乳类细胞、昆虫细胞表达系统操作复杂、表达水平低、产业化生产造价昂贵的不足，还具有其他酵母表达系统无法比拟的优越之处。
酵母作为一种最简单的单细胞真核生物, 兼有原核生物和真核生物的某些优点。
毕赤酵母生活史与酿酒酵母十分相似。
这使得毕赤酵母的发酵工程部分可与酿酒酵母相同, 从而节省了重新购臵设备和进行新技术探索的巨额花费, 这是用其他方法进行大规模商品化的外源蛋白生产所不能比拟的优势。
现将毕赤酵母表达系统优点概括如下:①毕赤酵母更接近高等真核细胞, 不含内毒素和其他有害物质, 使用安全;②同酿酒酵母一样, 繁殖速度快, 对培养条件要求低, 培养基价廉, 能进行高密度培养, 且能耐受较高的液体静压, 便于工业化生产;②该系统的载体能与核基因组进行整合, 因此构建的菌株较稳定, 一般不会在传代过程中出现丢失现象;③在毕赤酵母中表达的蛋白既可存在于胞内, 又可在分泌信号作用下将蛋白分泌至胞外;⑤具有强有力的易控制的乙醇氧化酶基因(AOX1)或磷酸甘油酸脱氢酶( GAP) 基因启动子作为外源基因启动子, 可对外源蛋白的表达进行严格调控;⑥作为真核表达系统, 可对表达的外源蛋白进行翻译后的加工和修饰, 即二硫键的形成、脂肪的酰化、蛋白磷酸化、折叠、信号序列加工、N糖基化、O糖基化, 从而使目的蛋白具有所应有的生物学活性;⑦外源蛋白表达量高, 同时自身分泌的背景蛋白少, 表达产物易于纯化;⑧和酿酒酵母相比, 毕赤酵母中加到翻译蛋白上的糖链长度平均每条侧链为8～14个甘露糖残基, 比酿酒酵母每条侧链平均50～150个甘露糖残基短得多。
毕赤酵母极少出现过渡糖基化, 可避免外源蛋白生产过强的免疫原性或因糖链过长干扰外源蛋白正确折叠而影响其功能, 而且糖链中不含具有致敏作用的α21, 32甘露糖, 使其使用更加安全。
毕赤酵母表达体系中重组蛋白的分离纯化
巴 斯 德 毕 赤 酵 母 （Pichia pastoris）是 在 酿 酒 酵 母 表达体系的基础上， 用其他的酵母菌株构建的、可 高效稳定表达外源基因的新表达系统，即甲醇营养
型 酵 母 （Methy-lotrophicyeast）表 达 系 统 [1]。 作 为 第 2 代酵母表达系统，它不仅克服了大肠杆菌表达系统 不能表达结构复杂的蛋白质、表达的蛋白不能分泌 到细胞外、背景蛋白多、表达水平低等缺点，并且弥 补了哺乳类细胞、 昆虫细胞表达系统操作复杂、表 达水平低、产业化生产造价昂贵的不足，此外，还具 有 其 他 酵 母 表 达 系 统 无 法 比 拟 的 优 越 之 处[2]。
亲 和 层 析 （Affinity Chromatography，AFC）是 利 用
2009 年第 3 期
高炳淼等：毕赤酵母表达体系中重组蛋白的分离纯化
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偶联亲和配基的亲和吸附介质为固定相亲和吸附 目标产物，使目标产物得到分离纯化的方法。 它具 有很高的选择和分离性能以及较大的载量，只需要 一步处理即可使某待分离的生物大分子从复杂的 混合物中分离出来，达到千倍以上的纯化，并保持 较 高 的 活 性[15]，是 分 离 纯 化 以 及 分 析 生 物 大 分 子 尤 其 是 蛋 白 质 的 有 力 工 具 。 自 从 1967 年 Axen 等[16]用 溴化氰活化多糖凝胶偶联肽和蛋白质的方法成功 制 备 了 固 定 化 酶 ，此 后 亲 和 层 析 在 20 世 纪 70 年 代 有了迅速的发展，目前已得到广泛应用。
2 主要纯化的方法
重组蛋白的分离纯化与传统方式相似，也是利 用其物理和化学性质的差异，即分子的大小、形状、 溶解度、等电点、亲疏水性以及与其它分子的亲和 性 等 性 质 建 立 起 来 的 （表 1）[7]。 从 表 1 可 看 出 ，高 纯 度的蛋白质主要是依靠色谱法技术得到的。 由于重 组蛋白在组织和细胞中仍以复杂混合物的形式存 在，因此到目前为止还没有一个单独或一整套现成 的方法把任何一种蛋白质从复杂的混合物中分离 出来，而只能依据目标蛋白的物理化学性质摸索一 套综合的分离程序，以获得较高纯度的蛋白产品。
毕赤酵母翻译
毕⾚酵母翻译Glycoengineered(糖基化⼯程) 毕⾚ pastoris(毕⾚酵母) 中表达的重组单克隆抗体的纯化⼯艺开发摘要⼀个强健的和可扩展的净化过程被开发快速从 glycoengineered 毕⾚酵母发酵⽣成抗体的纯度⾼、数量充⾜。
蛋⽩ A 亲和层析⽤于捕获从发酵液抗体。
PH 梯度洗脱已应⽤到要防⽌抗体沉淀在低 pH 的蛋⽩ A 列。
从蛋⽩抗体⾊谱法所载⼀些产品的相关杂质，被劈重链、重链和轻链的misassembling。
它也有⼀些处理相关的杂质，包括蛋⽩ A 残留、 endotoxin(内毒素)、宿主细胞 DNA 和蛋⽩质。
Ph 值为 4.5-6.0 的最优氯化钠渐变阳离⼦交换⾊谱法有效去除这些产品和过程相关的杂质。
从 glycoengineered P.酵母抗体是其 heterotetramer 折叠、物理稳定性和约束⼒的亲和性的商业同⾏相媲美。
介绍单克隆抗体（Mab）正迅速成为关键产品的⽣物医药产业。
⼤多数商业治疗性抗体是原封 IgG 分⼦与 IgG1、 IgG2 正在共同的⼦类。
这些 IgGs 由调解抗原和效应器函数之间的联系，在免疫过程中发挥中⼼作⽤。
对⽬标细胞的特异性抗原的 igg 抗体可变域的绑定将抗体依赖的细胞毒作⽤ (ADCC) 及补体依赖性细胞毒性 (CDC) 定向杀害的⽬标单元格。
ADCC 触发由交联体 Fc 域的 IgG 抗体（Fc(Rs)，尤其是 Fc (RI 和Fc (制证机对免疫效应细胞。
可能调解 ADCC 效应细胞包括⾃然杀⼿细胞、巨噬细胞和嗜中性粒细胞。
疾病预防控制中⼼是由补充组件 C1q 绑定到 IgG，触发蛋⽩⽔解的级联，以激活补充 fc 功能区启动。
IgG 型抗体有两重链和两条轻链由分⼦内的⼆硫键形成 heterotetramer 在⼀起。
重链是通过共价键固定在天冬酰胺 297 (Asn-297) 低聚糖的糖基化。
⼈免疫球蛋⽩的主要N-聚糖复杂 biantennary (⼆分⽀的) 类型，有 '核⼼' heptasaccharide(七庚糖)，GlcNac2Man3GlcNac2，被称为 G0 在我们的⼯作和⽂学。
毕赤酵母表达操作手册(精译版)
毕赤酵母多拷贝表达载体试剂盒用于在含多拷贝基因的毕赤酵母菌中表达并分离重组蛋白综述：基本特征：作为真核生物，毕赤酵母具有高等真核表达系统的许多优点：如蛋白加工、折叠、翻译后修饰等。
不仅如此，操作时与E.coli及酿酒酵母同样简单。
它比杆状病毒或哺乳动物组织培养等其它真核表达系统更快捷、简单、廉价，且表达水平更高。
同为酵母，毕赤酵母具有与酿酒酵母相似的分子及遗传操作优点，且它的外源蛋白表达水平是后者的十倍以至百倍。
这些使得毕赤酵母成为非常有用的蛋白表达系统。
与酿酒酵母相似技术：许多技术可以通用：互补转化基因置换基因破坏另外，在酿酒酵母中应用的术语也可用于毕赤酵母。
例如：HIS4基因都编码组氨酸脱氢酶；两者中基因产物有交叉互补；酿酒酵母中的一些野生型基因与毕赤酵母中的突变基因相互补，如HIS4、LEU2、ARG4、TR11、URA3等基因在毕赤酵母中都有各自相互补的突变基因。
毕赤酵母是甲醇营养型酵母：毕赤酵母是甲醇营养型酵母，可利用甲醇作为其唯一碳源。
甲醇代谢的第一步是：醇氧化酶利用氧分子将甲醇氧化为甲醛，还有过氧化氢。
为避免过氧化氢的毒性，甲醛代谢主要在一个特殊的细胞器－过氧化物酶体－里进行，使得有毒的副产物远离细胞其余组分。
由于醇氧化酶与O2的结合率较低，因而毕赤酵母代偿性地产生大量的酶。
而调控产生醇过氧化物酶的启动子也正是驱动外源基因在毕赤酵母中表达的启动子。
两种醇氧化酶蛋白：毕赤酵母中有两个基因编码醇氧化酶－AOX1及AOX2。
细胞中大多数的醇氧化酶是AOX1基因产物。
甲醇可紧密调节、诱导AOX1基因的高水平表达，较典型的是占可溶性蛋白的30%以上。
AOX1基因已被分离，含AOX1启动子的质粒可用来促进编码外源蛋白的目的基因的表达。
AOX2基因与AOX1基因有97%的同源性，但在甲醇中带AOX2基因的菌株比带AOX1基因菌株慢得多，通过这种甲醇利用缓慢表型可分离Muts菌株。
表达：AOX1基因的表达在转录水平受调控。
融合基因gad-il-4的克隆及其在毕赤酵母中的表达
融合基因gad-il-4的克隆及其在毕赤酵母中的表达摘要：通过重叠延伸PCR（Gene splicing by overlap extension，简称SOE PCR）技术构建融合基因gad-il-4，然后将其克隆到pMD18-T载体中，进行测序并命名为pMD-GAD-IL-4。
构建重组酵母表达载体pPIC9K-GAD-IL-4，将重组质粒pPIC9K-GAD-IL-4经内切酶Sal I线性化后，通过电转化法转化毕赤酵母菌GS115，以0.5%浓度的甲醇对酵母工程菌进行诱导表达。
利用G418抗性筛选阳性克隆，进行PCR鉴定，结果表明融合基因gad-il-4整合到毕赤酵母基因组中。
通过SDS-PAGE检测，发现在酵母表达上清中出现了与预期大小相符的蛋白条带，表明融合基因gad-il-4在酵母细胞中实现正确表达。
为下一步利用重组融合蛋白GAD-IL-4奠定了良好的实验基础。
关键词：谷氨酸脱羧酶（GAD65）；白细胞介素4（IL-4）；融合基因；克隆；毕赤酵母随着社会经济的发展和人类生活水平的不断提高，世界糖尿病患者的数量呈不断上升趋势，中国的糖尿病现状已经非常严峻。
据报道中国糖尿病患者达到9240万人，发病率高达9.7%[1]。
研究报道1型糖尿病其发病机制可能和细胞免疫有关，GAD65很有可能是始动靶抗原，能增强患者的免疫耐受，有效降低胰岛 细胞损伤。
所以通过抑制GAD65所引起的特异性自身免疫反应，对预防和治疗1型糖尿病具有积极作用。
白细胞介素4（Interleukin 4，IL-4）是白细胞介素家族中最主要的成员之一。
它主要由Th2细胞亚群产生，是关键的免疫调节因子，能够影响Th1/Th2细胞的平衡，与某些过敏性疾病、传染病和自身免疫性疾病密切相关。
是Th1/Th2亚群失衡而导致多种疾病的原因之一。
Th2细胞因子IL-4能够预防和延缓1型糖尿病的发生和发展。
把IL-4作为免疫佐剂与GAD同时使用，可以增加其预防1型糖尿病的疗效和安全性[2,3]。
Hepcidin的基因克隆及其在毕赤酵母中的分泌表达
摘 要 根据已知 hepcidin 氨基酸序列, 参照 毕赤氏巴 斯德酵母( Pichia pastoris) 密码 子偏好性, 设计 合成了 hepcidin 目的基 因。所合成的 hepcidin 基因全长 96bp, 其 5c 端引入 KEX2 基因产物( Kex 2) 的特异性识别位点序列, 以保证表达产物具有天然 N 端。通过基因重组的方法将 hepcidin 基因克隆到 pPicZAA 载体中, 构建了分泌型重组酵母表达载 体 pPICZAA-Hepc, 经 电转至毕 赤酵母 GS115 中表达。使用浓度高达 1500 LgPmL 的 Zeocin 筛 选得到高拷贝插入 GS115 菌株, 经摇瓶发 酵和甲醇诱导, 上清液 有明显的 hepcidin 表达, 表达量达到 100 mgPL。初步抗菌特性研究表明, 该表达产物对 枯草芽孢杆 菌有明显的 抑菌作用, 而对 大肠杆菌抑菌效果不明显。
23 卷 3 期 2007 年 5 月
生物工程学报 Chinese J ournal of Biotechnology
Vol. 23 No. 3 May 2007
Hepcidin 的基因克隆及其在毕赤酵母中的分泌表达
Cloning and Secretion Expression of Hepcidin idin, Pichia pastoris, secretion expression, antibacterial activity
Hepcidin 是一种由肝脏特异表达的富含半胱氨 酸的新型抗菌肽。2000 年, Krause 等首先从人血液 中分离纯化 得到了由 25 个氨基酸 组成的 hepcidin 小肽[ 1] 。2001 年, Park 等在寻找人尿液中阳离子抗 菌肽的研究过程中也分离到这一小肽[ 2] 。与许多富
巴斯德毕赤酵母_Pichiapa_省略_在外源蛋白生产中的优势与应用前景_马兴元
巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris )表达系统及其在外源蛋白生产中的优势与应用前景马兴元1,2,谭建华1,朱 平1,孙曼霁3 (1.解放军军需大学军事兽医研究所,吉林长春130062;2.沈阳农业大学畜牧兽医学院,辽宁沈阳110161;3.军事医学科学院毒物药物研究所,北京100012)关键词:毕赤酵母;表达系统;外源蛋白;应用中图分类号:Q 78 文献标识码:A 文章编号:1005-4545(2003)01-0098-04 收稿日期:2002-06-19 基金项目:军队医药卫生重点课题资助项目(01Z023) 作者简介:马兴元(1969-),男,讲师,博士。
表达系统是基因工程及生物制药研究和应用的重要内容,也是生命科学研究领域的热点。
长期以来,大肠杆菌一直被用作表达外源基因的宿主菌,并成功地表达了多种外源蛋白[1],但是它不能表达结构复杂的蛋白质,且分泌型表达产量较低。
而哺乳类细胞、昆虫细胞表达系统虽然能够表达结构复杂的真核细胞蛋白成分,但操作复杂,表达水平低,产业化生产造价昂贵,不易普遍推广使用[2]。
酵母是单细胞低等真核生物,它既具有原核生物易于培养、繁殖快、便于基因工程操作和高密度发酵等特性,同时又具有适于真核生物基因产物正确折叠的细胞内环境和糖链加工系统,还能分泌外源蛋白到培养液中,利于纯化[3]。
因此,最近10多年来,酵母被认为是一个很有前途的真核表达系统而受到广泛的关注。
由于发酵和酿造工业的发展,人们对酿酒酵母(S .cere -v isiae )的遗传背景和生物学特性研究得比较透彻,且其表达的安全性易被接受。
因此,酿酒酵母首先被用来作为外源基因的表达宿主菌,然而其表达重组蛋白有一定的局限性:(1)产量通常较低;(2)表达质粒易于丢失,外源整合基因不稳定;(3)缺乏强有力的受严格调控的启动子;(4)外源蛋白过度糖基化作用而使其抗原性明显增强,不适于治疗用途;(5)分泌效率差,特别是相对分子质量大于30000的外源蛋白几乎不分泌,使下游纯化复杂化;(6)不适于高密度发酵,难于产业化生产[4]。
毕赤酵母_Pichiapastoris_分泌表达牛白细胞介素2
毕赤酵母(P ich ia p astor is )分泌表达牛白细胞介素2孙红立1,3,陈 芳1,3,于瑞嵩2,3,刘惠莉2,3,曹祥荣1,李 震2,33 (11南京师范大学生命科学学院,江苏南京210097; 21上海市农业科学院畜牧兽医研究所,上海201106;31上海市农业遗传育种重点实验室,上海201106;)摘要:利用含有强启动子P AOX1和Α2因子信号肽序列的巴斯德毕赤酵母载体pP I CZ ΑA ,构建出含牛白细胞介素2(Bo I L 22)基因的重组质粒Bo I L 22pP I CZ ΑA 。
线性化的重组表达载体转化到巴斯德毕赤酵母X 233及K M 71H 中,筛选Zeocin 高抗性酵母菌株,甲醇诱导目的蛋白表达。
经SD S 2PA GE 和W estern b lo t 检测表明,Bo I L 22以融合蛋白形式在胞内表达,但没能分泌到胞外。
通过Bo I L 22在巴斯德毕赤酵母中的表达,重点讨论了信号肽、基因的偏爱性等对外源基因分泌表达的影响。
关键词:牛白细胞介素2(Bo I L 22);毕赤酵母(P ich ia p astoris );分泌表达中图分类号:Q 78 文献标识码:A 文章编号:100524545(2004)0320261203 收稿日期:2003208219 基金项目:上海市科技兴农重点攻关项目(科农攻字2001第327号) 作者简介:孙红立(19792),男,硕士。
3通讯作者,T el :021*********;021*********;E 2m ail :zhenli 60@public 3.sta .net .cn 白细胞介素2(I L 22)是一种具有广泛生物活性的细胞因子,它能够有效地提高机体的免疫功能。
目前已证实,牛白细胞介素2(Bo I L 22)在牛疱疹病毒疫苗免疫中具有免疫佐剂的作用[1,2];在牛乳腺炎的预防与治疗中也具有很好的作用[3]。
巴斯德毕赤酵母表达系统
外源蛋白的引入表达
菌株类型
Mut表型与甲醇利用率
Mut 5’AOX基因 3’AOX基因 表型 存在 存在 正表型 缓慢型
Mut+ 存在 Muts 缺失
Mut- 缺失
缺失
负型
选择过程
HIS4缺陷培养基 G418酵母培养基
导入质粒
低
高
G418：是一种氨基糖苷类抗生素，Kanamycin抗性 基因能对抗G418对酵母的毒性
结构特点
一、单细胞微生物
1、兼性厌氧菌，易于进行遗传操作和培养 2、具有真核生物的转录后调控机制，如蛋白酶加工、 折叠、二硫键的形成和糖基化，可以获得高产量 的蛋白
二、微体（也称过氧化物酶体）
1、 合成的蛋白质贮存于微体中，可免受蛋白酶的降
解，亦不会对细胞产生毒害
2、在微体中，有大量过氧化物酶合成，甲醇代谢的 第一步就是在其中进行的，这样可以避免甲醇在 AOX催化下产的H 0 对细胞的毒害。
4、毕赤酵母自身分泌到培养基中蛋白很少，使得分 泌性的外源蛋白容易从培养基的基质中分离
5、毕赤酵母对外源蛋白产物进行N一乙酰糖基化修 饰的结构为高甘露糖型，糖链平均为8～14个甘露 糖基，更接近于高等生物，且聚糖末端不含 1，3 连接的甘露糖残基(有强的免疫原性)，因而适用 于临床应用 6、使用方便、简单，而且成本较低
• 80年代由Philips pertoleum公司合作开发毕赤酵 母表达外源基因的研究。研究人员分离了醇氧化 酶（AOX）的基因和启动子，构建了载体和菌株， 开发了毕赤酵母基因操作的相关技术。
• 1993年Philips pertoleum公司委托Invrtigone公 司代理毕赤酵酶（AOX）
甲醇
AOX
毕赤酵母表达研究进展
利用强效可调控启动子AOX，已高效表达了HBsAg、TNF、EGF、破伤风毒素C片段、基因1工程抗体等多种外源基因［11、12、13］，证实该系统为高效、实用、简便，以提高表达量并保持产物生物学活性为突出特征的外源基因表达系统，而且非常适宜扩大为工业规模［14］11. 彭毅，杨希才，康良仪。
影响甲醇酵母外源蛋白表达的因素。
生物技术通报2000，4：33-3612. 11 3 Cregg JM . Tschopp JF Stillman C, et al .High-level expression and efficient assembly of hepatitis B surface antigen in the methylotrophic yeast pichia.pastoris Bio/Technology,1987,5:479-48513. Sreekrishma K , Nelles L ，Potenz R，et al .High-level expression ,purification ,and characterization of recombinant human tumor necrosis factor synthesized and characterization in the methylotrophic yeast pichia .pastoris ,Biochemistry ,1989,28:4117-412514. Siegel RS , Buckholz RG, Thill GP , et al .Production of epider growth factor in methylotrophic yeast cells, International Patent Application ,1990 ,Publication No:WO90/10697毕赤酵母是甲醇营养型酵母，可利用甲醇作为其唯一碳源。
巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统综述
毕赤酵母启动子以及诱导物
启动子 诱导表达 AOX1，AOX2(甲醇氧化酶) 以甲醇诱导表达 GAP （3 一磷酸甘油醛脱氢酶） 葡萄糖组成型 表达（甘油或甲醇诱导产量只有2/3，1/3） FLD1（甲醛脱氢酶） 以甲基化胺为氮源 (葡萄 糖为碳源)，甲醇为碳源 (硫酸铵为氮源)表达 PEX8（过氧化物酶体基质蛋白） 以葡萄糖、 甲醇诱导表达 YPT1（GTP酶） 以葡萄糖甲醇、甘露糖醇组 成型表达
外源蛋白在巴斯德毕赤酵母中的 表达种类
具有代表性的如下列一些外源蛋白质P.pastoris中已经获得高效产 生： (1)蛋白酶类，如人溶菌酶、人胃促胰酶、葡萄糖苷酶等； （2）激素类，如胰岛素前体、人绒毛膜促性腺激素、鲤鱼生长激 素等； （3）受体、抗体及单链抗体等生物活性蛋白； (4)抗原类，如乙型肝炎表面抗原、破伤风毒素片段C、登革热病 毒E蛋白等； (5)细胞因子类，如肿瘤坏死因子、表皮生长因子、血管生成抑制 因子等； （6）酶制剂类，如植酸酶等； (7)病毒蛋白类，如乙型脑炎病毒E蛋白、伪狂犬病病毒Ea株gE蛋 白等
毕赤酵母的优点
利用受甲醇诱导的醇氧化酶(AOX1)启动子，可严格 控制外源基因的表达
营养要求简单，生长快速，适合高密度大规模培养， 很少产生有毒物质，毒性比细菌小，用甲醇不易染菌， 可以减少污染。 外源蛋白基因遗传高稳定性，外源蛋白质具有一定程 度上的折叠加工和糖基化修饰，性质较原核表达的蛋 白质更加稳定，特别适合于表达真核生物基因和制备 有功能的蛋白质。
毕赤酵母发酵工艺对产量的影响
甲醇营养型毕赤酵母表达外源蛋白发酵一般有二个阶 段，即酵母细胞营养生长阶段和外源蛋白表达阶段。 酵母细胞生长阶段主要目的为达到一定的菌体量，另 一方面通过流加限制甘油来抑制甲醇代谢途径，并使 细胞从甘油相顺利向甲醇相过渡。 蛋白表达阶段由于毕赤酵母具有以甲酵作为唯一碳源 和能源的特性，且外源基因就插入在能够利用甲醇的 AOX基因中，当甘油用完时立刻补入甲醇诱导AOX基 因产生醇氧化酶来利用甲醇，同时启动表达外源基因 的AOX的启动子(PAOX)表达外源基因蛋白
毕赤酵母表达系统简介
巴斯德毕赤酵母及启动子1.1 毕赤酵母表达系统简介随着蛋白异源表达的飞速发展，越来越多的表达系统被建立并得到应用。
酵母作为单细胞真核生物，因具有比较完备的基因表达调控机制和对表达产物的加工修饰能力，仍表现出不可比拟的优势。
以甲醇营养型酵母（Methylotrophic yeast）-毕赤酵母为代表的第二代酵母表达系统，是近年来被公认的最有效的外源蛋白表达系统之一，已有多种外源蛋白在该宿主系统中获得了成功表达[1]。
作为生产外源蛋白的重要宿主菌，依靠其各种不同功能的表达载体，已经得到广泛的应用。
表达的蛋白质包括酶、膜蛋白、抗原、抗体和调节蛋白等[2,3]。
毕赤酵母（Pichia pastoris）表达系统是近年来发展迅速、应用广泛的一种真表达系统。
它是甲醇营养型酵母菌，有两个乙醇氧化酶（alcohol oxidase，Aox）码基因AOX1和AOX2，两者序列相似，AOX1基因严格受甲醇诱导和调控。
当甲醇为唯一碳源时，AOX1启动子可被甲醇诱导，启动乙醇氧化酶的表达，从而用甲醇进行代谢[4]。
含AOX1启动子的质粒可用来促进编码外源蛋白的目的因的表达。
随着Invitrogen公司开发的一系列毕赤酵母表达试剂盒的应用，目前用该统已成功表达出了数以千计的来自细菌、真菌、原生动物、植物、无脊椎动物、包括人在内的脊椎动物以及病毒等的具有生物学功能的外源蛋白或蛋白结构[5,6]。
1.1.1 P.Pastoris表达载体及其元件由于毕赤酵母没有稳定的附加质粒，表达载体需与宿主染色体发生同源重组，外源基因表达框架整合于染色体中以实现外源基因的表达整合表达的优点在于保持外源基因稳定性并可产生多拷贝基因。
典型的毕赤氏酵母表达载体含有醇氧化酶基因的调控序列，主要的结构包括：5′AOX1启动子片段、多克隆位点(MCS)、转录终止和polyA形成基因序列(TT)、筛选标记(His4或Zeocin)、3′AOX1基因片段，作为一个能在大肠杆菌中繁殖扩增的穿梭质粒，它还有部分pBR322质粒或COLE1序列。
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本科毕业论文外文翻译译文：毕赤酵母的原生质体和分离出的丝状真菌的细胞核融合来源：Enzyme Microb. Technol., 1997, vol. 21, July*PROMI, Av. Belgrano y Pje. Caseros, Tucumdn, Argentina; ‘Universidad National de San Juan;and *Universidad National de Tucumdn, Tucumdn, Argentina摘要：原子质体是从丝状真菌串珠镰刀菌的菌丝及里氏木霉菌中分离出来，并使用聚乙二醇作为融合剂，来融合发酵木糖酵母毕赤酵母的原生质体。
混合物是似酵母的形态，当夹紧均匀电场电泳被完成时，能够表现出类似染色体模式向亲代的酵母水解木聚糖。
这些杂交被孤立，同时他们的木聚糖酶活性进行定量确定。
木聚糖酶活性在亲代的真菌物种在96小时时表现出最大的增长；在培养基为F 时，它到达796nkat每毫升。
在120小时时，串珠菌898nkat每毫升成长为T。
里氏木霉菌。
木聚糖酶活动在其中的一个混合物达到350nkat每毫升时，并在9小时时，毕赤酵母本身没有显示出木聚糖酶的活动。
关键词：华赤酵母；孤立丝状真菌；细胞融合介绍半纤维素代表着所有木本植物资料的一个重要的部分，并像是一个大型闲置的蓄水池的碳源为微生物的生长提供环境；然而，大部份的酵母无法正常代谢木聚糖和其他半纤维素的成分。
这限制了他们作为碳源，为日益增加的若干环节使用酵母来生产饮料、食品、药品以及许多其他产品。
丝状真菌的许多物种产生木聚糖酶和其他的水相酶,和一些发酵产生的木糖并产生乙醇。
我们正在调查发酵木糖，通过休哈塔假丝酵母，管囊酵母，和毕赤酵母成为乙醇的研究。
酵母菌株的原生质体属于上面所提到的物种与酿酒酵母的原生质体融合在一起。
得到了所有的混合物与木糖相似,但没有被同化了。
无论是从其它谷草转氨酶菌株中获得的核酵母株或从不相关的生物中获得的原子核，来使酵母原生质体融合被认为是可行的已有一段时间了。
并且它已应用于从大鼠肝细胞核的DNA序列中获得的酵母株的构造(布鲁斯)。
哈茨木霉菌的菌株核已经从相同的菌株或也用另一个相似物种的菌株来融入原生质体；以此产生混合物。
不同种类的曲霉菌及木霉菌的原生质体的融合是公认改良遗传的工业菌株技术的物种。
最近,据Kumari和Panda7报道了一种里氏木霉菌和酿酒酵母属间的原生质体融合。
我们最近进行的是一项以从镰胞菌种中的丝状真菌来水解木聚糖，及木霉菌属病菌的酵母种类的毕赤酵母和里氏木酶发酵木糖基因的转移为目标的，并且病菌的物种也同样使用发酵木糖。
我们已经成功构建了由原生质体融合似酵母的混合物转为水解木糖。
此外，这些似酵母的混合物也保留了发酵木糖成为乙醇能力,因此可以用于发酵木聚糖直接制造乙醇。
融合物是需要使用木聚糖作为碳源和以硝酸盐作为氮源以选择性的条件来混合重获的。
在融合菌株用于工业用途中，营养缺陷型的标记的使用被认为是不受欢迎的，由于营养缺陷型的转变也可以修改基因控制的主要工业中的重要特征的酵母。
我们想强调由于亲代的酵母菌种并不采用硝酸盐作为含氮源，也不会使木聚糖变形,因此它不会从木聚糖生产乙醇，同时拥有的染色体粒度范围在大多数的酵母中获得。
利用硝酸盐的混合物作为一个氮源，发酵木聚糖产生乙醇,而且也有同样的大小范围中的染色体作为大多数的酵母。
以取得真正的混合物。
这篇论文研究结果是混合物的具有特点。
材料与方法有机体酵母有毕赤酵母。
真菌有串株镰刀菌，赤霉病菌，镰刀菌，和尖孢镰刀菌是在宾夕法尼亚大学的研究中心，由阿根廷的安蒂奥基亚大学的S.Chulze博士进行研究的，此外里氏木酶是由阿根廷西北部沼泽地的安蒂奥基亚大学的Cuevas 博士进行研究的。
栽培维护丝状真菌维持在PDA偏含10克Lˉ¹葡萄糖。
毕赤酵母仍保持在YEPD琼脂含10gLˉ¹酵母提取物、20gLˉ¹蛋白胨，其次是20克Lˉ¹葡萄糖，15gLˉ¹夏甲。
此外有机体以15天为一定期做培养。
丝状真菌的培养媒体丝状真菌的栽培介质主要是将碳源添加到20克Lˉ¹葡萄糖或birchwood20克Lˉ¹木聚糖的媒体中。
融合产物再生的重建媒介在融合产物中发现了10gLˉ¹木聚糖，2gLˉ¹酵母提取物、0.6MKC1(作为一种渗透稳定剂)，和30gLˉ¹夏甲的查氏介质。
融合产物的选择性介质为了研究在不同的媒体中毕赤酵母与融合产物的成长能力，这些细胞被培养下列媒体：a)C-Glu：包含20g/mL葡萄糖的查氏介质。
b)C-Xln：包含20g/mL木聚糖的查氏介质。
c)C-Xln-YE：包含20g/mL酵母膏和20g/mL木聚糖的查氏介质。
d)YNB-Xln：6.7g/mL酵母氮基（培养基）混合20g/mL木聚糖。
e)YNB-Xln-YE：6.7g /mL酵母氮基（培养基）混合20g/mL木聚糖和20g/mL 酵母膏。
f)YNB-Glu：6.7g/mL酵母氮基（培养基）混合20g/mL葡萄糖。
YNB-/酵母氮基（培养基）混合20g/mL木胶糖。
在所有的介质中，琼脂浓度是20g/mL。
木聚糖酶活性测定的媒介木聚糖酶活性是在XP-Xln介质中测定其栽培生长率(10gLˉ¹酵母提取物、20gLˉ¹蛋白胨和20gLˉ¹木聚糖)。
发酵媒体亲代菌株毕赤酵母，串株镰刀菌，里氏木酶与融合的产品,来测试发酵木糖和木聚糖产生乙醇的能力。
发酵媒体的合成物是：a)YP-Xyl：10gLˉ¹酵母提取物，20gLˉ¹蛋白胨，和20gLˉ¹木胶糖。
b)YP-Xln：10Lˉ¹酵母提取物，20gLˉ¹蛋白胨，和20gLˉ¹木聚糖。
丝状真菌培养为了进一步的融合来选择真菌菌株，串株镰刀菌NRRL13616，赤霉病菌NRRL5883，镰刀菌NRRL6322，尖孢镰刀菌，和氏木霉QM9441的栽培都生长在含有50毫升的锥型的介质与20gLˉ¹木聚糖的蔡氏培养基的250毫升烧瓶里。
接种的烧瓶是一种接种物，相当于7克干菌丝体体重Lˉ¹介质在30°C及在200个每分钟转速的一个震动器中孵化，并定期抽样。
木聚糖酶活性在每一个样品中进行测定。
真菌菌丝形成的原生质体氏木霉和串株镰刀菌的文化是以被里长为250-ml锥形瓶烧瓶包含50毫升的察氏培养基同50克1ˉ¹葡萄糖作为碳源。
这些文化中被灌输1射线异物检查装置真菌孢子每毫升，18小时，在30℃并在一个以200转速旋转摇荡器孵化。
菌丝体被恢复成为附近的的过滤和濯三次同无菌水。
被洗净的菌丝体只能以包含0.01米二硫苏糖醇在柠檬酸盐磷酸盐缓冲血液酸碱度7.3，和孵化为1综合质量控制在30℃源文件的预处理方法。
并且mycelium当时过滤桶的滤波器纸，被同一个柠檬酸盐磷酸盐洗三次，由0.7mKCl代替5.8作为一个渗透的稳定剂。
生物的数量以PH值5.8，并包含0.7KC1和7mgmLˉ¹ Novozym234的血小板分离术的缓冲器。
KCl被添加为一个渗透的稳定剂。
在30℃的悬浮物搅动在100每分钟转数为4-5小时间的最佳组合被孵化，并被监测下一个相衬显微镜。
并且该通过过滤，其他的碎片，将同一个渗透洗三次，消除为菌体丝。
核分离的真菌氏木霉的细胞核和串株镰刀菌，在4°C时，采用细胞溶解原生质体的差速离心在聚蔗糖溶液剂的作用下被分离如下：i)原生质体培养溶液中包含了180克Lˉ¹聚蔗糖，20毫米KH2PO4，钙离子，和pH值为6.5苯甲基磺酰化氟(PMSF)。
该方案溶解了原生质体，而不能使核保持完整。
ii)细胞核悬浮液是处理内含有70克Lˉ¹聚蔗糖，20毫米KH2PO4，0.5毫米钙离子，1毫米PMSF，1米山梨醇、和200克Lˉ¹甘油在核心净化的溶液。
最终的净化颗粒重新分散在0.5毫升的溶液.所提到的步骤二和使用酵母原生质体使核立即融合。
在荧光显微镜下，观察到孤立的细胞核被DAPI沾满。
酵母的原生质体与丝状真菌的核的融合酵母原生质体通过标准的方法获得。
原生质体被重新分散在0.4米CaCl2的0.5毫升溶液，并与细胞核悬浮液混合，在10分钟內分离在12000g。
上清液被抛弃，同时颗粒重新分散到融合的混合物中。
悬浮液在25°C待10分钟并被孵化。
融合产物的再生熔液添加到稳定渗透，在42°C下，融化再生介质，混合、倒作为一种叠加在相同的再生的介质中，并使其变硬。
在30°C下孵化4-5天，直到似酵母的细菌出现。
这些细菌被转移到选择性媒体C-Xln-YE中来分离理想的融合产物的特性。
似酵母的细菌在C-Xln-YE介质上生长，并面临选择。
木聚糖酶活性的测定似酵母的混合物和丝状真菌的亲代菌株在YP-Xln介质被培养。
定期测定木聚糖酶活性；这是在上清液确定为似酵母的混合物和通过二硝基水杨酸方法对丝状真菌过滤。
木聚糖酶活性，表现在nkat每毫升。
发酵试验发酵试验，毕赤酵母和似酵母混合物分别在YP-Xyl和YP-Xln媒体，并以24小时的周期，120-144小时间在30°C的丝状真菌与最少的搅拌，在介质里允许少量的氧气进行的。
定期采样培养。
乙醇和木糖的浓度由高效液相色谱法和高效液相色谱法测定木聚糖的苯酚/硫酸的方法所决定。
脉冲场凝胶电泳电泳的分析执行是通过使用基于CHEF技术的CHEFDRII系统。
琼脂插头依据前述方法准备。
凝胶是在0.5X电脉缓冲液下，使用1%染色体品位的琼脂。
脉冲周期在12小时到60小时间，在125-450脉冲中转换，并分别在0.5X电脉缓冲液下在14°C的缓冲区被用来分离染色体。
研究结果为了在融合时，选择作为亲代的真菌菌株。
不同真菌菌株(见材料和方法)的分批培养物都生长在C-Xln介质中，并在30°C温度下，在旋转摇荡器以200每分钟转速进行操作。
在七天中，样品每隔12小时被拿出来。
并对木聚糖酶活性进行了测定。
氏木霉和串株镰刀菌表现出最高的木聚糖酶活性(表1),并用他们的核和毕赤酵母的原生质体的得以融合。
在分析这些检测中的酵母原生质体的构造是在显微镜下进行比较，监测的。
原生质体维持在一个稳定渗透的溶液里,随后被当作是一种亲代菌株与两种真菌核的融合。
用过滤设备，将真菌原生质体从菌丝片段中分离出来。
孤立原子核被DAPI 沾满，并在显微镜下观察他们的纯度和完整性。
孤立的细胞核在形态学上是完整的，并且不受细胞污染的影响。
在显微镜下观察真菌核，并不能看到原生质体。
当第二次控制和检验中,既没有真菌细胞也没有孢子在细胞核悬浮液中，一小份的悬浮液涂沫在皮氏培养皿中并含有再生介质，来用于融合产物再生。