《酶的定向催化》PPT课件
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酶(生物化学)PPT课件
详细描述
酶的活性中心是酶分子中具有特定空间结构的区域，能够与底物特异结合，并 通过催化反应将其转化为产物。活性中心的氨基酸残基通常是高度保守的，对 酶的催化活性至关重要。
酶的专一性
总结词
酶的专一性是指一种酶只能催化一种或一类化学反应的性质 。
详细描述
酶的专一性是酶的重要特性之一，它决定了酶在生物体内的 功能。一种酶通常只能催化一种或一类化学反应，这是因为 酶的活性中心具有特定的空间结构和化学环境，只能够与特 定的底物结合并催化相应的反应。
食品保鲜
酶可用于食品保鲜，如抑制果蔬 中酶的活性，延缓成熟和腐烂过 程；也可用于食品中农药残留的
降解。
功能性食品开发
酶可用于开发功能性食品，如通 过酶促反应生产低糖、低脂或高
纤维食品。
酶在环保领域的应用
有毒有害物质降解
酶可用于降解有毒有害物质，如重金属离子、有机溶剂和农药等， 降低其对环境和生物体的危害。
的诊断。
药物生产
酶可用于药物的生产和制造过程中， 如抗生素、激素和蛋白质药物等， 通过酶促反应提高生产效率和纯度。
生物治疗
酶在某些生物治疗过程中起到关键 作用，如基因疗法和细胞疗法中， 酶可促进特定基因的表达或改变细 胞代谢。
酶在食品工业中的应用
食品加工
酶在食品加工过程中起到重要作 用，如淀粉的改性、蛋白质的水 解和油脂的加工等，可改善食品 的口感、营养价值和加工性能。
计算机辅助设计
计算机辅助设计是一种利用计算 机模拟技术来预测和优化酶性能
的方法。
通过计算机模拟，可以预测酶的 催化机制、反应路径和动力学行
为，从而指导酶的优化设计。
计算机辅助设计与其他技术结合， 如量子化学计算和分子动力学模 拟，可进一步提高酶优化效率。
酶的活性中心是酶分子中具有特定空间结构的区域，能够与底物特异结合，并 通过催化反应将其转化为产物。活性中心的氨基酸残基通常是高度保守的，对 酶的催化活性至关重要。
酶的专一性
总结词
酶的专一性是指一种酶只能催化一种或一类化学反应的性质 。
详细描述
酶的专一性是酶的重要特性之一，它决定了酶在生物体内的 功能。一种酶通常只能催化一种或一类化学反应，这是因为 酶的活性中心具有特定的空间结构和化学环境，只能够与特 定的底物结合并催化相应的反应。
食品保鲜
酶可用于食品保鲜，如抑制果蔬 中酶的活性，延缓成熟和腐烂过 程；也可用于食品中农药残留的
降解。
功能性食品开发
酶可用于开发功能性食品，如通 过酶促反应生产低糖、低脂或高
纤维食品。
酶在环保领域的应用
有毒有害物质降解
酶可用于降解有毒有害物质，如重金属离子、有机溶剂和农药等， 降低其对环境和生物体的危害。
的诊断。
药物生产
酶可用于药物的生产和制造过程中， 如抗生素、激素和蛋白质药物等， 通过酶促反应提高生产效率和纯度。
生物治疗
酶在某些生物治疗过程中起到关键 作用，如基因疗法和细胞疗法中， 酶可促进特定基因的表达或改变细 胞代谢。
酶在食品工业中的应用
食品加工
酶在食品加工过程中起到重要作 用，如淀粉的改性、蛋白质的水 解和油脂的加工等，可改善食品 的口感、营养价值和加工性能。
计算机辅助设计
计算机辅助设计是一种利用计算 机模拟技术来预测和优化酶性能
的方法。
通过计算机模拟，可以预测酶的 催化机制、反应路径和动力学行
为，从而指导酶的优化设计。
计算机辅助设计与其他技术结合， 如量子化学计算和分子动力学模 拟，可进一步提高酶优化效率。
酶催化反应机制.pptx
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(四) 共价催化:
标志：催化过程中形成共价中间物1 亲核催化: 带有多余电子对的基团或原子攻击缺少电子而带有部分正电性的原子或基团并形成不稳定的共价中间物的催化方式。 亲核试剂: Glu-COO- Asp-COO- His-咪唑基2 亲电催化: 由缺少电子的亲电试剂从带负电的基团上夺取一对电子并形成共价中间物的催化方式。 亲电试剂： -NH3+
第2页/共19页
(二) 底物形变与诱导楔合
底物形变(distortion)和诱导契合(induced fit)： 酶与底物在构象上相互诱导以便更好配合，作用力的产生往往导致底物形变，使被作用的底物敏感键极易断裂例如：溶菌酶催化时使底物糖环由椅式转变为半椅式
第3页/共19页
(三) 广义酸碱催化及共催化：
第8页/共19页
第二节 几种酶作用机制举例
一 溶菌酶(Lysozyme EC 3.2.1.17 )：存在于鸡蛋清和动物分泌物中，单肽链129个aa，14,600，折叠成近球状(4.53 3nm)， 底物为NAG和NAM相间 排列或NAG的单聚物催化过程： ①与底物结合: 6个糖环第 3个必须是NAG；其它 糖环和酶形成氢键放能 并导致第4个糖环D由 椅式转变为半椅式 （4kcal/mol)
二 酶与底物相互作用——过渡态
E + S ES* E+P 酶通过与底物形成过渡态中间物， 降低反应活化能而加速反应。过渡态中间物的维持力主要是一 些次级键：氢键、离子键、疏水力等， 形成过程中放出大量能量，抵消了部分活化能处于过渡态的酶与底物的具有很高的亲和力，比底物或产物高出几个数量级底物过渡态类似物： 例如天然具有半椅式结构的环内酯作为溶菌酶的底物，对酶的亲和力比一般糖环高3600倍。
(四) 共价催化:
标志：催化过程中形成共价中间物1 亲核催化: 带有多余电子对的基团或原子攻击缺少电子而带有部分正电性的原子或基团并形成不稳定的共价中间物的催化方式。 亲核试剂: Glu-COO- Asp-COO- His-咪唑基2 亲电催化: 由缺少电子的亲电试剂从带负电的基团上夺取一对电子并形成共价中间物的催化方式。 亲电试剂： -NH3+
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(二) 底物形变与诱导楔合
底物形变(distortion)和诱导契合(induced fit)： 酶与底物在构象上相互诱导以便更好配合，作用力的产生往往导致底物形变，使被作用的底物敏感键极易断裂例如：溶菌酶催化时使底物糖环由椅式转变为半椅式
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(三) 广义酸碱催化及共催化：
第8页/共19页
第二节 几种酶作用机制举例
一 溶菌酶(Lysozyme EC 3.2.1.17 )：存在于鸡蛋清和动物分泌物中，单肽链129个aa，14,600，折叠成近球状(4.53 3nm)， 底物为NAG和NAM相间 排列或NAG的单聚物催化过程： ①与底物结合: 6个糖环第 3个必须是NAG；其它 糖环和酶形成氢键放能 并导致第4个糖环D由 椅式转变为半椅式 （4kcal/mol)
二 酶与底物相互作用——过渡态
E + S ES* E+P 酶通过与底物形成过渡态中间物， 降低反应活化能而加速反应。过渡态中间物的维持力主要是一 些次级键：氢键、离子键、疏水力等， 形成过程中放出大量能量，抵消了部分活化能处于过渡态的酶与底物的具有很高的亲和力，比底物或产物高出几个数量级底物过渡态类似物： 例如天然具有半椅式结构的环内酯作为溶菌酶的底物，对酶的亲和力比一般糖环高3600倍。
酶与催化反应PPT课件
17
三、按酶所催化反应的类型将酶分为六大类
氧化还原酶类：催化氧化还原反应的酶 转移酶类：催化分子间基团转移或交换的酶 水解酶类：催化底物发生水解反应的酶 裂合酶类：催化从底物移去一个基团并形成双 键的反应或其逆反应的酶 异构酶类：催化同分异构体相互转化的酶类 合成酶类：催化两种底物形成一种产物同时偶 联有高能键的水解释能的酶
由多个相同或不同的亚基组成的酶。
16
多酶复合物（multienzyme complex）， 或称多酶体系（multienzyme system） 由催化不同化学反应的多种酶聚合组成 如：丙酮酸脱氢酶复合物
多功能酶（multifunctional enzyme） 或称串联酶（tandem enzyme） 多种催化功能融合于一条多肽链的酶 如：哺乳动物脂肪酸合成酶
8
• 一级反应（first-order reaction）:单底物反应
V仅依赖于一个底物浓度[S]； V = k [S]
• 二级反应（second-order reaction） ：双底 物反应
V依赖于两个底物浓度和反应速率常数 V = k [S1][S2]
9
二、酶的化学本质是蛋白质
（一）单纯酶仅含有氨基酸组分
速率相等时，反应便不再有新的产物生成,这时 的化学反应称为反应平衡。
平衡常数（equilibrium constant, Keq） 平衡常数是指化学反应达到平衡时，反
应产物浓度成积与剩余底物浓度成积之比。
4
一定的温度下，Keq与反应的初始浓度无关，
它反映化学反应的本性。 Keq越大则反应越倾向于产物的生成；
辅基 (prosthetic group): 与酶蛋白结合紧密，不能用透析或超 滤的方法除去。
三、按酶所催化反应的类型将酶分为六大类
氧化还原酶类：催化氧化还原反应的酶 转移酶类：催化分子间基团转移或交换的酶 水解酶类：催化底物发生水解反应的酶 裂合酶类：催化从底物移去一个基团并形成双 键的反应或其逆反应的酶 异构酶类：催化同分异构体相互转化的酶类 合成酶类：催化两种底物形成一种产物同时偶 联有高能键的水解释能的酶
由多个相同或不同的亚基组成的酶。
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多酶复合物（multienzyme complex）， 或称多酶体系（multienzyme system） 由催化不同化学反应的多种酶聚合组成 如：丙酮酸脱氢酶复合物
多功能酶（multifunctional enzyme） 或称串联酶（tandem enzyme） 多种催化功能融合于一条多肽链的酶 如：哺乳动物脂肪酸合成酶
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• 一级反应（first-order reaction）:单底物反应
V仅依赖于一个底物浓度[S]； V = k [S]
• 二级反应（second-order reaction） ：双底 物反应
V依赖于两个底物浓度和反应速率常数 V = k [S1][S2]
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二、酶的化学本质是蛋白质
（一）单纯酶仅含有氨基酸组分
速率相等时，反应便不再有新的产物生成,这时 的化学反应称为反应平衡。
平衡常数（equilibrium constant, Keq） 平衡常数是指化学反应达到平衡时，反
应产物浓度成积与剩余底物浓度成积之比。
4
一定的温度下，Keq与反应的初始浓度无关，
它反映化学反应的本性。 Keq越大则反应越倾向于产物的生成；
辅基 (prosthetic group): 与酶蛋白结合紧密，不能用透析或超 滤的方法除去。
【正式版】酶的定向进化PPT
因与载体重组，再转入 适宜的细胞或包装成重组λ黏粒载体
➢ 转化向选择环境条件的设定 （2）高通量筛选技术
DNA改组技术 ➢ 特点：正突变频率高，进化速度快。 ➢ 注意：需多次进行。
3、基因家族之间的同源重组
从自然界中存在的基因家族出发，利用它 们之间的同源顺序进行DNA改组实现同源重组。
如：Stemmer等从4种微生物中选择编码头孢菌 素酶的4个同源基因，对它们进行单独进化或同 源重组进化。结果对单基因进化得到的突变酶中， 对头孢羟羧氧胺的抗性最高的增加了8倍，而用 家族同源重组进化的方法使抗性比其中两种微生 物来源的天然酶提高270倍，比另外两种酶提高 了540倍。
3、基因家族之间的同源重组 1、易错PCR技术为代表的无性进化 DNA重排技术：又称DNA改组技术，有性PCR（sexual PCR）。 1、易错PCR技术为代表的无性进化
易错PCR：从酶的单一基因出发，在改变反应条 从自然界中存在的基因家族出发，利用它们之间的同源顺序进行DNA改组实现同源重组。
3、基因家族之间的同源重组 反应条件：提高Mg2+浓度；
4.6.3 酶基因的随机突变
1、易错PCR技术为代表的无性进化
定向进化的基无本规性则是“突获取变你所：筛选的向突变单体”一。 酶分便筛选。 如：Stemmer等从4种微生物中选择编码头孢菌素酶的4个同源基因，对它们进行单独进化或同源重组进化。
酶的定向进化
➢ 酶分子的定向进化（directed evolution）：模 拟自然进化过程（随机突变和自然选择），在 体外得到具有优良催化特性的酶的突变体的技 术过程。
属于蛋白质的非合理设计，它不需事先了解酶的 空间结构和催化机制。
平板筛选技术 荧光筛选法 噬菌体表面展示法 酵母细胞表面展示法
➢ 转化向选择环境条件的设定 （2）高通量筛选技术
DNA改组技术 ➢ 特点：正突变频率高，进化速度快。 ➢ 注意：需多次进行。
3、基因家族之间的同源重组
从自然界中存在的基因家族出发，利用它 们之间的同源顺序进行DNA改组实现同源重组。
如：Stemmer等从4种微生物中选择编码头孢菌 素酶的4个同源基因，对它们进行单独进化或同 源重组进化。结果对单基因进化得到的突变酶中， 对头孢羟羧氧胺的抗性最高的增加了8倍，而用 家族同源重组进化的方法使抗性比其中两种微生 物来源的天然酶提高270倍，比另外两种酶提高 了540倍。
3、基因家族之间的同源重组 1、易错PCR技术为代表的无性进化 DNA重排技术：又称DNA改组技术，有性PCR（sexual PCR）。 1、易错PCR技术为代表的无性进化
易错PCR：从酶的单一基因出发，在改变反应条 从自然界中存在的基因家族出发，利用它们之间的同源顺序进行DNA改组实现同源重组。
3、基因家族之间的同源重组 反应条件：提高Mg2+浓度；
4.6.3 酶基因的随机突变
1、易错PCR技术为代表的无性进化
定向进化的基无本规性则是“突获取变你所：筛选的向突变单体”一。 酶分便筛选。 如：Stemmer等从4种微生物中选择编码头孢菌素酶的4个同源基因，对它们进行单独进化或同源重组进化。
酶的定向进化
➢ 酶分子的定向进化（directed evolution）：模 拟自然进化过程（随机突变和自然选择），在 体外得到具有优良催化特性的酶的突变体的技 术过程。
属于蛋白质的非合理设计，它不需事先了解酶的 空间结构和催化机制。
平板筛选技术 荧光筛选法 噬菌体表面展示法 酵母细胞表面展示法
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2、多样性的产生
四、定向进化的策略
（1）易错 PCR(error-prone PCR)
• 通过改变PCR反应条件，使扩增的 基因出现少量碱基错配，从而导致
目的基因的随机突变。
• 控制DNA的突变频率。 • 不足之处：
• 靶序列长度一般在0.5-1.0kb，应用范围 有限；
• 中性突变较多；且较为耗时、费力 • 获得的DNA序列中碱基的转换高于颠换。
2、定向进化
• 在实验室中模仿自然进化的关键步 骤（突变、重组和筛选），在较短 时间内完成漫长的自然进化过程， 有效改造蛋白质，使之适于人类的 需要。
• 人为引发、较短时间、人为选择。
3、定向进化的一般过程
诱变
细菌
最适生长温度为 370C
突变体库
50 0C培养
选择压力 （温度）
温度耐受型突 变体
Directed enzyme evolution
一、自然进化与定向进化
达尔文在《物种起源》中提出以自然选择为基础的进 化学说，成为生物学史上的一个转折点。
1、自然进化
（1）环境压力下物种朝着适应生存 环境的方向发展； （2）漫长时间里通过DNA复制发生 突变或通过重组，产生了遗传多样 性； （3）自发、非常缓慢、自然选择；
• 又称有性PCR，指DNA分子的体外重组，是基因在分子 水平上进行有性重组。
• 通过改变单个基因（或基因家族）原有的核苷酸序列， 创造新基因，并赋予表达产物以新功能。
• 分子育种。
（a)单个基因的DNA改组
• 从突变体基因库中分离出来的 DNA片段用脱氧核糖核酸酶I随 机切割得到的随机片段经过不 加引物的多次PCR循环。
此法突变具有一定的密码偏向性。
（2）连续易错 PCR(Sequential error-prone PCR)
• 将一次PCR扩增得到的有益突变基因作为下一次PCR扩增的 模板，连续反复进行随机诱变，使得每一次获得的少量突 变累积而产生重要的有益突变。
（3）DNA改组技术(DNA shuffling)
（d）随机引物体外重组法(RPR)
• 单链DNA为模板，随机序列引物PCR，DNA小片段 互为模板扩增获得重新排布的突变基因
（e）交错延伸原理
• 采用基因家族的改组效果明显高于单个基因的改 组效果。
• 特点：改组基因的效虑的因素
体扩增过程中容易丢失； • 转化效率普遍较低； • 不适合的长期保存。4、的筛选
• 建立有效的搜索的方法是影响定向进化成功 与否的关键；
• 采用的定向筛选方法必须灵敏，且应与目的性质 相关；
• 借助检测仪器易实现高通量筛选。
5、定向进化的筛选
• 活体筛选法-基于表形观察的筛选法（细菌、纤毛虫细胞表面）； • 筛选方法根据各个蛋白质的性质而设计的，不具有通用性； • 突变体基因筛选能否成功的关键是将基因的表型和能通过定量表征的
在20世纪60年代利用RNA噬菌体Q进行实验， 是第一次在分子水平上定向改造单一分子。
• 1981年，B.G.Hall等定向改变E.coliK12中ebg酶的底物 专一性，开发出对几种糖苷键有水解能力的酶。
• 1993年，Arnold研究组提出易错PCR的方法。 • 1994年，Stemmer将DNA重组方法引用到酶分子的定向进
筛选手段紧密联系； • 为加快分离目的基因的过程，已建立起多种在基因发现上选技术
（1）突变微生物分离 琼脂板涂布法在特殊条件下培养突变菌，通过宿主菌的生
长情况、培养基颜色、特定反应的出现等判断是否具有目的 基因。 • 微球细胞固定法与数字成像系统结合：将单个细胞附着在单 个固体珠上，突变体进行分离和筛选。 • 流式细胞计数法：细胞经荧光染色后，通过高速流动系统， 排成单行，逐个通过流式细胞计数仪进行测定。
化中。 • 1999年，Stemmer等把DNA改组延伸到族改组。
三、酶分子的定向进化
• 从天然的或人为获得的酶出发，经过基因突变 和重组，构建一个人工突变酶库，通过筛选最 终获得预先期望的具有某些特性的进化酶。
定向进化=随机突变+正向重组+选择（或筛选）
1、定向进化的过程
• （1）通过随机突变和(或)基因体外重组创造基因多性突变子。 • 这个过程可重复循环，直至得 • 插入片段的装载容量大系统
• 计上有片段 之间互为模板和引物进行扩增， 直到获得全长的基因，这导致 来自不同基因片段之间的重组。
DNA改组与常规定向进化的比较
（b) 基因家族改组技术(family shuffling)
(c ) DNA改组原理
1. DNaseI 产生随机片段； 2. 随机片段变性； 3. 随机片段复性； 4. 延伸 反复重复 步后，可获得全长 DNA 片段 2-4。
4、酶定向进化的意义
• 酶作为生物催化剂其专一性和高效性是一般催化剂所不 能比拟的，但是天然酶的许多性质不适应工业生产的条 件。
• 选择特殊环境，利用酶定向进化技术重新设计及改进酶 分子的结构和性质，可以逐步接近和满足将酶催化用于 工业生产的需要。
二、酶分子定向进化的历史
Sol包容性） • (b)大小与特定的筛选容量相适应
2、突变体基因的构建策略
• DNA随机酶切片段拼接 • 单链DNA随机拼接（提高不同亲代基因的同源片段重组形成嵌合
体基因的效率） • 限制性酶切片段随机拼接（防止PCR扩增产生相同的亲代基因）