紫外分光光度法
紫外可见分光光度法
有色化合物组成
Fe(CNS)52MoO(CNS)52WO(CNS)4Nb(CNS)4硅钼蓝 磷 磷钨蓝 磷钼钒杂多酸 Cu(NH3)42+ Co(NH3)62+ Ni(NH3)62+ TiO(H2O2)2+ VO(H2O2)3+ Nb2O3(SO4)2(H2O2)
颜色
红 橙 黄 黄 蓝 蓝 蓝 黄 蓝 红 紫 黄 红橙 黄
OH COOH
其结构式如下：
SO3H
可用于测定三价铁离子。
② 邻二氮菲（邻菲罗啉，1， 10—二氮菲）： 结构式为：
在PH=3～9时 与Fe2+生成红 色螯合物。用 于铁的测定。
N
N
③ 双硫腙：也叫二苯—硫腙。 结构式为：
NH S C N N NH
测定很多重金属离子，如：铅、锌、铜、 银、汞、镉等。
470 氧化剂存在、 碱性 570 不同酸度 490～550 (Pb520)
偶氮胂(Ⅲ) U( Ⅳ ) 、 U( Ⅵ ) 、 强酸至弱酸 665～675 (Th665) Th( Ⅳ ) 、 Zr( Ⅳ ) 、 La3+、 Ce4+、Ca2+、Pb2+等 铬天菁S Al PH5～5.8 530
5.9×104
（二）显色剂： 与待测组分生成有色化合物的 试剂叫显色剂； 分为两种 无机显色剂和有机显色剂
1．无机显色剂：
显色剂 测定元素 反应介质 /(mol/L) 鉄 0.1～0.8 HNO3
钼 钨 铌 硅 磷 钨 钒 铜 钴 镍 钛 钒 铌 1.5～2 1.5～2 3～4 0.3～0.5 0.5 4～6 1.0 浓氨水 H2SO4 H2SO4 HCl H2SO4 H2SO4 HCl HNO3
紫外可见分光光度法
光子能量与它的频率成正比，与波长成 反比，与光强度无关。光的波长越短
（频率越高），其能量越大。
单色光： 同一波长的光称为单色光； 复合光： 不同波长的光组成的光称为复合光； 可见光： 凡是被肉眼感受到的光称为可见光； 波长范围为400-780nm
复合光
单色光
物质颜色的产生
固体
反射蓝色光 吸收黄色光
互补色
液体
透过紫色光 吸收绿色光
二、 物质对光的选择性吸收
M + h 基态 E0 （△E） M* 激发态 E1
E1
激发态
E2
E = E1 - E0 = h =h c/λ λ=hc/ E
物质对光选择性吸收
E0
基态
E
例题
某分子中两个电子能级之间的能级差为1eV， 若要电子在两个能级之间发生跃迁，需要
是指分子中的一些带有非成键电子对的基团本身在紫外-可 见光区不产生吸收，但是当它与生色团连接后，增强生色团的 生色能力，使生色团的吸收带向长波移动，且吸收强度增大。 助色团为含有未共用电子对的杂原子基团：-OH、-Cl、-Br
C.红移与蓝移
有机化合物的吸收谱带常
常因引入取代基或改变溶剂使
最大吸收波长λmax和吸收强度 发生变化:
π→π*跃迁的λmax为170nm 。
（4）n→π*跃迁：分子中孤对电子和π键同 时存在时发生n→π＊ 跃迁。丙酮n→π＊ 跃迁的λmax为275nm。
（5）电荷迁移跃迁：分子本身具有电子给予
体和电子接受部分，外来辐射照射，电子从
具有给予体特性的部分转移到具有电子接受
体特性的部分所发生的跃迁。其谱带较宽，
思考
1、庚烷、环己烷等烷烃在200-400nm内有无吸收？
第十章 紫外可见分光光度法
如果用△ E电子，△ E振动以及△E转动表示各能级 差，则：
E电 E振 E转
能级差 E h h c
由分子中的电子能级、振动能级和转动能级跃迁产 生的光谱称分子吸收光谱。
2．分子吸收光谱的分类： 分子内运动涉及电子能级、振动能级和转动
能级三种跃迁能级，
E电 E振 E转
对应的波谱区范围如下：
吸收曲线与最大吸收波长 max
①同一种物质对不同波长光的吸光度 不同。如KMnO4在400nm吸收少， 在525nm吸收最大，吸光度最大处 对应的波长称为最大吸收波长λmax ②不同浓度的同一种物质，其吸收曲 线形状相似,λmax不变。而对于不同 物质，它们的吸收曲线形状和λmax 则不同。 ③吸收曲线可以提供物质的结构信息，
电子的基团。 例： C＝C；C＝O；C＝N；—N＝N— 注：当出现几个生色团共轭，则几个生色团所产生的
吸收带将消失，代之出现新的共轭吸收带，其波 长将比单个生色团的吸收波长长，强度也增强。
下面为某些常见生色团的吸收光谱
生色团 烯 炔 羧基 酰胺基 羰基 偶氮基 硝基 亚硝基 硝酸酯
溶剂 正庚烷 正庚烷 乙醇 水 正己烷 乙醇 异辛酯 乙醚
称最小吸收波长(λmin) 。
3.肩峰:在一个吸收峰旁边 产生的一个曲折。 4.末端吸收:只在图谱短波 呈现强吸收而不成峰形的
部分。
5. 生色团
所谓生色团，是指有机化合物分子结构中含有p -
p*和n-p*中跃迁的基团,即能在紫外-可见光范围内产 生吸收的原子团。 对有机化合物：主要为具有不饱和键和未成对
概述
一、紫外-可见分光光度法：是研究物质在紫外可见光区(200 ~ 800 nm)分子吸收光谱的分析方 法。
可见光区 400~760nm；紫外光区200~400nm。 二.紫外—可见分光光度法的特点 （1）灵敏度较高：灵敏度可达10-5~10-7g/mL （2）选择性较好：多组分共存溶液中，无需化学
紫外分光光度法计算
紫外分光光度法计算紫外分光光度法（UV-Vis spectrophotometry）是一种常见的分析方法，广泛应用于化学、生化和环境领域。
它利用物质对紫外光和可见光的吸收特性，通过测量吸光度来确定物质的浓度。
下面将详细介绍紫外分光光度法的原理、仪器和具体步骤。
原理：紫外分光光度法基于物质分子的电子跃迁过程。
当物质受到紫外光或可见光的照射时，能级较低的电子会吸收光子的能量，跃迁至较高的能级。
物质的吸收特性取决于它的分子结构以及电子能级的分布。
吸光度（A）定义为样品溶液中吸收光的强度与入射光的强度之比，可以表示为A=log(I₀/I)。
仪器：紫外分光光度法所使用的仪器称为紫外可见分光光度计，包含一个光源，一个单色仪、一个样品室和一个光电二极管。
光源会产生连续的电磁辐射，单色仪可以选择所需的波长，并将光传递到样品室。
样品室包含待测样品的池，光会穿过样品后被光电二极管接收，然后转化为电信号并输出到计算机上进行处理。
步骤：1.准备样品溶液。
将待测物质溶解或稀释到合适的浓度。
溶液的量应足够填满样品池。
2.扫描选取波长范围。
根据样品的吸收特性，选择合适的波长范围进行扫描。
典型的波长范围为190 nm至800 nm，在可见光和紫外光区域进行扫描。
3.仪器的校准。
对仪器进行校准操作，通常使用空白试剂（不含待测物质的溶剂）进行校准。
将空白试剂放入样品室并设置为零点，此时光电二极管输出的电信号为零。
4.测量样品的吸光度。
将样品溶液放入样品池中，确保样品表面光滑平整。
选择合适的波长，将光源打开并扫描整个波长范围。
仪器会逐个记录每个波长对应的光电二极管输出的电信号。
通过计算光电二极管输出电信号与校准信号的比值，可以得到每个波长对应的吸光度。
5.绘制吸光度和波长之间的关系曲线。
将所测得的吸光度值绘制成图表，横轴为波长，纵轴为吸光度。
这个曲线被称为吸光度谱，可以帮助确定样品的吸收峰和最大吸收波长。
6.计算浓度。
利用兰伯特-比尔定律，即A=εlc，其中A表示吸光度，ε为摩尔吸光系数，l为光程长度，c为溶液的浓度。
紫外-分光光度法原理
紫外分光光度计的使用原理和方法紫外-可见分光光度法(ultraviolet-visible spectrophotometry, UV-VIS)1定义：它是利用物质的分子或离子对某一波长范围的光的吸收作用，对物质进行定性分析、定量分析及结构分析, 所依据的光谱是分子或离子吸收入射光中特定波长的光而产生的吸收光谱。
2分类：按所吸收光的波长区域不同：分为紫外分光光度法和可见分光光度法，合称为紫外-可见分光光度法。
3、紫外-可见分光光度法的特点：（1) 其仪器设备和操作都比较简单，费用少，分析速度快;（与其它光谱分析方法相比）（2）灵敏度高;（3）选择性好;（4）精密度和准确度较高;（5）用途广泛。
§1. 紫外-可见吸收光谱1. 物质对光的选择性吸收物质对光的吸收是选择性的，利用被测物质对某波长的光的吸收来了解物质的特性，这就是光谱法的基础。
通过测定被测物质对不同波长的光的吸收强度（吸光度），以波长为横坐标，吸光度为纵坐标作图，得出该物质在测定波长范围的吸收曲线。
在吸收曲线中，通常选用最大吸收波长λmax进行物质含量的测定。
2.有机化合物的紫外-可见吸收光谱2.1 有机化合物的电子跃迁与紫外-可见吸收光谱有关的电子有三种，即形成单键的σ电子、形成双键的π电子以及未参与成键的n电子。
跃迁类型有：σ→σ*、n→σ* 、π→π*、n→π* 四种。
饱合有机化合物的电子跃迁类型为σ→σ*，n→σ*跃迁，吸收峰一般出现在真空紫外区，吸收峰低于200nm，实际应用价值不大。
不饱合机化合物的电子跃迁类型为n→π*，π→π*跃迁，吸收峰一般大于200nm。
生色团：是指分子中可以吸收光子而产生电子跃迁的原子基团。
人们通常将能吸收紫外、可见光的原子团或结构系统定义为生色团。
助色团：是指带有非键电子对的基团，如-OH、-OR、-NHR、-SH、-Cl、-Br、-I等，它们本身不能吸收大于200nm的光，但是当它们与生色团相连时，会使生色团的吸收峰向长波方向移动，并且增加其吸收强度。
紫外分光光度法
第4节 紫外分光光度法
• （3）紫外吸收光谱常用吸收曲线来描述。
•
即用一束具有连续波长的紫外光照射
一定浓度的样品溶液，分别测量不同波长下
溶液的吸光度，以吸光度对波长作图得到该
化合物的紫外吸收曲线，即紫外吸收光谱。
•
化合物的紫外吸收特征可以用曲线上
最大吸收峰所对应的最大吸收波长λmax 和
该波长下的摩尔吸光系数εmax 来表示。
远紫外区，而在近紫外光区是透明的， 它们的吸收光谱曲线必须在真空中测定。
（一）紫外吸收光谱的产生
2、价电子的种类及电子跃迁类型：
• ②n → σ* 跃迁
• 含有氧、氮、硫、卤素等杂原子的饱和 烃衍生物都可发生 n → σ* 跃迁，它比 σ → σ* 跃迁的能量要低，吸收波长较长， 一般在150～250 nm范围内。如CH3OH
• 1．生色团和助色团 • ①生色团——含不饱和键基团，有π键 • 含有不饱和键，能吸收紫外可见光，产生
n→π* 或π→π*跃迁的基团称为发色团
• 是指在200～1000nm波长范围内产生特征吸收 带的具有一个或多个不饱和键和未共用电子对 的基团。如
•
C O CC NN C C
CO
COOH
（二）紫外吸收光谱中的有关术语
吸收峰波长
吸收强度 极性溶剂
π→π*
n→π*
与组成双键的
有关
原子种类基本无关
强吸收 104~105 弱吸收 ＜102
向长波方向移动 向短波方向移动
2、价电子的种类及电子跃迁类型：
• 由于一般紫外-可见分光光度计只能提供 190～850nm范围的单色光，因此只能测 量n → π* 跃迁和部分 n → σ* 跃迁、π → π* 跃迁的吸收，而对只能产生200 nm以 下吸收的 σ → σ* 跃迁则无法测量。常见 电子跃迁所处的波长范围及强度如图824所示。
第四章紫外-可见分光光度法
（三）有机化合物的紫外、可见光谱
1. 饱和烃及其取代衍生物 σ→σ*、n→σ* 2. 不饱和烃及共轭烯烃 σ→σ*、π→π* 3. 羰基化合物 n→σ*、π→π*和n→π* 4. 苯及其衍生物 E1带、 E2带、 B带 5. 稠环和杂环
当l以cm，c以mol/L为单位时，k称为摩尔吸 光系数，用ε表示，它比a更为常用，ε的单位 为L mol-1 cm-1，即： A = ε c l
当l以cm，c以百分浓度g/100mL为单位时，k 称为比吸光系数，用A1cm1%表示 ε = 0.1 M A1cm1%
用比吸光系数的表示方法特别适用于摩尔质 量未知的化合物。
（二）配位场跃迁
1. f-f跃迁
镧系和铜系元素的离子对紫外和可见光的吸收是 基于内层f电子跃迁而产生的，其吸收光谱是由一些狭 窄的特征吸收峰组成，且这些吸收峰不易受金属离子 所处的配位环境的影响。
2. d-d跃迁
过渡金属离子的d轨道在受到配位体场的作用时 产生分裂。d电子在能级不同的d轨道间跃迁，吸收紫 外或可见光产生吸收光谱。这种光谱的吸收带比较 宽，吸收峰强烈地受配位环境的影响。
光。
3. 吸收池
功能：盛放分析试样（一般是液体）
4. 检测器 功能：检测光信号，测量单色光透过溶
液后光强度变化的一种装置。 5. 信号显示系统
6. 紫外一可见分光光度计的类型
(1) 单波长单光束分光光度计
缺点：测量结果受电源波动的影响较大， 误差较大。
(2) 单波长双光束分光光度计
一个环外双键
5nm
同环二烯 39nm 一个β烷基 12nm 三个γ+烷基 54nm
紫外分光光度法检测dna最大吸收峰
紫外分光光度法检测dna最大吸收峰
紫外分光光度法是一种常用的DNA定量方法，其原理是利用DNA分子中的嘌呤和嘧啶碱基对紫外光的吸收特性进行测定。
在260nm波长下，DNA分子中的嘌呤和嘧啶碱基对紫外光的吸收最大，因此通常将这个波长作为检测DNA的最大吸收峰。
具体操作步骤如下：
-准备样品：将待测DNA溶液稀释至适当浓度，一般为1-5μg/mL。
-加入试剂：向样品中加入一定量的试剂，如Tris-HCl缓冲液、EDTA等，以维持适宜的反应条件。
-测量吸光度：使用紫外分光光度计测量样品在260nm波长下的吸光度值。
-计算DNA浓度：根据标准曲线或公式计算出样品中DNA的浓度。
需要注意的是，不同来源的DNA可能具有不同的最大吸收峰，因此在实际应用中需要根据具体情况选择合适的波长进行检测。
此外，还需要注意避免污染和误差的产生，以保证检测结果的准确性。
紫外可见分光光度法
T与A的关系
T 100% 50% 25% 10% 1.0% 0.1% 0.01% 0.001% 0%
A 0 0.301 0.602 1.00 2.0 3.0 4.0
5.0
上述说明： T值为0％至100％内的任何值。 A值可以取任意的正数值。
入射光强度 I0
等 条件一定时， E 仅与吸收物质本身的性质有关， 与待测物浓度无关； （3）同一吸收物质在不同波长下的E 值是不同的。在最大 吸收波长λmax处的摩尔吸收系数E max表明了该 吸收物质最大限度的吸光能力，也反映了光度法 测定该物质可能达到的最大灵敏度。
（4）可作为定性鉴定的参数；
（5）物质的吸光能力的度量
? EK2带
B带 R带
苯乙酮的紫外吸收光谱
四、影响吸收带的因素
• 位阻影响 • 跨环效应
共轭系统共平面性↓→共轭效应↓ → max ↓（短移）， ↓
• 溶剂效应 溶剂极性↑→ K带长移，R带短移
• pH影响
max 210.5nm,270nm
235nm,287nm
位阻影响
顺式
反式
二苯乙烯顺反异构体 的紫外吸收光谱
最大处对应的波长称为最大吸收波长λmax。 吸收曲线的形状、λmax及吸收强度等与分子 的结构密切相关。
在吸收曲线上，最大吸收峰所对应的是最大吸收波长 （λmax），为不同化合物的特征波长。吸收曲线的形状是物 质定性的主要依据，在定量分析中可提供测定波长，一般以灵 敏度较大的λmax为测定波长。
峰与峰之间的部位叫谷，该处对应波长为最小吸收波长。 在图谱短波端只呈现强吸收但不成峰的部分称为末端吸收 （end absorption）。
紫外分光光度法
紫外分光光度计检测到)。如甲烷的λ为125nm,乙烷λmax为135nm。
⑵
n→σ ＊跃迁
所需能量较大。吸收波长为150～250nm，大部分在远紫外区，近紫
外区仍不易观察到。含非键电子的饱和烃衍生物(含N、O、S和卤素等杂 原子)均呈现n →σ*跃迁。如一氯甲烷、甲醇、三甲基胺n →σ*跃迁的λ分
Ultraviolet–visible spectroscopy，UV-Vis
华南师范大学生命科学学院 范瑞芳
第一节 紫外—可见吸收光谱的基本概念与原理
一、紫外-可见吸收光谱的基本原理
有机化合物的紫外—可见吸收光谱，是其分子中外层价电子跃迁的结果（三
种）：σ电子、π电子、n电子。 分子轨道理论：一个成键轨道必定 有一个相应的反键轨道。通常外层电 子均处于分子轨道的基态，即成键轨 道或非键轨道上。
外层电子吸收紫外或可见辐射后，就从基态向激发态（反键轨道)跃迁。 主要有四种跃迁所需能量Δ Ε 大小顺序为：n→π ＊ < π →π ＊ < n→σ ＊ < σ →σ ＊
⑴
σ →σ ＊跃迁
所需能量最大，σ电子只有吸收远紫外光的能量才能发生跃迁。饱 和烷烃的分子吸收光谱出现在远紫外区(吸收波长λ<200nm，只能被真空
三、吸光系数
当l以cm，c以g/L为单位，κ称为吸光系数，用 a表示。
A= a cl a的单位为L/(g.cm)
朗伯—比耳定律只适用于稀溶液。
四、偏离朗伯-比耳定律的因素
（1）入射光为非单色光
难以获得真正的纯单色光。 朗—比耳定律的前提条件之一是入射光为 单色光。 分光光度计只能获得近乎单色的狭窄光带。 复合光可导致对朗伯—比耳定律的正或负偏离。 非单色光、杂散光、非平行入射光都会引起 对朗伯—比耳定律的偏离，最主要的是非单色光 作为入射光引起的偏离。
紫外-分光光度法原理知识讲解
紫外-分光光度法原理紫外分光光度计的使用原理和方法紫外-可见分光光度法(ultraviolet-visible spectrophotometry, UV-VIS)1定义：它是利用物质的分子或离子对某一波长范围的光的吸收作用，对物质进行定性分析、定量分析及结构分析, 所依据的光谱是分子或离子吸收入射光中特定波长的光而产生的吸收光谱。
2分类：按所吸收光的波长区域不同：分为紫外分光光度法和可见分光光度法，合称为紫外-可见分光光度法。
3、紫外-可见分光光度法的特点：（1) 其仪器设备和操作都比较简单，费用少，分析速度快;（与其它光谱分析方法相比）（2）灵敏度高;（3）选择性好;（4）精密度和准确度较高;（5）用途广泛。
§1. 紫外-可见吸收光谱1. 物质对光的选择性吸收物质对光的吸收是选择性的，利用被测物质对某波长的光的吸收来了解物质的特性，这就是光谱法的基础。
通过测定被测物质对不同波长的光的吸收强度（吸光度），以波长为横坐标，吸光度为纵坐标作图，得出该物质在测定波长范围的吸收曲线。
在吸收曲线中，通常选用最大吸收波长λmax进行物质含量的测定。
2.有机化合物的紫外-可见吸收光谱2.1 有机化合物的电子跃迁与紫外-可见吸收光谱有关的电子有三种，即形成单键的σ电子、形成双键的π电子以及未参与成键的n电子。
跃迁类型有：σ→σ*、n→σ* 、π→π *、 n→π * 四种。
饱合有机化合物的电子跃迁类型为σ→σ*，n→σ*跃迁，吸收峰一般出现在真空紫外区，吸收峰低于200nm，实际应用价值不大。
不饱合机化合物的电子跃迁类型为n→π*，π→π*跃迁，吸收峰一般大于200nm。
生色团：是指分子中可以吸收光子而产生电子跃迁的原子基团。
人们通常将能吸收紫外、可见光的原子团或结构系统定义为生色团。
助色团：是指带有非键电子对的基团，如-OH、-OR、-NHR、-SH、-Cl、-Br、-I等，它们本身不能吸收大于200nm的光，但是当它们与生色团相连时，会使生色团的吸收峰向长波方向移动，并且增加其吸收强度。
第七章 紫外分光光度法
3)吸收池(样品池)(Cell，Container)：
吸收池放置各种类型的吸收池（比色皿）和相应的池 架附件。吸收池主要有石英池和玻璃池两种。 在紫外区须采用石英比色皿，可见区一般用石英比色 皿和玻璃池比色皿。
4)检测器
利用光电效应将透过吸收池的光信号变成可测的电 信号，常用的有硒光电池、光电管或光电倍增管。
式中:
Ｅ为光的能量；
γ为频率；
λ为波长；
h为普朗克常数，6.6256×10-27尔格· 秒；
c为光速。
§2 紫外-可见光分光光度法
基于物质的分子对可见和紫外区域辐射的吸收
而进行分析的方法,广泛用于无机物和有机化合物
的定性、定量分析。
紫外-可见吸收光谱波长范围
(1)远紫外光区(真空紫外区): (2)近紫外光区: (3)可见光区:
取代基 -SR 红移距离 45(nm) -NR2 40(nm) -OR 30(nm) -Cl 5(nm) CH3 5(nm)
3. 共轭双烯
在不饱和烃类分子中，当有两个以上的双键 共轭时，随着共轭系统的延长， *跃迁的吸收
带 将明显向长波方向移动，吸收强度也随之增强
。共轭双键愈多，红移愈显著，甚至产生颜色。
短移:使吸收峰向短波长移动的现象称为短移或蓝移 （blue shift），引起蓝移效应的基团称为向蓝基 团。
2.4 分子结构与紫外吸收光谱
1. 饱和烃化合物
饱和烃类化合物只含有单键（σ键），只能产 生σ→σ* 跃迁，由于电子由σ被跃迁至σ*反键所 需的能量高，吸收带位于真空紫外区，如甲烷和乙 烷的吸收带分别在125nm和135nm。
定义:不饱和度是指分子结构中达到饱和所缺一价元素的“对”数。 如：乙烯变成饱和烷烃需要两个氢原子，不饱和度为1。 计算：若分子中仅含一，二，三，四价元素(H，O，N，C)，则可 按下式进行不饱和度的计算：
紫外可见分光光度法
紫外－可见分光光度法
第一节 紫外-可见吸收光谱 第二节 朗伯-比尔定律 第三节 紫外－可见分光光度计 第四节 分析条件的选择
第五节 测定方法
概
述
紫外可见分光光度法(Ultraviolet-Visible Spectrophotometry)，又称:紫外-可见分子 吸收光谱法(Ultraviolet-Visible Molecular Absorption Spectrometry)是利用被测物质 对光的吸收特征和吸收强度对物质进行定 量和定性的分析方法。
形成的溶液具有良好的化学和光化学稳定性；
在样品的吸收光谱区无明显吸收；
如果要与标准品的吸收光谱相比较，须用相同的溶剂。
5．pH值的影响
很多化合物都具有酸性或碱性可解离基团，在不同 pH的溶液中，分子的解离形式可能发生改变，其 吸收光谱的形状、λmax和吸收强度可能不一样。
OH O-
OHH+
λmax 210.5nm ,270nm
完全透过
无色
吸收黄色光
2014-12-23
蓝色
13
课堂互动
1．紫外-可见光的波长范围是 A．200~400nm B．400~780nm C．200~780nm D．360~800nm 2．下列叙述错误的是 A．光的能量与其波长成反比 B．有色溶液越浓，对光的吸收也越强烈 C．物质对光的吸收有选择性 D．光的能量与其频率成反比
2mg/ml的溶液，在1cm吸收池中，于310nm处测
定吸光度A。规定A≤0.05。
(三)、结构分析
有机化合物的紫外吸收光谱 可以推定分子骨架，判断发色团之间的共轭关系
和估计共轭体系中取代基的种类、位置和数目 。
1.饱和碳氢化合物 只产生ơ→ơ*跃迁，所需能量很大， 200－400nm没有吸收，常作为溶剂。
中国药典版紫外分光光度法讲义优秀
• 肩峰或吸收谷处的吸光度测定受波长变动影响也较小，有时也可用谷 值、肩峰值与峰值同时作鉴别依据。（比如甲硝唑片的第三个鉴别就 是分别在277 nm和241 nm的波长处分别测最大吸收和最小吸收。）
• 具有不同吸光基团的化合物可有相同的最大吸收波长，但它们的摩尔 吸光系数常有明显的差别，所以摩尔吸光系数常用于分子结构分析中 吸光基团的鉴别。对于分子中含有相同吸光基团的物质，他们的摩尔 吸光系数常很接近，但可因相对分子质量不同，使百分吸光系数的值 差别较大，可以用百分吸光系数作为鉴别的依据。（比如结构相似的 甲基睾丸酮和丙酸睾丸素在无水乙醇中的最大吸收波长λmax都在 240nm，但在该波长处的E1%1cm数值，前者为540，而后者为460， 因而有较大的鉴别意义）。
• 紫外光谱是物质在200～400 nm的近紫外 光区和400～850 nm的可见光区的吸收光 谱。通常使用的紫外－可见分光光度计的 工作波长范围为190～900nm,本法在药品 检验中主要用于药品的鉴别、检查和含量 测定。适用于微量和痕量组分的分析，测 定灵敏度可达到10-4～10-7g/ml或更低范围。
处的吸收度与浓度之间是线性关系。因此 只要选择适宜的波长测定溶液的吸光度， 就可以求出其浓度。通常应选择被测物质 吸收光谱的吸收峰处，以提高灵敏度并减 少测量误差，被测物质如有几个吸收峰， 可选不易有其他物质干扰的较高吸收峰， 一般不选光谱中末端吸收峰。
中国药典版紫外分光光度法讲义优秀
• 单组分物质的含量测定 • 就是物质有单一成份构成，常用的测定法
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第二节 原理
• 紫外分光光度法之所以能成为一种分析方 法，主要依据两点：
• 一、就是我们常说的吸收度，2005年版药 典已将它改为吸光度，这样说可能更准确 些。就是物质对光的吸收程度。我们首先 说一下电磁波，所有电磁波在性质上都完 全相同的，他们之间的区别仅在于波长或 频率的不同。
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下面分别讨论n→σ*，π→π*和n→π*的跃迁。
1、n→σ*的跃迁
n→σ*跃迁需要的能量比σ→σ*小，相应的吸收波长在200nm附近。当饱和碳氢化合物中的H被含有n电子的N，O，S和X（F,Cl,Br,I）等杂原子取代时，将发生n→σ*跃迁，因此在较长波长处比相应的饱和碳氢化合物多一个吸收带。在有些有机化合物中，由取代反应而引入的含有未共享电子对的杂原子基团，如-NH2，-NR2，-OH，-OR，-SH，-F,-Cl，- Br,-I等后，使吸收峰的波长向长波方向移动，这种效应称为红移效应。这种能使吸收波长红移，并使吸收强度增加的杂原子基团称为助色团。一般n→σ*跃迁的摩尔吸收系数较小。如水、醇和醚等在紫外可见光谱分析中可以作为溶剂。
仪器药品：
UV-2550可见紫外分光光度计，石英比色皿，滤纸，漏斗，100ml容量瓶，无水乙醇，醋酸地塞米松片。
教学方法：讲授、演示
教学时数：4学时
教学过程：（教师授课思路、设问及讲解要点）
一、实验原理
分子和原子一样，也有它的特征能级。分子内部的运动可以分为价电子运动，分子内原子在平衡位置附近的振动和分子绕其重心的转动。因此子具有电子（价电子）能级、振动能级和转动能级。
七、思考题
1、紫外分光光度法分析的原理是什么？
2、哪些物质能够用紫外分光光度法分析？
3、如何对物质的含量进行分析？
八、教学后记
实验题目：紫外分光光度法
测定醋酸地塞米松的含量
教学目标：
1、了解可见紫外分光光度计的基本结构及操作步骤。
2、学习可见紫外分光光度法的测定物质含量的原理和方法。
3、掌握药物标示量的计算方法。
教学重点：
学习可见紫外分光光度法的测定物质含量的原理和方法。
教学难点：
了解可见紫外分光光度计的基本结构及操作步骤。
2、π→π*和n→π*的跃迁
有机化合物中由π→π*和n→π*产生的吸收带最有用，它们的吸收峰在近紫外区或可见光区。由吸收带波长可以预测未知有机化合物的某些官能团或由有机化合物的结构推算最大吸收波长λmax。
含有π电子的基团，如双键或三键，会发生π→π*跃迁。含有未共享n电子对的N，O，S及卤素等基团会发生n→π*跃迁。发生这两种跃迁的分子中需要有不饱和键，以提供π*。在许多有机化合物中往往同时含有n电子和π电子，可以同时发生π→π*和n→π*跃迁，π→π*跃迁的几率比n→π*大，吸收带强度大。一些具有不饱和键和含有孤对电子对的基团，能对200nm以上的光产生吸收，这种基团称为生色团。通常π电子体系是紫外和可见的生色团，σ电子是远紫外的生色团。
由以上分析可知,几乎所有的有机分子的紫外-可见吸收光谱都是由于π→π*和n→π*跃迁所产生的。因此这两种跃迁在紫外-可见光区对于样品的定性和定量分析应用很广泛。
醋酸地塞米松（又名醋酸氟美松）为甾体激素类药物。临床上主要用于治疗风湿热、类风湿性关节炎、红斑狼疮和白血病以及湿疹、皮炎等疾病。其分子结构（见图2）为环戊烷骈多氢菲的甾体母核结构，由于该药物结构中有3-酮基和两个双键共轭，因此该药物在特定波长处具有特定的紫外吸收，可以根据最大的紫外吸收对其特定的结构进行鉴定，同时在最大波长吸收处可以进行定量分析。定量分析根据朗伯-比尔定律：
6、再在最大吸收波长范围附近确定吸收波长范围，扫描测定其吸光度，保存数据；
7、打印图表，关闭仪器电源。
8、按吸收系数法计算本品的含量，计算公式如下
式（2）中：
A为样品吸光度；
W为平均片重（g/片）；
M为称样重量（g）；
标示量为0.75mg/片；
E为醋酸地塞米松（C24H31FO6）的吸收系数，按354计算。
五、数据处理
1、指出醋标示量%，应为90.00%-110.00%。
六、注意事项
1、实验过程由于片剂的赋形剂不溶于乙醇，供试品溶液需要经过过滤、稀释后再测定。
2、实验完毕，应将比色皿从样品池中取出，并清洗干净。
3、比色皿透光面应用擦镜纸沿着一个方向擦。
四、实验步骤
(一)样品溶液的配制
1、取本品10片，精密称定，研细，再精密称取0.4g（约醋酸地塞米松7.5mg）,置50ml量瓶中，加乙醇35ml，超声溶解20分钟，放冷至室温；
2、加乙醇稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液10 ml，置另一50ml量瓶中，加乙醇稀释至刻度，摇匀，待用。
(二)样品的测定
A = ε bc式（1）
式（1）中：
A为吸光度，ε为吸收系数，b为吸收池厚度，c为样品浓度。
二、紫外分光光度计的组成
紫外分光光度计主要由光源、单色器、样品池、检测器和记录装置及计算机组成。
三、仪器与药品
1、仪器：UV-2550紫外分光光度计，石英比色皿，滤纸，漏斗，100ml容量瓶。
2、药品：无水乙醇，醋酸地塞米松片。
σ*〉π*〉n〉π〉σ
如图所示：
在大多数有机化合物分子中，价电子总是处在n轨道以下的各个轨道中，当受到光照射时，处在较低轨道能级的电子将跃迁至较高能级。由图可见，可能的跃迁有σ→σ*，σ→π*，π→σ*，n→σ*，π→π*，n→π*等六种，其中σ→σ*、σ→π*和π→σ*跃迁需要的能量大，因此产生这三种跃迁所吸的光波长小于200nm,位于远紫外光区，对它们的紫外-可见吸收光谱研究得较少，同时它们在紫外-可见光区无吸收带，所以在紫外-可见吸收光谱分析中常用作溶剂。如戊烷、己烷、环己烷等。
1、依次打开电脑电源，分光光度计电源，在桌面上双击UV-Probe图表，输入密码；
2、等待仪器自检查，所有自检项目完成通过后，点击“确定”，再点击“基线”，进行基线校正；
3、将样品池和参比池均放上空白，点击“自动调零”。
4、将样品池换上样品，选择“编辑”中的“方法”，建立数据采集的方法；
5、然后再在200nm-400nm范围内扫描，确定最大吸收波长，保存数据；