Chapter 6_酶的非水相催化(下)

渗透蒸发法
通过均一的非多孔膜来实现体系中水的转移。
✓ 可以连续除去反应过程中生成的水，从而使反应平衡 向合成方向移动；
✓ 适用于大规模生产。
水合盐对法
向反应体系中直接加入水合盐以控制体系水 含量。
✓ 一种水合盐可对应得到一个特定的水蒸气压，不同的水合盐对 产生相应的水含量。
✓ 由水合盐与其无水形式的盐对可以对体系中的Aw起缓冲作用。
➢ 溶剂和底物性质对酶活性也有直接或间接的影响，底物对 水也有强的吸附作用。
➢ 有研究表明溶剂的极性：由己烷变成戊醇时，最佳水活度 与溶剂的极性几乎无关，大约在0.55左右
（2）酶结构不同，维持酶构象所需水量也不同
① 大部分酶需要较高的水活度才能表现出较好的活性HPO4 ➢ 当反应进行到一定程度，体系中积累足够多的水时
Na2HPO4+2H20
Na2HPO4·2H20
体系中的盐以Na2HPO4/Na2HPO4·2H20盐对的形式存在。
水合盐对法
➢ 随着体系中水的积累，无水盐不断转化为二水盐，在全 部转化之前体系Aw不变。
水活度(Aw)
有机介质中的水主要有两类
✓ 结合水：与酶分子紧密结合 ✓ 游离水：溶解在有机溶剂中
有机介质体系中，结合水是影响酶催化活性的关键因素，而 水含量却受到酶分子以外的各种因素影响。
✓ 酶的催化活性随着结合水量的增加而提高。 ✓ 结合水量不变时，水含量的变化对酶的催化活性影响不大。
为了更为确切地反映水与酶催化活性的关系，用水活度(Aw) 来描述水对酶催化特性的影响。
✓ 水的加入可削弱这种相互作用，使非活性的“封闭”结构变 得“疏松”，酶分子的柔韧性增加，并通过非共价作用力来 维持酶的催化活性构象，与酶分子紧密结合的一层左右的水 分子，对酶的催化活性是至关重要的（必需水）。
✓ 不同酶与必需水结合紧密程度及所结合的必需水数量是不同 的。
水在酶催化反应中发挥着双重作用
✓ 一方面可以通过调节含水量，影响酶的水化程度及物理状态， 使酶根据需要表现出不同的催化活性；
✓ 另外还可以通过改变体系中的Aw而改变反应的平衡点。
➢ 体系中水含量的控制方法
1、添加法
✓ 直接加水法 ✓ 预平衡法
2、去除法
✓ 敞口自由挥发法 ✓ 通惰性气体或干燥空气带走反应中产生的水 ✓ 渗透蒸发法 ✓ 水合盐对法
➢ Aw定义：
在一定的温度和压力下，反应体系的水蒸气压和 纯水的蒸气压之比，直接反应了酶分子上水的多少， 与其他因素无关。
即：Aw=P/Po
P：在一定温度和压力下反应体系中水的蒸气压； Po ：在相同条件下纯水的蒸气压。
➢ 当体系达到平衡态时，体系中各部分的Aw值相等。
➢ 鉴于水在有机介质酶促反应中的重要作用，可通过体系中 含水量的不同，使反应向着所期望的方向发展。
直接加水法
在反应的初期向反应体系中添加适量的水 （最早和最普遍采用）。
✓ 对反应过程中没有水产生的体系非常适用 ✓ 对副产物为水的体系不适合：
如脂肪酶和蛋白水解酶等在非水介质中分别催化酯合成和 肽合成反应，随着反应的进行不断产生水并且进入反应体 系。
预平衡法
(1) 将酶、底物和溶剂分别在饱和盐溶液形成的气相环境中 进行预平衡；
Chapter 6 酶非水相催化（下）
6.3 有机介质反应体系影响因素
1、反应体系中水对酶催化反应的影响 2、反应体系中有机溶剂对酶催化反应的影响
1、水对酶催化反应的影响
所以酶在有机介质中进行催化反应时，水是不可缺少的成 分之一。
一般蛋白酶都溶于水，只有在一定量的水存在的条件下，酶 分子才能进行催化反应。
讨论：水活度对酶活性的影响
（1）通常最佳水含量随着溶剂极性增加而增加 （2）酶的结构不同，维持该酶的活性构象所需的水量也不同 （3）酶中水的位置也要正确 （4）酶活性位点的运动性随着水的加入显著增加 （5）蛋白质分子的极性和带电基团的水合作用对于酶的催化
是必要的
(1) 最佳水含量随溶剂极性增加而增加
➢ 当无水盐全部转化为二水盐后，水的进一步产生和积累 会引起体系Aw的提高。（ Na2HPO4·2H20 ）
➢ 直至水的量足以使二水盐转化为七水盐，
Na2HPO4·2H20 + 5H20
Na2HPO4·7H20
体系中的盐以Na2HPO4·2H20/Na2HPO4·7H20盐对的形式存在， 体系Aw将维持在另一水平。
(2) 水是导致酶的热失活的重要因素，有水存在时，随着温度 的升高酶分子会发生以下变化而失活。
① 形成不规则结构 ② 二硫键受到破坏 ③ 天冬酰胺和谷氨酰胺水解转化为相应的天冬氨酸和谷氨酸 ④ 天冬氨酸肽键发生水解
因此，在有机介质的酶催化体系中，存在着最佳含水量。 该值不仅取决于酶的种类和选用的有机溶剂。
有机介质中水含量的多少对酶的空间构象、催化活性、稳 定性、催化反应速度等都有密切关系；
水还与酶催化作用的底物和反应产物的溶解度有关。
水在酶催化反应中发挥着双重作用
(1) 水分子直接或间接地通过氢键、疏水键及范德华力等非 共价键相互作用来维持酶的催化活性所必需的构象。
✓ 无水条件下酶分子的带电基团和极性基团之间相互作用，形 成一种非活性的“封闭”结构；
敞口自由挥发法
向反应体系中通惰性气体或干燥空气来带走反应 过程中产生的多余的水。
➢ 特点：
✓ 若反应体系中有机溶剂更容易挥发，不宜采用； ✓ 不容易准确控制体系的水含量，操作过程并不要求除
掉体系中所有的水，而是控制体系水含量稳定在一个 非常狭小的范围内。 ✓ 体系中的反应介质和底物也可能被带走； ✓ 浪费能源、成本高。
(2) 不同的饱和盐溶液对应不同的蒸气压，将酶与盐的饱和 溶液平衡，同时将含有底物的溶剂平衡至相同的Aw， 然后混合进行反应。
预平衡法
注意：在反应过程中Aw是否维持恒定。
➢ 会引起Aw改变的情况：
① 反应过程中产生或消耗水； ② 溶剂化作用和相行为（相平衡引起）。
由相平衡导致的Aw的改变较为复杂。 只有当水在两相之间及两者混合物中的活度系数有严 格的相关性时， Aw在混合前后才会保持不变，否则，将 分别进行预平衡的底物和溶剂相混合时Aw会发生改变。