Westernblot实验技术培训课件
合集下载
western-blotting(蛋白免疫印迹)PPT课件
.
20
膜的选择
1. PVDF膜（polyvinylidene fluoride）是蛋白质印迹 法中常用的一种固相支持物。
2. PVDF膜是疏水性的，膜孔径有大有小，随着膜孔 径的不断减小，膜对低分子量的蛋白结合就越牢固。 大于20KD的蛋白选用0.45um的膜，小于20KD的 蛋白选用0.2um的膜。
1.含HRP的抗体； 2.发光试剂； 3.反应的杂质;
.
27
洗脱抗体
一抗洗脱 二抗洗脱 一抗种属来源不同时，strip二抗即可
.
28
三、显色
暗室曝光 Tanon 5200 全自动化学发光图像分析系统
.
29
Tanon 5200---性能特点
适用于高分辨率和高灵 敏度的图像拍摄；
可设定连续采样的次数、 起始及终止曝光时间， 进行动态连续拍摄，拍 摄得高质量的图片；
在裂解液中加入合适的蛋白酶抑制剂，避免蛋白降解，从而保证检测的准
确性！ .
7
蛋白样品的制备
① SDS是一种很强的阴离子表面活性剂，它可以断开分子内和分 子间的氢键,破坏蛋白质分子的二级和三级结构。
② 强还原剂巯基乙醇（或二硫苏糖醇，DTT）可以断开二 硫键，破坏蛋白质的四级结构。使蛋白质分子被解聚 成肽链形成单链分子。解聚后的侧链与SDS充分结合形 成带负电荷的蛋白质-SDS 胶束。
对
电转仪长期使用导致海绵变薄，
策
“三明治”结构不紧凑导致。
确保膜和胶块之间没有气泡
缓冲液中离子浓度太低，电流或电
压太高。转膜过程注意降温
.
34
四、SDS-PAGE常见问题
背景太高
原因
1. 膜没有均匀浸湿 2. 膜或者缓冲液污染 3. 封闭不充分 4. 抗体与封闭剂出现交叉
Westernblot实验技术培训课件
5. 抗体浓度过高
4. 杂交前检测一抗、二抗的
工作浓度
Westernblot实验技术
24
没有阳性条带或比较弱
原 1. 抗体染因色不充分
2. 靶蛋白含量太低 3. HRP抑制剂 4. 转膜时间不够 5. 曝光时间过短
1. 增加抗体滴度，延长孵育
时间
2. 增加样本上样量
对 3. 所用溶液和容器中避免含
Westernblot实验技术
21
条带比正常的窄？
“微笑”或“倒微笑” 条带？
➢ 凝胶聚合不均匀，灌胶时候尽量混合 均匀，动作轻缓
➢ 拔梳子要迅速，清洗加样孔要小心， 以免把上样带扭曲
➢ 样品盐浓度过高会挤压其他条带导致 宽窄不一，纯化样品，调整盐浓度
➢ 胶板底部有气泡会影响电泳效果，应 赶走气泡。同时注意电泳槽装置是否 合适
快速、特异，信号弱、昂贵 Westernblot信实验号技术强、二抗选择多，非特异性结合3
Western Blot一般流程
蛋白样品的制备
SDS聚丙烯酰胺 凝胶电泳
转膜 封闭 一抗杂交 二抗杂交 底物显色
Westernblot实验技术
4
蛋白样品的制备
Westernblot实验技术
5
裂解液
➢ 只能识别非变性的抗原表位的抗体，不能选择SDS及强去污剂的裂解液 ➢ 研究蛋白之间相互作用，应选择温和非变性裂解液 ➢ 对于难溶解蛋白，应选用裂解强度更高的裂解液（如RIPA, SDS)
Westernblot实验技术
29
Western Blot基本原理
在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种 固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测。
快速、特异，信号弱、昂贵 Westernblot信实验号技术强、二抗选择多，非特异性结合30
westernblot详解PPT课件
蛋白质Marker
➢主要目的是确定靶蛋白的分子量大小； 使用预染的Marker还可以实时检测电泳 分离情况，并可以转移到膜上。
Fermentas
Prestained protein ladders Unstained protein ladders
第29页/共53页
上样缓冲液 Loading buffer
第6页/共53页
第7页/共53页
一 配分离胶
准备物品： 玻璃板 洗衣粉 灌胶架 移液枪 两个烧杯（ 1 ml 200ul 20ul） 30%Acrylamide 1M （4度冰箱）， Tris-HCL 溶液（ PH=8.8）， ddH2O 10%AP （-20冰箱） ， TEMD（4度 ） ，SDS（常温） 1 清洗玻璃板： 一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸洗衣粉轻轻擦 洗。两面都擦洗过后用自来水冲，再用ddH2O冲洗干净后立在 通风处或烘箱中 2 配制分离胶： 玻璃板对齐后放入夹中加紧，注意使两玻璃板对齐。然后垂直卡 在架子上准备灌胶。 先配制分离胶。配方如下：
1.将200mg组织块剪碎，置于1ml裂解液中（
5ml离心管）。
2.匀浆器进行匀浆，注意冰上操作，匀浆后置于
冰上。
3.10，000g ,4℃,10min,（5ml管）离心
4.取上清至1.5ml管，12，000g ,4℃,60min,
离心
5.取上清至新1.5ml管,-80℃储存
第22页/共53页
3·1·2 蛋白样品浓度的测定方法
第18页/共53页
3·1 固定
①用ddH2O水冲洗一下玻璃板，将其放入电 泳槽中。注意，小玻璃板面向内，大玻璃板 面向外。
②向电泳槽中加入1x电泳液
• 5X电泳液缓冲液 ③Tr拔is（掉M梳W子1，2注1.1意4动）作轻柔。
《westernblot讲解》PPT课件
K和ɑ为常熟，de为蛋白质移动距离，do为小 分子示踪物的移动距离。
22
精选课件ppt
TEMED即N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine 中文名字是N,N,N',N'-四甲基二乙胺。 用于配制PAGE胶等。TEMED可以催化过硫酸铵
从而产生自由基，从而加速丙烯酰胺凝胶的聚 合。 注意事项： 易燃，有腐蚀性，请注意防护。 易挥发，使用后请盖紧瓶盖。 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性 手套,戴口罩操作。
24
精选课件ppt 25
19
精选课件ppt 20
图像分析
精选课件ppt
将胶片扫描或拍照，用凝胶图像处理系统分析 目标带的分子量和净光密度值。
21
注释
精选课件ppt
SDS为十二烷基硫酸钠，它是一种阴离子表面 活性剂，与蛋白质结合成复合物，使不同的蛋 白质带上相同离子的负电荷，从而消除蛋白质 之间原有的电荷差异。SDS为一种变性剂，能 破坏蛋白质分之中的氢键和疏水键、巯基乙醇 能打开二硫键。蛋白质在电泳中的迁移率D和 分子量M成对数关系。IgM=K-ɑde/do=K-ɑD
试剂。
8
精选课件ppt
仪器：电转移装置（实验室为Bio-Rad公司装 置） 高压锅、玻璃匀浆器、高速离心机、分 光光度仪、-20℃低温冰箱、垂直板电泳转移 装置、恒温水浴摇床、多用脱色摇床。
9
样品制备
精选课件ppt
样品制备包括单层贴壁细胞总蛋白的提取、组 织总蛋白的提取、加药物处理的贴壁细胞总蛋 白的提取。
含量测定
电泳
转膜
免疫反应
化学发光
图像分析
7
试剂及仪器准备
22
精选课件ppt
TEMED即N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine 中文名字是N,N,N',N'-四甲基二乙胺。 用于配制PAGE胶等。TEMED可以催化过硫酸铵
从而产生自由基，从而加速丙烯酰胺凝胶的聚 合。 注意事项： 易燃，有腐蚀性，请注意防护。 易挥发，使用后请盖紧瓶盖。 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性 手套,戴口罩操作。
24
精选课件ppt 25
19
精选课件ppt 20
图像分析
精选课件ppt
将胶片扫描或拍照，用凝胶图像处理系统分析 目标带的分子量和净光密度值。
21
注释
精选课件ppt
SDS为十二烷基硫酸钠，它是一种阴离子表面 活性剂，与蛋白质结合成复合物，使不同的蛋 白质带上相同离子的负电荷，从而消除蛋白质 之间原有的电荷差异。SDS为一种变性剂，能 破坏蛋白质分之中的氢键和疏水键、巯基乙醇 能打开二硫键。蛋白质在电泳中的迁移率D和 分子量M成对数关系。IgM=K-ɑde/do=K-ɑD
试剂。
8
精选课件ppt
仪器：电转移装置（实验室为Bio-Rad公司装 置） 高压锅、玻璃匀浆器、高速离心机、分 光光度仪、-20℃低温冰箱、垂直板电泳转移 装置、恒温水浴摇床、多用脱色摇床。
9
样品制备
精选课件ppt
样品制备包括单层贴壁细胞总蛋白的提取、组 织总蛋白的提取、加药物处理的贴壁细胞总蛋 白的提取。
含量测定
电泳
转膜
免疫反应
化学发光
图像分析
7
试剂及仪器准备
western blot技术 ppt课件
•
PPT课件
14
实验步骤
• 一抗杂交孵育 将一抗用含5%脱脂奶粉的 1×TBST溶液稀释，使抗体浓度为1:1000；将封 闭过的膜放在一抗稀释液中，4度过夜；而后吸 弃一抗稀释液，用1×TBST洗3次，每次5min。 二抗孵育 二抗杂交孵育：将辣根过氧化物酶连接的二抗 用含5%脱脂奶粉的1×TBST溶液稀释，使浓度为 1:2000，并加入辣根过氧化物酶连接的抗生物 素抗体（浓度为1:1000），将膜置于二抗稀释 液中，室温振荡孵育1h；而后吸弃二抗稀释液， 用1×TBST洗3次，每次5min。
PPT课件
7
仪器与设备
• • • • • • 低温超速离心机（Eppendorf公司） 分光光度计（Eppendorf公司） Thermomixer（Eppendorf公司） 电泳仪（Bio-Rad 公司） 垂直式电泳槽（Bio-Rad 公司） 硝酸纤维素膜电转系统（Bio-Rad 公司）
PPT课件
Western-blot 试验技术
PPT课件
1
概论
• 它结合了凝胶分辨力高和固相免疫测定的特异敏 感等多种优点，与免疫沉淀法比较，这种方法无 需对靶蛋白进行同位素标记。几乎总在变性条件 下进行，可以避免溶解、聚集以及靶蛋白与外来 蛋白的共沉淀等诸多问题。 • 具有从混杂抗原中检测出特定抗原，或从多克隆 抗体中检测出单克隆抗体的优越性，还可以对转 移到固相膜上的蛋白质进行连续分析，具有蛋白 质反应均一性，固相膜保存时间长等优点。 • 被广泛地用于蛋白质研究，基础医学和临床医学 的研究。
主要试剂
• • • • • • • • • • • • RIPA（华舜公司） 苯甲基磺酰氟PMSF（华舜公司） 丙烯酰胺（Amresco公司） 双丙烯酰胺（Amresco公司） 丽春红染料（华舜公司） Tween 20（Amresco公司） 过硫酸铵（Sigma公司） 四甲基乙二胺TEMED（Sigma公司） 硝酸纤维素膜（Amersham公司） 考马斯亮兰（Fluka公司） 兔抗大鼠Glut 1多克隆抗体（Santa Cruz公司） Phototope-HRP Western Blot Detection System（Cell Signaling Technology公司）
免疫印迹法的实验技术培训课件
❖ 目前实验室测蛋白浓度都用试剂盒，如BCA法试 剂盒.
免疫印迹法的实验技术
13
BCA法工作原理
❖BCA(bicinchoninic acid 二辛可酸)法测定蛋白 质的原理与Lowery法相似。即在碱性环境下蛋白 质分子中肽键结构与Cu2+络合并将Cu2+还原 成Cu1+。BCA特异地与Cu1+结合形成稳定的 紫蓝色复合物，在562 nM处有最大光吸收值并 与蛋白质浓度成正比，颜色的深浅与蛋白质的含 量成正比，可以根据吸收值测定蛋白质浓度。该 测定方法灵敏度高，操作简单，试剂及其形成的 颜色复合物稳定性俱佳，并且受干扰物质去垢剂 等影响小。
↓ 电泳至溴酚兰行至电泳槽下端停止 免疫印迹法的实验技术
实验步骤
夹心式垂直电泳槽
20
蛋白变性的原因
❖上样蛋白为蛋白样本和上样缓冲液的混合 物，按比例配制，100℃煮5min。
❖其目的是将SDS 与蛋白质充分结合，以使 蛋白质完全变性和解聚，并形成棒状结构 同时使整个蛋白带上负电荷。
免疫印迹法的实验技术
免疫印迹法的实验技术
11
蛋白浓度的测定 原因：
❖Western Blot作为一项半定量实验技术， 电泳前，必须对不同的样品进行总蛋白含 量测定。
❖蛋白质总量不足可能妨碍对目的蛋白的鉴 定; 蛋白质含量太高则会使带形扭曲,甚至 会影响此电泳方法的分辨力。
免疫印迹法的实验技术
12
方法：
❖ 目前常用的有五种经典的方法，即定氮法、双缩 脲法（Biuret法）、Folin－酚试剂法（Lowry 法）、紫外吸收法以及考马斯亮蓝法Bradford 法）。
免疫印迹法的实验技术
5
实验用途
❖用于检测样品中特异性蛋白质是否存 在。
免疫印迹法的实验技术
13
BCA法工作原理
❖BCA(bicinchoninic acid 二辛可酸)法测定蛋白 质的原理与Lowery法相似。即在碱性环境下蛋白 质分子中肽键结构与Cu2+络合并将Cu2+还原 成Cu1+。BCA特异地与Cu1+结合形成稳定的 紫蓝色复合物，在562 nM处有最大光吸收值并 与蛋白质浓度成正比，颜色的深浅与蛋白质的含 量成正比，可以根据吸收值测定蛋白质浓度。该 测定方法灵敏度高，操作简单，试剂及其形成的 颜色复合物稳定性俱佳，并且受干扰物质去垢剂 等影响小。
↓ 电泳至溴酚兰行至电泳槽下端停止 免疫印迹法的实验技术
实验步骤
夹心式垂直电泳槽
20
蛋白变性的原因
❖上样蛋白为蛋白样本和上样缓冲液的混合 物，按比例配制，100℃煮5min。
❖其目的是将SDS 与蛋白质充分结合，以使 蛋白质完全变性和解聚，并形成棒状结构 同时使整个蛋白带上负电荷。
免疫印迹法的实验技术
免疫印迹法的实验技术
11
蛋白浓度的测定 原因：
❖Western Blot作为一项半定量实验技术， 电泳前，必须对不同的样品进行总蛋白含 量测定。
❖蛋白质总量不足可能妨碍对目的蛋白的鉴 定; 蛋白质含量太高则会使带形扭曲,甚至 会影响此电泳方法的分辨力。
免疫印迹法的实验技术
12
方法：
❖ 目前常用的有五种经典的方法，即定氮法、双缩 脲法（Biuret法）、Folin－酚试剂法（Lowry 法）、紫外吸收法以及考马斯亮蓝法Bradford 法）。
免疫印迹法的实验技术
5
实验用途
❖用于检测样品中特异性蛋白质是否存 在。
western blot原理及操作方法ppt课件
常见问题
8.二抗的选择根据一抗的种属来源，如：一抗是兔抗大鼠目 的蛋白的抗体，则二抗应选择山羊或其他来源抗兔的抗体， 而且二抗要标记有同位素或酶。 9.条带两边扩散：加样量过多 10.条带两边高，中间凹 原因：凝胶不均匀冷却，中间冷却不好; 电泳系统温度偏 高
常见问题
11.条带呈皱眉状，中间高，两边低 原因：可能是由于装置不合适，特别可能是凝胶和玻璃挡 板底部有气泡，或者两边聚合不完全 12.条带有拖尾现象 原因：样品溶解不好 13.混合搅拌速度时不宜太快，容易产生气泡影响聚合，导致 电泳带畸形。 太慢不均匀，特别是甘油
常见问题
3. 加入分离胶后，立即覆一层双蒸水，一是为了使分离胶界 面保持水平，用水就可以把它压平，使蛋白质分子跑时在 同一水平线上；二是阻止空气中的氧气对凝胶聚合的抑制 作用。也可以覆盖一层无水乙醇。
常见问题
4. 从转膜完毕后所有的步骤，一定要注意膜保湿，避 免膜的干燥，否则极易产生较高的背景。 5.膜两边的滤纸不能相互接触，接触后会发生短路 6.电转移时会产热，在槽的一边放一块冰来降温 7.切滤纸和膜时，一定要戴手套，因为手上的蛋白会污 染膜
主要试剂
13.封闭缓冲液 封闭膜上的非特异性蛋白结合位点，防止一抗、二抗 的非特异性反应 • TBST Buffer 100 mL • 5 % Nonfat Milk 5g 14.一抗 15.二抗：羊抗兔IgG/HRP（辣根过氧化酶） 使试剂中的发光物氧化并发光 16. ECL检测试剂
操作步骤
提取总蛋白
主要试剂
8.10×转印Buffer（贮存液） 4℃保存 • 10×转印Buffer（贮存液）的配制： • 0.25 M Tris 30.28 g • 1.92 M Glycine 144.13 g • 三蒸水定容至 1000 mL • 1×Transfer Buffer（工作液）： • 10×Transfer Buffer 100 mL • 三蒸水 700 mL • 20 % 甲醇 200 mL
蛋白质免疫印迹实验(Western-BlotPPT课件
硝酸纤维素薄膜和六层Whatman 3MM滤纸，在硝酸纤维素薄膜左下角 剪去一角作为标记。将硝酸纤维素薄膜漂浮于去离子水的表面，使水从 膜的下部浸透以去除其间气泡，将Whatman 3MM滤纸在电转移缓冲液 中浸湿，用蒸馏水淋洗石墨电极，先将三层浸湿的滤纸放在阳极上，在 滤纸表面滚动玻璃棒以除去其间的气泡，再将浸湿的硝酸纤维素薄膜小 心平铺在滤纸上，用玻璃棒小心去除气泡。随后将12%SDS-PAGE凝胶 舒展平铺在硝酸纤维素薄膜上，用玻璃棒小心去除气泡，再将三层浸湿 的滤纸平铺在凝胶上，沁心去除气泡，最后加上石墨电极板，接通电源 进行电转移，电流的大小由凝胶的大小决定，为0.65mA/平方厘米。电 转移2小时后，停止通电，卸掉电转移装置，取下凝胶进行考马斯亮兰 染色，以检测电转移是否完全。小心取下硝酸纤维素薄膜，放在一张干 滤纸上，吸干30-60分钟后，开始进显色反应。
蛋白质免疫印迹实验
（Western Blotting）
.
1
一 实验原理
Western Blotting 是用来检测蛋白质的一种技术。
首先将含有待测蛋白的蛋白质混合物进行凝胶电泳分离， 然后将已经分离的蛋白质通过电泳技术从凝胶转移到固 体支持物上，这一固体支持物目前常为硝酸纤维素薄膜。 随后以待测蛋白质上抗原决定簇特异性的抗体（称为第 一抗体）为探针，与固体支持物上的蛋白质进行免疫反 应，最后用偶联有辣根过氧化物酶或碱性磷酸酯酶的抗 第一抗体的抗体（第二抗体）与第一抗体进行免疫反应， 只有与第一抗体特异性结合的待测蛋白才能与第二抗体 发生免疫反应。在有辣根过氧化物酶的底物用显色剂存 在时就会出现颜色反应，结合有第一抗体、第二抗体的 待测蛋白，通过颜色反应即能显现出来。
缓冲液在室温下封闭2小时，同时1：100加入兔抗GST
蛋白质免疫印迹实验
（Western Blotting）
.
1
一 实验原理
Western Blotting 是用来检测蛋白质的一种技术。
首先将含有待测蛋白的蛋白质混合物进行凝胶电泳分离， 然后将已经分离的蛋白质通过电泳技术从凝胶转移到固 体支持物上，这一固体支持物目前常为硝酸纤维素薄膜。 随后以待测蛋白质上抗原决定簇特异性的抗体（称为第 一抗体）为探针，与固体支持物上的蛋白质进行免疫反 应，最后用偶联有辣根过氧化物酶或碱性磷酸酯酶的抗 第一抗体的抗体（第二抗体）与第一抗体进行免疫反应， 只有与第一抗体特异性结合的待测蛋白才能与第二抗体 发生免疫反应。在有辣根过氧化物酶的底物用显色剂存 在时就会出现颜色反应，结合有第一抗体、第二抗体的 待测蛋白，通过颜色反应即能显现出来。
缓冲液在室温下封闭2小时，同时1：100加入兔抗GST
Wesern-bloing蛋白免疫印迹实验ppt课件
子时要使梳子保持水平。）
④ 用水冲洗一下浓缩胶，将其放入电泳槽中。（小玻璃板面向内，大玻璃板面向外。若只跑一块胶，
槽另一边要垫一块塑料板且有字的一面面向外。）
27
清洗玻 璃板
配 胶
上样
电泳
停止电 泳
①测完蛋白含量后，计算含50mg蛋白的溶液体积即为上样量。适量蛋 白加入4：15*Loading Buffer于离心管，100℃水中煮5min使蛋白 变性。放置冰上3min，离心15min，13000rpm，4℃。
2.结果分析
3.注意事项
四
实验室常见问题解答
20
蛋白样品制 备 蛋白含量测
定
21
在六孔板中，按照一 个孔添加150μL的比 例添加适量RIPA裂解 液，用枪吹打均匀以 充分接触细胞。
样品放置冰上 30min（中间混 匀5-6次）直至 裂解完全。
充分裂解后，1000014000g离心3-5分钟， 取上清，即可进行后续 的PAGE、Western和免 疫沉淀等操作
②加足够的1*电泳缓冲液后开始准备上样。（电泳液至少要漫过内测的小玻璃 板。）用微量进样器贴壁吸取样品，将样品吸出不要吸进气泡。将加样 器针头插至加样孔中缓慢加入样品。（加样太快可使样品冲出加样孔，若有气
泡也可能使样品溢出。）
28
清洗玻 璃板
配 胶
上样
电泳
停止电 泳
浓缩胶80V电压跑20 分钟，可多跑几分钟； 分离胶180V电压跑 至底端。
疾病早期诊断
例：诸延慧，容瓘等.酶联免疫印迹术(EITB)在小鼠日本血吸虫感染早期 诊断中的应用[J]. 中国人兽共患病杂志,1993,9(3):26-29.
5
检测样品中特异性蛋白质是否
④ 用水冲洗一下浓缩胶，将其放入电泳槽中。（小玻璃板面向内，大玻璃板面向外。若只跑一块胶，
槽另一边要垫一块塑料板且有字的一面面向外。）
27
清洗玻 璃板
配 胶
上样
电泳
停止电 泳
①测完蛋白含量后，计算含50mg蛋白的溶液体积即为上样量。适量蛋 白加入4：15*Loading Buffer于离心管，100℃水中煮5min使蛋白 变性。放置冰上3min，离心15min，13000rpm，4℃。
2.结果分析
3.注意事项
四
实验室常见问题解答
20
蛋白样品制 备 蛋白含量测
定
21
在六孔板中，按照一 个孔添加150μL的比 例添加适量RIPA裂解 液，用枪吹打均匀以 充分接触细胞。
样品放置冰上 30min（中间混 匀5-6次）直至 裂解完全。
充分裂解后，1000014000g离心3-5分钟， 取上清，即可进行后续 的PAGE、Western和免 疫沉淀等操作
②加足够的1*电泳缓冲液后开始准备上样。（电泳液至少要漫过内测的小玻璃 板。）用微量进样器贴壁吸取样品，将样品吸出不要吸进气泡。将加样 器针头插至加样孔中缓慢加入样品。（加样太快可使样品冲出加样孔，若有气
泡也可能使样品溢出。）
28
清洗玻 璃板
配 胶
上样
电泳
停止电 泳
浓缩胶80V电压跑20 分钟，可多跑几分钟； 分离胶180V电压跑 至底端。
疾病早期诊断
例：诸延慧，容瓘等.酶联免疫印迹术(EITB)在小鼠日本血吸虫感染早期 诊断中的应用[J]. 中国人兽共患病杂志,1993,9(3):26-29.
5
检测样品中特异性蛋白质是否
Western blot 实验介绍及流程PPT课件
ECL显色：ECL试 剂与过氧化物酶 结合后发光后， 可用仪器自动检 测或在暗室内用 X-光片将其记录 下来。
第13页/共17页
Western blot 实验结果与分析
将X-光片在凝胶图像分析仪上进行灰度扫描，比较目的蛋白与 内参照蛋白的灰度值，可得到蛋白表达半定量分析结果
c-fos actin
62kD 42kD
二抗孵育：二抗的选择根 据一抗的种属来源，如： 一抗是兔抗大鼠目的蛋白 的抗体，则二抗应选择山 羊或其他来源抗兔的抗体， 而且二抗要标记有同位素 或酶。
第12页/共17页
Western blot 实验流程
6 ECL detection ECL Kit is based on the enzyme-linked immunodetection of antigen-specific antibody using anti-IgG secondary antibodies conjugated to horseradish peroxidase ( HRP ), which reacts with a chemiluminescent substrate in the presence of a chemical enhancer.
• 电泳仪
用途：用于生物学实验中对特定目的蛋白质的分离，定 性及定量的检测分析，是Western-blot（蛋白免疫印迹 ）实验中非常重要的部分。
第2页/共17页
Western blot 实验原理
• Western blot是利用已知的特异性抗体与抗原（即 组织细胞中的目的蛋白）能特异性结合的原理，通过 化学反应使标记于结合后的特异性抗体上的显示剂 （如酶、金属离子、同位素）显示一定的颜色或发光 来对组织细胞内目的蛋白定性及半定量的研究。
第13页/共17页
Western blot 实验结果与分析
将X-光片在凝胶图像分析仪上进行灰度扫描，比较目的蛋白与 内参照蛋白的灰度值，可得到蛋白表达半定量分析结果
c-fos actin
62kD 42kD
二抗孵育：二抗的选择根 据一抗的种属来源，如： 一抗是兔抗大鼠目的蛋白 的抗体，则二抗应选择山 羊或其他来源抗兔的抗体， 而且二抗要标记有同位素 或酶。
第12页/共17页
Western blot 实验流程
6 ECL detection ECL Kit is based on the enzyme-linked immunodetection of antigen-specific antibody using anti-IgG secondary antibodies conjugated to horseradish peroxidase ( HRP ), which reacts with a chemiluminescent substrate in the presence of a chemical enhancer.
• 电泳仪
用途：用于生物学实验中对特定目的蛋白质的分离，定 性及定量的检测分析，是Western-blot（蛋白免疫印迹 ）实验中非常重要的部分。
第2页/共17页
Western blot 实验原理
• Western blot是利用已知的特异性抗体与抗原（即 组织细胞中的目的蛋白）能特异性结合的原理，通过 化学反应使标记于结合后的特异性抗体上的显示剂 （如酶、金属离子、同位素）显示一定的颜色或发光 来对组织细胞内目的蛋白定性及半定量的研究。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
➢ 小于20KD—0.2 um
➢ 小于7KD—0.1 um
较贵
Westernblot实验技术
13
湿转
不能有气泡 不要污染膜的表面 注意正负极 冰浴冷却
Westernblot实验技术
15
半干转
不能有气泡 滤纸、胶、膜大小要一致，否则容易短路，产热
Westernblot实验技术
16
封闭
脱脂奶粉（5％） BSA Western Blot 膜封闭液（生物试剂公司提供）
Westernblot实验技术
17
一抗、二抗孵育
把硝酸纤维素滤膜放在密闭塑料袋或者培养皿中，根据滤 膜面积以0.1ml/cm2的量加入加入一抗溶液与滤膜温育。 37℃一小时，4 ℃过夜。
倒掉一抗溶液，用TBST漂洗液滤膜3次，每次10min。 加入用封闭液配制的二抗，摇床上缓慢摇动， 37℃一小时，
4 ℃过夜。 倒掉二抗溶液，用TBST漂洗液滤膜3次，每次10min。
Westernblot实验技术
18
二抗与底物反应显色
辣根过氧化物酶法（HRP） 碱性磷酸酶法（AP） 化学发光显色法(HRP)
➢ DAB 显色法：方便、经济，反应慢、不易保存、不 能重新剥离检测
➢ ECL发光法：灵敏、快速、反应快、能重新剥离检测
Westernblot实验技术
19
Western Blot常见问题分析
Westernblot实验技术
20
SDS-PAGE电泳
胶不平？ 凝胶漏液？
➢ 胶板洗刷干净 ➢ 加入APS和TEMED的量要合适 ➢ 加入试剂后摇匀，使其充分混
合，防止部分胶块聚合不均匀 ➢ 温度合适，受热不均匀导致胶
聚合不均匀 ➢ 两块玻璃板底部要对齐
Westernblot实验技术
6
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
原理：
SDS 是一种离子性的界面活性剂,它有强离子性的硫酸根离子也带有疏水 性的长碳链.当 SDS 与蛋白质混合时,它会以其碳链与蛋白质之疏水性胺 基酸结合将蛋白质包起来,而以硫酸根离子外露与水分子作用.大多数蛋 白质和 SDS 的平均结合量是 1:1.4 (以重量为单位),而蛋白质结合固定 比例之 SDS 後,由於 SDS 带强负价,使蛋白质原先的带电价微不足道,且 每单位重量之蛋白质带电价一致 (charge density),所以决定不同蛋白的
Westernblot实验技术
定义：
印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应 的探测反应来检测样品的一种方法。
1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上， 并利用DNA－RNA杂交检测特定的DNA片段的方法，称为 Southern印迹法。
泳动速率就只剩下分子大小一项因素
Westernblot实验技术
7
凝胶成份
丙烯酰胺和N,N’-亚甲双丙烯酰胺 SDS 配胶的Tris缓冲液 TEMED 过硫酸铵(时间) Tris-甘氨酸电泳缓冲液
Westernblot实验技术
8
凝胶浓度与蛋白分离范围
Westernblot实验技术
9
Westernblot实验技术
Westernblot实验技术
21
条带比正常的窄？
“微笑”或“倒微笑” 条带？
➢ 凝胶聚合不均匀，灌胶时候尽量混合 均匀，动作轻缓
➢ 拔梳子要迅速，清洗加样孔要小心， 以免把上样带扭曲
➢ 样品盐浓度过高会挤压其他条带导致 宽窄不一，纯化样品，调整盐浓度
➢ 胶板底部有气泡会影响电泳效果，应 赶走气泡。同时注意电泳槽装置是否 合适
快速、特异，信号弱、昂贵 Westernblot信实验号技术强、二抗选择多，非特异性结合3
Western Blot一般流程
蛋白样品的制备
SDS聚丙烯酰胺 凝胶电泳
转膜 封闭 一抗杂交 二抗杂交 底物显色
Westernblot实验技术
4
蛋白样品的制备
Westernblot实验技术
5
裂解液
➢ 只能识别非变性的抗原表位的抗体，不能选择SDS及强去污剂的裂解液 ➢ 研究蛋白之间相互作用，应选择温和非变性裂解液 ➢ 对于难溶解蛋白，应选用裂解强度更高的裂解液（如RIPA, SDS)
太高。转膜过程注意降温
Westernblot实验技术
23
背景太高
原 1. 膜没有因均匀浸湿
1. 转膜前用100%甲醇将膜 完全浸湿
2. 膜或者缓冲液污染
2. 拿取膜与吸水纸时要戴手
3. 封闭不充分
对
套，更换新鲜转膜缓冲液
4. 抗体与封闭剂出现交 策 3. 检测一抗、二抗与封闭剂
叉反应
是否有交叉反应
而后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析，对RNA 的印迹分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的蛋白质分子的印 迹分析称为Western印迹法，对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析 称为Eastern印迹法
Westernblot实验技术
2
Western Blot基本原理
在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种 固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测。
策
有叠氮化钠
4. 大分量蛋白相应增加转膜
时间及曝光时间
Westernblot实验技术
5. 抗体浓度过高
4. 杂交前检测一抗、二抗的
工作浓度
Westernblot实验技术
24
没有阳性条带或比较弱
原 1. 抗体染因色不充分
2. 靶蛋白含量太低 3. HRP抑制剂 4. 转膜时间不够 5. 曝光时间过短
1. 增加抗体滴度，延长孵育
时间
2. 增加样本上样量
对 3. 所用溶液和容器中避免含
Westernblot实验技术
22
转膜及抗体检测
凝胶肿胀或卷曲？ 条带歪斜或漂移？ 单个或多个白点？ 转膜缓冲液过热5-10min
➢ 电转仪长期使用导致海绵变薄，“三 明治”结构不紧凑导致。可在两块海 绵之间垫上少许普通的滤纸
➢ 确保膜和胶块之间没有气泡 ➢ 缓冲液中离子浓度太低，电流或电压
10
安装玻璃板 对齐、加紧
配胶
混匀、不要过度，防止氧化
Westernblot实验技术
11
Westernblot实验技术
12
转膜
NC膜
PVDF膜
结合能力 材料质地
80-110 ug/cm2
脆
125-200 ug/cm2
韧性好
溶剂耐受性
无
有
操作程序
缓冲液润湿 100%甲醇润湿
价格
便宜
➢ 大于20KD—0.45 um
➢ 小于7KD—0.1 um
较贵
Westernblot实验技术
13
湿转
不能有气泡 不要污染膜的表面 注意正负极 冰浴冷却
Westernblot实验技术
15
半干转
不能有气泡 滤纸、胶、膜大小要一致，否则容易短路，产热
Westernblot实验技术
16
封闭
脱脂奶粉（5％） BSA Western Blot 膜封闭液（生物试剂公司提供）
Westernblot实验技术
17
一抗、二抗孵育
把硝酸纤维素滤膜放在密闭塑料袋或者培养皿中，根据滤 膜面积以0.1ml/cm2的量加入加入一抗溶液与滤膜温育。 37℃一小时，4 ℃过夜。
倒掉一抗溶液，用TBST漂洗液滤膜3次，每次10min。 加入用封闭液配制的二抗，摇床上缓慢摇动， 37℃一小时，
4 ℃过夜。 倒掉二抗溶液，用TBST漂洗液滤膜3次，每次10min。
Westernblot实验技术
18
二抗与底物反应显色
辣根过氧化物酶法（HRP） 碱性磷酸酶法（AP） 化学发光显色法(HRP)
➢ DAB 显色法：方便、经济，反应慢、不易保存、不 能重新剥离检测
➢ ECL发光法：灵敏、快速、反应快、能重新剥离检测
Westernblot实验技术
19
Western Blot常见问题分析
Westernblot实验技术
20
SDS-PAGE电泳
胶不平？ 凝胶漏液？
➢ 胶板洗刷干净 ➢ 加入APS和TEMED的量要合适 ➢ 加入试剂后摇匀，使其充分混
合，防止部分胶块聚合不均匀 ➢ 温度合适，受热不均匀导致胶
聚合不均匀 ➢ 两块玻璃板底部要对齐
Westernblot实验技术
6
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
原理：
SDS 是一种离子性的界面活性剂,它有强离子性的硫酸根离子也带有疏水 性的长碳链.当 SDS 与蛋白质混合时,它会以其碳链与蛋白质之疏水性胺 基酸结合将蛋白质包起来,而以硫酸根离子外露与水分子作用.大多数蛋 白质和 SDS 的平均结合量是 1:1.4 (以重量为单位),而蛋白质结合固定 比例之 SDS 後,由於 SDS 带强负价,使蛋白质原先的带电价微不足道,且 每单位重量之蛋白质带电价一致 (charge density),所以决定不同蛋白的
Westernblot实验技术
定义：
印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应 的探测反应来检测样品的一种方法。
1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上， 并利用DNA－RNA杂交检测特定的DNA片段的方法，称为 Southern印迹法。
泳动速率就只剩下分子大小一项因素
Westernblot实验技术
7
凝胶成份
丙烯酰胺和N,N’-亚甲双丙烯酰胺 SDS 配胶的Tris缓冲液 TEMED 过硫酸铵(时间) Tris-甘氨酸电泳缓冲液
Westernblot实验技术
8
凝胶浓度与蛋白分离范围
Westernblot实验技术
9
Westernblot实验技术
Westernblot实验技术
21
条带比正常的窄？
“微笑”或“倒微笑” 条带？
➢ 凝胶聚合不均匀，灌胶时候尽量混合 均匀，动作轻缓
➢ 拔梳子要迅速，清洗加样孔要小心， 以免把上样带扭曲
➢ 样品盐浓度过高会挤压其他条带导致 宽窄不一，纯化样品，调整盐浓度
➢ 胶板底部有气泡会影响电泳效果，应 赶走气泡。同时注意电泳槽装置是否 合适
快速、特异，信号弱、昂贵 Westernblot信实验号技术强、二抗选择多，非特异性结合3
Western Blot一般流程
蛋白样品的制备
SDS聚丙烯酰胺 凝胶电泳
转膜 封闭 一抗杂交 二抗杂交 底物显色
Westernblot实验技术
4
蛋白样品的制备
Westernblot实验技术
5
裂解液
➢ 只能识别非变性的抗原表位的抗体，不能选择SDS及强去污剂的裂解液 ➢ 研究蛋白之间相互作用，应选择温和非变性裂解液 ➢ 对于难溶解蛋白，应选用裂解强度更高的裂解液（如RIPA, SDS)
太高。转膜过程注意降温
Westernblot实验技术
23
背景太高
原 1. 膜没有因均匀浸湿
1. 转膜前用100%甲醇将膜 完全浸湿
2. 膜或者缓冲液污染
2. 拿取膜与吸水纸时要戴手
3. 封闭不充分
对
套，更换新鲜转膜缓冲液
4. 抗体与封闭剂出现交 策 3. 检测一抗、二抗与封闭剂
叉反应
是否有交叉反应
而后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析，对RNA 的印迹分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的蛋白质分子的印 迹分析称为Western印迹法，对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析 称为Eastern印迹法
Westernblot实验技术
2
Western Blot基本原理
在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种 固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测。
策
有叠氮化钠
4. 大分量蛋白相应增加转膜
时间及曝光时间
Westernblot实验技术
5. 抗体浓度过高
4. 杂交前检测一抗、二抗的
工作浓度
Westernblot实验技术
24
没有阳性条带或比较弱
原 1. 抗体染因色不充分
2. 靶蛋白含量太低 3. HRP抑制剂 4. 转膜时间不够 5. 曝光时间过短
1. 增加抗体滴度，延长孵育
时间
2. 增加样本上样量
对 3. 所用溶液和容器中避免含
Westernblot实验技术
22
转膜及抗体检测
凝胶肿胀或卷曲？ 条带歪斜或漂移？ 单个或多个白点？ 转膜缓冲液过热5-10min
➢ 电转仪长期使用导致海绵变薄，“三 明治”结构不紧凑导致。可在两块海 绵之间垫上少许普通的滤纸
➢ 确保膜和胶块之间没有气泡 ➢ 缓冲液中离子浓度太低，电流或电压
10
安装玻璃板 对齐、加紧
配胶
混匀、不要过度，防止氧化
Westernblot实验技术
11
Westernblot实验技术
12
转膜
NC膜
PVDF膜
结合能力 材料质地
80-110 ug/cm2
脆
125-200 ug/cm2
韧性好
溶剂耐受性
无
有
操作程序
缓冲液润湿 100%甲醇润湿
价格
便宜
➢ 大于20KD—0.45 um