Westernblot实验技术培训课件

Westernblot实验技术
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转膜及抗体检测
凝胶肿胀或卷曲？ 条带歪斜或漂移？ 单个或多个白点？ 转膜缓冲液过热？
➢ 可将凝胶在转膜之前放到转膜缓冲液 中浸泡5-10min
➢ 电转仪长期使用导致海绵变薄，“三 明治”结构不紧凑导致。可在两块海 绵之间垫上少许普通的滤纸
➢ 确保膜和胶块之间没有气泡 ➢ 缓冲液中离子浓度太低，电流或电压
策
有叠氮化钠
4. 大分量蛋白相应增加转膜
时间及曝光时间
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条带比正常的窄？
“微笑”或“倒微笑” 条带？
➢ 凝胶聚合不均匀，灌胶时候尽量混合 均匀，动作轻缓
➢ 拔梳子要迅速，清洗加样孔要小心， 以免把上样带扭曲
➢ 样品盐浓度过高会挤压其他条带导致 宽窄不一，纯化样品，调整盐浓度
➢ 胶板ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ部有气泡会影响电泳效果，应 赶走气泡。同时注意电泳槽装置是否 合适
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Western Blot常见问题分析
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SDS-PAGE电泳
胶不平？ 凝胶漏液？
➢ 胶板洗刷干净 ➢ 加入APS和TEMED的量要合适 ➢ 加入试剂后摇匀，使其充分混
合，防止部分胶块聚合不均匀 ➢ 温度合适，受热不均匀导致胶
聚合不均匀 ➢ 两块玻璃板底部要对齐
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一抗、二抗孵育
把硝酸纤维素滤膜放在密闭塑料袋或者培养皿中，根据滤 膜面积以0.1ml/cm2的量加入加入一抗溶液与滤膜温育。 37℃一小时，4 ℃过夜。
倒掉一抗溶液，用TBST漂洗液滤膜3次，每次10min。 加入用封闭液配制的二抗，摇床上缓慢摇动， 37℃一小时，
5. 抗体浓度过高
4. 杂交前检测一抗、二抗的
工作浓度
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没有阳性条带或比较弱
原 1. 抗体染因色不充分
2. 靶蛋白含量太低 3. HRP抑制剂 4. 转膜时间不够 5. 曝光时间过短
1. 增加抗体滴度，延长孵育
时间
2. 增加样本上样量
对 3. 所用溶液和容器中避免含
太高。转膜过程注意降温
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背景太高
原 1. 膜没有因均匀浸湿
1. 转膜前用100%甲醇将膜 完全浸湿
2. 膜或者缓冲液污染
2. 拿取膜与吸水纸时要戴手
3. 封闭不充分
对
套，更换新鲜转膜缓冲液
4. 抗体与封闭剂出现交 策 3. 检测一抗、二抗与封闭剂
叉反应
是否有交叉反应
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定义：
印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应 的探测反应来检测样品的一种方法。
1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上， 并利用DNA－RNA杂交检测特定的DNA片段的方法，称为 Southern印迹法。
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安装玻璃板 对齐、加紧
配胶
混匀、不要过度，防止氧化
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转膜
NC膜
PVDF膜
结合能力 材料质地
80-110 ug/cm2
脆
125-200 ug/cm2
韧性好
溶剂耐受性
无
有
操作程序
缓冲液润湿 100%甲醇润湿
价格
便宜
➢ 大于20KD—0.45 um
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SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
原理：
SDS 是一种离子性的界面活性剂,它有强离子性的硫酸根离子也带有疏水 性的长碳链.当 SDS 与蛋白质混合时,它会以其碳链与蛋白质之疏水性胺 基酸结合将蛋白质包起来,而以硫酸根离子外露与水分子作用.大多数蛋 白质和 SDS 的平均结合量是 1:1.4 (以重量为单位),而蛋白质结合固定 比例之 SDS 後,由於 SDS 带强负价,使蛋白质原先的带电价微不足道,且 每单位重量之蛋白质带电价一致 (charge density),所以决定不同蛋白的
4 ℃过夜。 倒掉二抗溶液，用TBST漂洗液滤膜3次，每次10min。
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二抗与底物反应显色
辣根过氧化物酶法（HRP） 碱性磷酸酶法（AP） 化学发光显色法(HRP)
➢ DAB 显色法：方便、经济，反应慢、不易保存、不 能重新剥离检测
➢ ECL发光法：灵敏、快速、反应快、能重新剥离检测
而后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析，对RNA 的印迹分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的蛋白质分子的印 迹分析称为Western印迹法，对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析 称为Eastern印迹法
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Western Blot基本原理
在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种 固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测。
快速、特异，信号弱、昂贵 Westernblot信实验号技术强、二抗选择多，非特异性结合3
Western Blot一般流程
蛋白样品的制备
SDS聚丙烯酰胺 凝胶电泳
转膜 封闭 一抗杂交 二抗杂交 底物显色
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蛋白样品的制备
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裂解液
➢ 只能识别非变性的抗原表位的抗体，不能选择SDS及强去污剂的裂解液 ➢ 研究蛋白之间相互作用，应选择温和非变性裂解液 ➢ 对于难溶解蛋白，应选用裂解强度更高的裂解液（如RIPA, SDS)
➢ 小于20KD—0.2 um
➢ 小于7KD—0.1 um
较贵
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湿转
不能有气泡 不要污染膜的表面 注意正负极 冰浴冷却
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半干转
不能有气泡 滤纸、胶、膜大小要一致，否则容易短路，产热
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封闭
脱脂奶粉（5％） BSA Western Blot 膜封闭液（生物试剂公司提供）
泳动速率就只剩下分子大小一项因素
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凝胶成份
丙烯酰胺和N,N’-亚甲双丙烯酰胺 SDS 配胶的Tris缓冲液 TEMED 过硫酸铵(时间) Tris-甘氨酸电泳缓冲液
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凝胶浓度与蛋白分离范围
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