抗坏血酸氧化酶(ascorbate oxidase ,AAO )活性测定试剂盒说明书
抗氧化酶测定实验方法
抗氧化酶测定实验方法抗氧化酶是一类酶系统，它能够抵御氧自由基的伤害，维持细胞内环境的稳定。
常见的抗氧化酶包括超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(Cat)和谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)等。
测定抗氧化酶活性能够评估抗氧化能力，进而为疾病的诊断和治疗提供参考。
以下是抗氧化酶测定的实验方法。
实验材料：1.磷酸盐缓冲液：Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液(pH7-8)。
2.高速冰箱和离心机。
3. 0.1 mol/L L-酪氨酸盐酸缓冲液：将L-酪氨酸溶解于0.1 mol/L的盐酸溶液中，并加入0.5% (w/v) 卵白饼干碎片。
4.超氧化物解毒酶(SOD)标准品：如肝脏SOD标准品。
5.乙醇、乙醚、碘仿、硝酸等有机试剂。
6.2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-（二苯嘧啶)-2H-四唑(INT)。
实验步骤：1.组织预处理：取所需组织样品，酶解和离心得到提取液(组织块破碎并添加合适的缓冲液)，离心清除杂质得到上清液。
2. 蛋白质含量检测：根据Bradford法或Lowry法，测定上清液中蛋白质的含量。
3. 测定SOD活性：将上清液加入0.1 mol/L L-酪氨酸盐酸缓冲液，再加入0.5%的乙醇溶液，保护酪氨酸被SOD氧化，使其在酶作用下发生自动降解。
离心，取上清液。
在为反应液中加入INT（2.5 mmol/L），使之在SOD作用下发生氧化还原，反应生成紫色的一价酮衍生物。
在滤紙上滴加提取液，通过比色计测定OD值。
4. 测定Cat活性：将提取液加入3%的过氧化氢溶液并充分混合。
加入乙醚和碘仿的混合物，并离心。
提取水相层和乙醚层。
用硝酸溶液判断乙醚层中是否存在过氧化氢。
通过测定乙醚层吸收光谱的变化来测定Cat 活性。
5. 测定Gpx活性：加入适量的提取液到预先调配的反应体系中。
反应开始后，每2分钟测定OD值，记录10分钟之间的OD变化。
绘制OD值和反应时间的曲线，计算反应速率。
6.数据处理：根据测得的OD值和各反应时间点得到的反应速率，计算出抗氧化酶系数和活性。
抗氧化物活性测定方法总结
抗氧化物活性测定方法总结抗氧化物活性测定方法是通过对样品中的抗氧化物质含量和抗氧化活性进行定量分析，评估其对自由基的清除能力和抗氧化能力。
随着抗氧化研究的不断深入，测定方法也逐渐完善。
以下是对常见的抗氧化物活性测定方法的总结。
1. ORAC法（氧化应激反应活性测定法）：该方法通过测定样品清除自由基的能力来评估其抗氧化活性。
实验中，将样品与荧光试剂（如2,2'-azobis(2,4-dimethylvaleronitrile)）共同作用，观察其清除自由基的能力，并通过建立标准曲线计算样品的ORAC值。
2.DPPH法（1,1-二苯基-2-苦味基-苦味酸磷）：该方法是一种常用的快速测定抗氧化活性的方法。
实验中，将样品与DPPH稳定自由基共同作用，通过比色反应观察DPPH自由基被样品清除的程度，从而评估抗氧化活性。
3.ABTS法（2,2'-联氮双5-苯砜酸）：该方法通过ABTS离子自由基的生成和清除反应来测定样品的抗氧化活性。
实验中，ABTS与过氧化氢反应生成ABTS离子自由基，通过观察样品对其的清除能力来评估抗氧化活性。
4.FRAP法（亚铁离子还原能力）：该方法基于样品对人造抗坏血酸（Fe3+）的还原能力，通过测量还原后的Fe2+离子的生成量来评估抗氧化活性。
实验中，将样品与Fe3+离子反应生成Fe2+离子，通过比色反应来测定Fe2+的含量。
5. 碘标法（Iodine value）：该方法用于测定油脂、脂肪等样品的抗氧化活性。
实验中，将已知量的碘与样品中的不饱和化合物反应，在光反应下观察反应终点的颜色变化，并根据标准曲线计算样品的抗氧化活性。
6. 硝酸盐法（Nitrite method）：该方法用于测定样品中亚硝酸盐的含量，从而评估其抗氧化活性。
实验中，样品经过还原反应生成亚硝酸盐，然后与DANO（N-乙基-N-（2-苯基乙基）-对硝基苯胺）反应生成稳定的偶氮染料，通过比色测定反应终点的吸光度来计算样品中亚硝酸盐的含量。
抗坏血酸氧化酶原料
抗坏血酸氧化酶原料的研究与应用一、引言抗坏血酸氧化酶（Ascorbate Oxidase，简称AO）是一种重要的酶类，在植物生理学和食品工业等领域具有广泛的应用。
该酶主要作用于抗坏血酸（Ascorbic Acid，简称AA），将其氧化为脱氢抗坏血酸（Dehydroascorbic Acid，简称DHA），从而实现一系列生物化学反应。
为了深入了解抗坏血酸氧化酶原料的来源、性质及应用，本文将对相关内容进行详细探讨。
二、抗坏血酸氧化酶原料的来源1. 植物来源：抗坏血酸氧化酶主要存在于植物体内，如水果、蔬菜等。
这些植物在生长过程中，会产生大量的抗坏血酸氧化酶，以维持其正常的生理代谢。
因此，从植物中提取抗坏血酸氧化酶原料是一种常见的方法。
2. 微生物来源：某些微生物，如细菌、真菌等，也具有产生抗坏血酸氧化酶的能力。
通过发酵培养这些微生物，可以大量获得抗坏血酸氧化酶原料。
这种方法具有生产周期短、产量高等优点，因此在工业生产中得到了广泛应用。
三、抗坏血酸氧化酶原料的性质1. 物理性质：抗坏血酸氧化酶原料通常为淡黄色至棕色的粉末，具有较高的溶解度和稳定性。
在不同的环境条件下，该酶的活性会受到一定的影响，如温度、pH值、抑制剂等。
2. 化学性质：抗坏血酸氧化酶具有特定的活性基团，可以与抗坏血酸发生氧化还原反应。
该酶的催化效率较高，可以在较短时间内将大量的抗坏血酸转化为脱氢抗坏血酸。
此外，抗坏血酸氧化酶还具有一些其他的化学特性，如底物特异性、抑制剂敏感性等，这些特性为其应用提供了更多的可能性。
四、抗坏血酸氧化酶原料的应用1. 植物生理学研究：在植物生理学研究中，抗坏血酸氧化酶原料被广泛应用于探究植物体内抗坏血酸的代谢途径及其调控机制。
通过对该酶的活性进行测定和分析，可以深入了解植物在不同环境条件下的生长发育过程及其对环境因素的响应机制。
2. 食品工业：在食品工业中，抗坏血酸氧化酶原料被用作一种重要的食品添加剂，主要用于保鲜、防腐和抗氧化等方面。
植物抗坏血酸氧化酶及多酚氧化酶活性的测定
植物抗坏血酸氧化酶及多酚氧化酶活性的测定作者:《果蔬贮藏加工学实来源:华南农大浏览数:2949 录入:2007-6-16 14:53:40 验指导》植物抗坏血酸氧化酶及多酚氧化酶活性的测定一、原理抗坏血酸氧化酶能利用空气中的氧氧化抗坏血酸成为脱氢抗坏血酸；多酚氧化酶可催化空气中的氧氧化多酚，成为相应的醌，形成的醌能被抗坏血酸还原。
因此，在酶提取液中加入抗坏血酸，可测定抗坏血酸氧化酶的活性，加入抗坏血酸及焦儿茶酚，可测定抗坏血酸及多酚氧化酶两者的活性，相减即可求出多酚氧化酶的活性。
抗坏血酸的消耗量，可用碘液滴定剩余的抗坏血酸。
碘酸钾在酸性条件下与碘化钾反应放出碘，放出的碘与抗坏血酸作用，将之氧化成脱氢抗坏血酸，多余的碘能使淀粉变为蓝色。
二、材料与设备材料：马铃薯块茎设备：水浴锅、台秤、离心机试剂：pH6.0 1/15mol/L磷酸缓冲液、0.1％抗坏血酸、0.02mol/L焦儿茶酚、10％三氯乙酸、1％淀粉。
0.05mol/L碘液：碘化钾2.5g溶于200ml蒸馏水，加冰醋酸1ml，再加0.1mol/L碘酸钾12.5ml，定容至250ml。
三、试验步骤（一）酶液制备：称取马铃薯块茎10.0g，用预冷pH6.0 1/15mol/L磷酸缓冲液，研磨匀浆，定容至50ml，在18-20℃水浴浸提30分钟，中间摇动数次，再于3000×g离心10分钟，取上清液，4℃保存备用。
（二）酶活性测定：１. 取6个三角瓶(50-100ml)，标上号码，分别加入下列试剂(ml)：┌──┬────┬───────┬─────────┬──┬─────┐│瓶号│ 蒸馏水│0.1％抗坏血酸│0.02mol/L焦儿茶酚│ 酶│煮5分钟酶│├──┼────┼───────┼─────────┼──┼─────┤│ 1 │ 4 │ 2 │ │ 2 │ ││ 1' │ 4 │ 2 │ │ 2 │ ││ 2 │ 4 │ 2 │ │ │ 2 ││ 3 │ 3 │ 2 │ 1 │ 2 │ ││ 3' │ 3 │ 2 │ 1 │ 2 │ ││ 4 │ 3 │ 2 │ 1 │ │ 2 │└──┴────┴───────┴─────────┴──┴─────┘1、3瓶各作一次重复，2、4瓶作空白将6个三角瓶放入18-20℃水浴反应5分钟,立即分别加入10％三氯乙酸1ml，摇匀，终止酶反应。
超氧化物歧化酶、抗坏血酸过氧化物酶和过氧化物酶_概述说明
超氧化物歧化酶、抗坏血酸过氧化物酶和过氧化物酶概述说明1. 引言1.1 概述：在细胞内，氧化还原反应是生物体正常代谢过程中不可或缺的部分。
然而，在这些氧化还原反应中产生的活性氧种（ROS）却可能对细胞结构和功能造成损害。
为了保护细胞免受活性氧物质的侵害，细胞内存在着一系列抗氧化酶系统。
其中包括超氧化物歧化酶（SOD），抗坏血酸过氧化物酶（APX）和过氧化物酶（POD）。
这些抗氧化酶通过催化活性氧的转化和清除，起到维持细胞内稳态、减少氧自由基对生物体的伤害的重要作用。
1.2 文章结构：本文将分为五个部分来探讨超氧化物歧化酶、抗坏血酸过氧化物酶和过氧化物酶的定义、功能、结构、机制以及其在生理作用和临床意义方面的研究。
在第二部分，我们将详细介绍超氧化物歧化酶。
首先，我们将解释其定义和功能，包括其在生物体内的重要作用。
然后，我们将探讨其结构和催化机制，揭示超氧化物歧化酶如何通过催化超氧阴离子（O2.-）的转化来清除活性氧物质。
第三部分将聚焦于抗坏血酸过氧化物酶。
我们将解释该酶的定义和功能，并探究它在细胞中是如何通过消除过氧化氢（H2O2）来保护细胞免受氧自由基的损伤。
第四部分将涵盖过氧化物酶。
我们将描述该酶的定义、功能和结构，并讨论其通过催化有机底物或无机底物的转变来减少细胞内活性氧物质积累的机制。
最后，在第五部分结论中，我们将总结本文提到的要点，并展望未来对这些抗氧化酶系统研究的方向。
1.3 目的：本文旨在增进读者对超氧化物歧化酶、抗坏血酸过氧化物酶和过氧化物酶这些重要抗氧化酶系统的认识。
通过了解它们的定义、功能、结构和机制，以及在生理作用和临床意义方面的研究进展，我们可以更好地理解细胞对抗活性氧物质的保护机制，并为未来的研究提供一定的指导和启示。
2. 超氧化物歧化酶:2.1 定义和功能:超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，简称SOD）是一种重要的抗氧化酶，它参与细胞内超氧阴离子（O2-）的清除，以保护细胞免受过氧化损伤。
抗坏血酸检测的实验步骤
动物血清中抗坏血酸（Vc）的测定一、实验目的抗坏血酸（Ascorbic Acid）又叫维生素C（Vitamin C），是一种水溶性维生素.正常成人体内的抗坏血酸代谢活性池中约有1500mg抗坏血酸，最高储存峰值为3000mg抗坏血酸.抗坏血酸在氧化还原代谢反应中起调节作用，缺乏它可引起坏血病.抗坏血酸是一种强力的抗氧化剂、抗病毒和抗炎剂.广泛存在于食品和生物样本中，是一种免疫刺激剂.因此检测抗坏血酸在上述样本内的分布和含量就显得非常重要。
二、实验原理三、实验仪器试管、移液枪、漩涡混匀器、水浴锅、离心机、可见分光光度计。
四、试剂的配制1.试剂一应用液的配制（5ml）：试剂一储备液：双蒸水=1：14稀释，混匀制备。
2.试剂二应用液的配制：用时取一支粉剂加0.36 ml的冰醋酸再加水至40 ml,溶解，4℃保存。
3. 试剂三应用液的配制：因溶解困难，使用前2-4h加无水乙醇60 ml充分溶解，制备，4 ℃保存。
4. 试剂四应用液的配制：用时取0.15 ml 试剂四储备液加水至25 ml制备，避光保存。
（现用现配）5.试剂五：液体6 ml，4 ℃保存。
6.600 ug/ml标准品应用液的配制：取一支标准品粉末溶于10 ml试剂一应用液中，充分混匀，4℃保存。
6ug/ml标准品应用液的配制：取600 ug/ml Vc标准应用液再用试剂一应用液100倍稀释备用，现用现配。
注意：维生素C标准品易氧化，因此，最好在样本上清液制备好后再配标准，并在10 min内进行检测。
五、实验步骤1.取实验小鼠，断颈处死，摘除眼球，眼眶取血至1.5 ml EP管，取完血液，然后静置半小时，然后3000 rpm, 离心15 min,然后取上清至新1.5 ml EP管，3000 rpm, 离心15 min,取上清备用2.上清液的制备：取步骤一中上清0.15 ml加试剂一应用液0.45 ml,漩涡混匀，放置15 min分钟后离心，3500-4000转/分，离心10分钟，上层清亮液体为上清液。
抗坏血酸过氧化物酶
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抗坏血酸过氧化物酶
抗坏血酸过氧化物酶（ascorbate peroxidase，APX）是
一种重要的氧化酶，负责在植物体内催化抗坏血酸（维生
素C）与过氧化氢之间的氧化还原反应。
该酶可以将有害的过氧化氢转化为水和氧气，起到清除细胞内部过氧化氢的
作用。
抗坏血酸过氧化物酶广泛存在于植物体内，尤其在叶片和
根部等活跃代谢组织中含量较高。
它是维持植物细胞内氧
化还原平衡的关键酶之一。
在植物遭受各种逆境胁迫时，
如高温、干旱、盐碱等，会导致植物体内产生过量的过氧
化氢，进而引发氧化应激反应。
抗坏血酸过氧化物酶的活
性会得到显著增强，从而帮助植物对抗逆境胁迫。
此外，抗坏血酸过氧化物酶还参与植物生长和发育的调控。
研究发现，抗坏血酸过氧化物酶的缺失或突变会导致植物
叶片发生病斑、失绿、畸形生长等异常现象，甚至影响到
植物的种子萌发和幼苗生长。
因此，抗坏血酸过氧化物酶
在植物生理生化过程中具有重要的功能和调控作用。
1。
抗坏血酸的催化动力学光度法测定
抗坏血酸的催化动力学光度法测定一、前言抗坏血酸(Ascorbic acid,简称AA)是一种重要的抗氧化剂，广泛应用于食品、医药、化妆品等领域。
为了保证产品质量和安全性，抗坏血酸的含量检测至关重要。
传统的抗坏血酸含量检测方法包括高效液相色谱法(HPLC)、比色法等，但这些方法存在一定的局限性，如操作复杂、耗时长、灵敏度低等。
近年来，随着光度法技术的发展，催化动力学光度法(Kinetic Spectrophotometry,简称KSP)逐渐成为抗坏血酸含量检测的新方法。
本文将对催化动力学光度法的原理、实验条件、影响因素等方面进行详细阐述，以期为抗坏血酸含量检测提供理论依据。
二、催化动力学光度法原理催化动力学光度法是一种基于物质在特定波长下吸收或发射光线的特性，通过测量样品溶液中物质的吸光度或发射光谱来定量分析的方法。
其基本原理是：当一定量的抗坏血酸与某种金属离子(如铁、锰、锌等)形成络合物时，这种络合物在特定波长下具有较强的吸收或发射能力。
因此，通过测量样品溶液在该波长下的吸光度或发射光谱，可以推算出抗坏血酸的含量。
催化动力学光度法的关键在于选择合适的络合物和检测器。
目前常用的络合物有硫酸亚铁、氯化锌等。
检测器主要有单色仪、双色仪、荧光检测器等。
在实际操作过程中，需要根据具体样品和检测需求选择合适的络合物和检测器。
三、实验条件1. 光源：催化动力学光度法通常采用紫外可见光源，如汞灯、氙灯等。
光源的选择应考虑其波长范围、稳定性、强度等因素。
光源的位置和角度也会影响到测量结果，需要合理调整。
2. 光路系统：光路系统主要包括样品激发器、光电倍增管(PMT)、光电转换器等。
样品激发器用于产生特定波长的激光束；PMT用于接收样品溶液中的光线并转化为电信号；光电转换器用于将电信号放大并输出至数据处理系统。
在设计光路系统时，需要注意光源与样品之间的距离、透镜的选择等因素。
3. 数据处理系统：数据处理系统主要包括数据采集软件、数据处理算法等。
抗坏血酸氧化酶和多酚氧化酶活性的测定(精)
六、思考题
1.多酚氧化酶活性测定实验中计算多酚氧化酶活性
时为什么要减去抗坏血酸氧化酶活性？
2.测定多酚氧化酶和抗坏血酸氧化酶活性时加入偏
磷酸的作用是什么？
抗坏血酸 焦儿茶酚 偏磷酸 2 2 2 2 2 2 1 1 1 1 1
酶溶液 2 2 2 2 2 2
偏磷酸 (保温一定时间后) 1 1 1 1 1 1
五、试验结果
(1)抗坏血酸氧化酶活性按下式计算： 抗坏血酸氧化酶活性[氧化抗坏血酸毫克数/(克鲜重· 分)] =[ V′-( V 1- V 2)] ×0.44 (V/a)/(w×a) 式中：V′=滴定3号空白所用去的碘液毫升数； V1=滴定1号瓶所用去的碘液毫升数； V2=滴定2号瓶所用去的碘液毫升数； 0.44=每毫升5/6mmol碘液氧化抗坏血酸毫克数； V=提取液总体积（ml）； a=测定时所用提取液的ml数 w＝样品鲜重(g) t＝测定时间(分)。
利用单位时间内单位植物材料抗坏血酸的氧化量 利 用 间接表示多酚氧化酶的活性：
多酚氧化酶
儿茶酚＋O2
儿茶醌＋H2O
儿茶醌+抗坏血酸→儿茶酚＋脱氢抗坏血酸
三、实验材料
梨果肉
四、实验步骤
1．酶液提取 2．酶活性的测定（按下表配制反应体系）
瓶 号 1 2 3 4 5 6
缓冲液 4 4 4 3 3 3
+
1 2
抗坏血酸氧化酶
O2
O O H
C C C C H O
+
H2O
H
HO
C
C H
HO
CH2OH
抗坏血酸
CH2OH
脱氢抗坏血酸
利用碘液滴定剩余抗坏血酸
O
C HO HO H HO C C C C H O + C O C C C C H O O
抗氧化酶活性测定方法
抗氧化酶活性测定方法抗氧化酶是一类能够帮助生物体减轻或消除自由基对细胞和组织的损伤的酶。
其中三个主要的抗氧化酶分别是超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)。
测定这些抗氧化酶的活性可以帮助我们了解细胞和组织内抗氧化能力的变化，从而评估对抗氧化应激的能力。
以下是常用的测定这些抗氧化酶活性的方法。
1.NBT法：超氧化物歧化酶能够催化过氧化脱氢麦角酮（NBT）被还原成紫色水溶性产物，通过测定产物的吸光度来确定SOD的活性。
具体步骤如下：（1）准备反应体系：称取适量的细胞提取液，加入适量的NBT缓冲液。
（2）开始反应：置于适当的温度和时间下。
（3）停止反应：加入硝酸，停止NBT的还原反应。
（4）测定吸光度：使用分光光度计测量产生的相对吸光度。
2.氰化硝酸法：该方法是通过抑制SOD对自由基的清除作用，使过氧化物离子被产生，进而通过测定过氧化物离子的吸光度来间接测定SOD的活性。
具体步骤如下：（1）准备反应体系：称取适量的细胞提取液，加入适量的氰化钾和亚硝酸钠。
（2）开始反应：加入适量的氧化剂，使之和SOD反应生成过氧化物。
（3）测定吸光度：使用分光光度计测量过氧化物离子产生的相对吸光度。
1.亚硫酸盐法：过氧化物酶能够催化亚硫酸盐氧化成差二价铁离子，通过差二价铁离子与硫酸铵生成蓝色络合物来测定POD的活性。
具体步骤如下：（1）准备反应体系：称取适量的细胞提取液，加入适量的亚硫酸铵和硫酸。
（2）开始反应：加入适量的H2O2，使之和POD反应生成差二价铁离子。
（3）停止反应：加入硫酸铵，停止POD对H2O2的催化作用。
（4）测定吸光度：使用分光光度计测量产生的相对吸光度。
2.过氧化氢法：过氧化物酶能够催化过氧化氢分解成氧气和水，通过测定生成的O2的相对浓度来测定POD的活性。
具体步骤如下：（1）准备反应体系：称取适量的细胞提取液，加入适量的过氧化氢。
（2）开始反应：加入过氧化物酶，使之和过氧化氢反应。
多酚氧化酶、抗坏血酸氧化酶的测定
多酚氧化酶、抗坏血酸氧化酶的测定方法（一）试剂：1、0.02mol/l焦儿茶酚溶液：称0.22克焦儿茶酚溶于100毫升蒸馏水中，现用现配。
2、0.1mol/l碘酸钾：0.3567克碘酸钾溶于蒸馏水，定容至100毫升。
3、0.005mol/l碘液：碘化钾2.5克溶于200毫升蒸馏水中，加冰醋酸1毫升，再加0.1mol/l 碘酸钾12.5毫升，最后加蒸馏水定容至250毫升。
4、pH6.0磷酸缓冲液：87.7毫升A+12.3毫升B，用蒸馏水稀释至200毫升。
贮备液A：0.2mol/l磷酸二氢钠（27.6g NaH2PO4·H2O用蒸馏水配成1000ml）。
贮备液B：0.2mol/l磷酸氢二钠（53.65g Na2HPO4·7H2O或71.7g Na2HPO4·12H2O用蒸馏水配成1000毫升）5、其它：1%淀粉；10%偏磷酸；0.1%抗坏血酸（现用现配）方法：1、粗酶提取：称取新鲜样品2克，剪碎，置于研钵中，加入少量pH6.0磷酸缓冲液和少许石英砂，于冰浴中迅速研磨至匀浆，将全部材料用缓冲液冲洗入50毫升容量瓶中，并定容至刻度。
在18~20度下每隔3分钟摇动1次，共5次，然后再静置15~20分钟，其上清液即为粗酶提取液（可倾入干洁的三角瓶中备用）。
2、活性测定：取干洁50毫升三角瓶6只（编号），按照下表向各瓶中加入pH6.0磷酸缓冲液、0.1%抗坏血酸、0.02mol/l焦儿茶酚，并向③号瓶及⑥号瓶各加10%偏磷酸。
然后将三角瓶置于18~20度水浴或放在室温下使内外温度达到平衡之后，每隔1分钟向各瓶中依次加入酶液2毫升，全部加完后保温3分钟，再按原顺序仍然间隔1分钟向①、②、④、⑤号各瓶加入偏磷酸1毫升（注意：加完2号瓶后应间隔2分钟再加4号瓶），用于终止酶的活性。
最后向各瓶中加入1%淀粉溶液3滴作为指示剂，摇匀后用微量滴定管以0.005mol/l碘液滴定，当溶液呈现淡蓝色为止，记录碘液消耗量。
抗坏血酸过氧化物酶
抗坏血酸过氧化物酶简介抗坏血酸过氧化物酶（Ascorbate Peroxidase，APX）是一种存在于植物组织中的重要酶类，主要参与抗氧化反应。
它是抗氧化系统中的关键酶之一，通过催化还原型抗坏血酸（维生素C，Ascorbate）与过氧化氢（H2O2）之间的反应，起到抗氧化保护细胞的作用。
结构和特点抗坏血酸过氧化物酶是一种二聚体酶，由两个相同或相似的亚基组成。
每个亚基都包含一个铁离子，这个铁离子嵌入在酶的催化中心中，起到催化反应的关键作用。
抗坏血酸过氧化物酶的活性中心由一个高度保守的四个氨基酸残基组成，分别是组氨酸（His），赖氨酸（Arg），维氨酸（Trp），以及两个半胱氨酸（Cys），这些氨基酸残基通过配位到铁离子上形成催化中心。
催化机制抗坏血酸过氧化物酶的催化过程包括两个连续的步骤：1.还原步骤：还原型抗坏血酸通过供体氧化过程被氧化为脱氢抗坏血酸。
这个过程中，活性中心的铁离子接受还原型抗坏血酸的氢原子，并同时失去一个电子形成五价铁，还原型抗坏血酸则被氧化为脱氢抗坏血酸。
2.氧化步骤：将过氧化氢与脱氢抗坏血酸反应生成水和抗坏血酸。
在这一步骤中，五价铁复原为二价铁，并将过氧化氢还原为水。
这两个步骤交替进行，完成抗坏血酸和过氧化氢之间的催化反应。
生理功能抗坏血酸过氧化物酶在植物的抗氧化防御系统中发挥着重要的作用。
它通过催化还原型抗坏血酸与过氧化氢之间的反应，将有害的过氧化物转化为无害的物质，起到保护细胞免受过氧化物伤害的作用。
此外，抗坏血酸过氧化物酶还参与调节细胞内抗氧化系统的平衡。
当细胞受到外界胁迫或环境压力时，抗坏血酸过氧化物酶的活性会上调，以增加细胞对抗氧化应激的能力。
应用价值抗坏血酸过氧化物酶广泛应用于生物学和农业领域。
在生物学研究中，抗坏血酸过氧化物酶是测定细胞抗氧化能力的重要指标之一。
通过测定抗坏血酸过氧化物酶的活性，可以评估细胞对氧化应激的抵抗能力。
在农业方面，抗坏血酸过氧化物酶的研究对提高作物的抗逆能力具有重要意义。
植物体内抗坏血酸氧化酶和多酚氧化酶活性的测定
抗坏血酸氧化酶和多酚氧化酶活性的测定
【原理】
O C
O C
HO C HO C
O
1
抗坏血酸氧化酶
2 O2
OC OC
O
H2O
HC
HC
HO C H CH2OH
HO C H CH2OH
抗坏血酸氧化酶和多酚氧化酶活性的测定
【原理】O
C
HO C HO C
O I2
HC
HO C H CH2OH
O C
OC O 2HI
因此，多酚氧化酶的测定与抗坏血酸氧化酶的测 定类似，除了向反应体系中加入多酚氧化酶的底 物-多元酚类，还要加入抗坏血酸。多酚氧化酶 的活性，可以间接由抗坏血酸的消耗量求得。
抗坏血酸氧化酶和多酚氧化酶活性的测定
【仪器设备】 1．研钵：1个； 2．50 mL量瓶：1个； 3．50 mL三角瓶：9个； 4．微量滴定管：1支； 5．5 mL移液管1支、2 mL 2支、1 mL 6．恒温水浴。
抗坏血酸氧化酶和多酚氧化酶活性的测定
【方法步骤】
瓶号
试剂（mL）
备注
缓冲液 抗坏血酸 焦儿茶酚 酶溶液 偏磷酸
1
4
2
0
2
测定抗坏血酸氧化酶
2
4
2
0
2
同上
3
4
2
0
2
同上
4
4
2
0
2
1
空白测定
5
3
2
1
2
测定多酚氧化酶
6
3
2
1
2
同上
7
3
2
1
2
同上
8
抗氧化酶测定实验方法
抗氧化酶测定实验方法抗氧化酶是一类能够抵御细胞对氧自由基的毒性的酶。
抗氧化酶包括超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）等。
这些酶在细胞内能够将有害的氧自由基转化为无害的化合物，从而起到保护细胞免受氧自由基反应的毒性作用。
因此，测定抗氧化酶的活性能够反映细胞对氧自由基的抵御能力，对研究氧化应激、疾病发生机制等具有重要意义。
以下是一种常用的抗氧化酶测定方法的详细步骤：实验材料和试剂：1.组织样本或细胞培养物2.生理盐水（PBS）3. 超氧化物歧化酶(Abfrontier, LF-MA0011, 200U/mg, 冻干粉)4. 过氧化氢酶(Sigma, P2927, ≥2,000,000 units/mg protein, 溶于水)5. 谷胱甘肽过氧化物酶(Sigma, G5911, ≥300 units/mg protein,冻干粉)6. 过硫酸铵（Sigma, A9294）7.磷酸盐缓冲液(pH7.4，0.1M)8.丙酮9. 硫酸(Sigma, 1.84 M)10. 精氨酸(Sigma, A8094)11. 苯胂(Sigma, A8731)12. 硝基蓝色素(Sigma, N-5511)14. 高锰酸钾(Sigma, S2547)16. 硝基咪唑(NBT，Solarbio, S8190)17. EDTA二钠(Sigma, E6635)18. BSA(Sigma, A7906)19. 氯化三联氨(Sigma, A2251)20. Tris缓冲液(pH 8.0，0.1M)21. 高吉人(ABClonal, HRP-6002，5,000 IU/mg, 冻干粉)23.氯仿24.醋酸乙酯26.乙酸钠28. 脑磷脂(纯度≥98%，Shenggong, 1003J)30.SDS-试剂盒步骤：1.制备样本：将组织样本或细胞培养物均匀取样，使用PBS洗涤并平均分配到多个离心管中。
抗氧化酶活性等测定方法
一、试剂配置 1、PBS 提取液:每 L 水依次加入 MES(195、2x0. 05=9、76g)、山梨糖醇(0、33x182. 2=60、126g). NaCl(0、010x58、5=0. 585g)、MgCI(0、002x95=0、19g)、EDTA(292. 25x0. 002=0. 5845g). KH2PO4(200x0. 0005=0. Ig)；使用时加入 ASA-Na(!98. 1x0. 002=0. 3962g);2、悬浮液:将 PBS 提取液中得 MES 换为 238、3x0、05=11、915g 得 HEPES(238、3x0、05=1 k 915g);3、80%PercoI;80ml 原液+20ml 水：40%Percol:40ml 原液+60ml 水;实际配制:PBS 提取液20001111（3个处理*2个品种*3个靈复*20m!*3次=1080ml ）.悬浮液1001111（3个处理*2个品种*3个重复次=54n 】l ）;80%Percol 200ml; 40%Percol 200nik (3 个处理*2 个品种*3 个重复*3ml*3 次=162ml)二、提取步骤 1、lOg 鮮样加 20ml 提取 PBS(50mM MES PH6、1,含O 、33M 山梨糖醇JOmM NaCL2mM MgCkfmM EDTA.O 、5 mMKH2POj ・2mM ASA ・Na ・ASA ・Na 使用前现配现加) 2、快速研曆，使叶片碎成绿豆粒大小4层纱布过滤，去除残渣（注意过滤时不可用力挤压，以免叶绿体膜破碎） 3、滤液2000g 3min •小心倒出上淸液，将离心管放入离心机后,使离心机得加速很快上升到预崔值（水平转头.加速度调到9）,约经30s 后很快使加下降停止，整个离心持续大约2・3min 左右完成;4、沉淀用1ml 提取液漂洗表面悬浮物;5、用 1ml 悬浮液（50mMHEPES pH7. 6•含0. 33 mM 山梨糖醇」0NaCl ・2mM MgCb2mM EDTA.O 、5 niMKH2PO4-2mM ASA-Na.ASA-Na 使用前现配现加）将沉淀悬浮，在分散叶绿体时宜用毛笔轻轻刷，或者用手 握住离心管在冰块之间搅动，便叶绿体由于震动分散开来，不要用棉球吸滤，以防被膜压破。
抗坏血酸过氧化物酶测定方法
抗坏血酸过氧化物酶测定方法一、目的要求学习果蔬组织中抗坏血酸过氧化物酶活性的测定原理和方法。
二、基本原理抗坏血酸过氧化物酶（Ascorbate peroxidase，APX；AsA-POD）是以抗坏血酸为电子供体的专一性强的过氧化物酶。
APX能催化抗坏血酸与H2O2反应而被氧化形成单脱氢抗坏血酸。
随着抗坏血酸被氧化，溶液在波长290 nm处的吸光度值下降，根据单位时间内吸光度值的减少，可以计算出APX活性。
三、材料、仪器及试剂（一）材料梨、桃、番茄等。
（二）仪器及用具高速冷冻离心机、紫外分光光度计、研钵、试管、计时器、容量瓶（100 mL、200 mL、1 000 mL）、电子天平。
（三）试剂：1．100 mmol/L、pH 7.5磷酸钾（K2HPO4-KH2PO4）缓冲液母液A（1 mol/L K2HPO4）：称取174.18 g磷酸氢二钾，用蒸馏水溶解、定容至1 000 mL。
母液B（1 mol/L KH2PO4）：称取136.09 g磷酸二氢钾，用蒸馏水溶解、定容至1 000 mL。
取83.4 mL母液A和16.6 mL母液B，混合，调节pH值至7.5，稀释、定容至1 000 mL。
2．提取缓冲液（含0.1 mmol/L EDTA、1 mmol/L抗坏血酸和2% PVPP）称取2.9 mg EDTA，17.6 mg抗坏血酸和2 g PVPP，用100 mmol/L、pH7.5磷酸钾缓冲液溶解、定容至100 mL。
4℃预冷保存。
3．反应缓冲液（含0.1 mmol/L EDTA和0.5 mmol/L抗坏血酸）称取2.9 mg EDTA和8.8 mg抗坏血酸，用50 mmol/L、pH7.5磷酸钾缓冲液溶解、定容至100 mL。
4℃预冷保存。
4．2 mmol/L H2O2取1.14 mL 30% H2O2，用蒸馏水稀释至100 mL，混匀，即得200 mmol/L H2O2溶液。
再取1.0 mL该溶液，稀释至100 mL，即为2 mmol/L H2O2溶液。
抗氧化酶(SOD、POD、CAT)活性测定方法
抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性测定方法一、超氧化物歧化酶（SOD）活性测定（氮蓝四唑光化还原法）1、试剂的配制（1）0.05mol/L磷酸缓冲液(PBS，pH7.8)：A母液：0.2mol/L磷酸氢二钠溶液: 取Na2HPO4·12H2O（分子量358.14）71.7g；B母液：0.2mol/L磷酸二氢钠溶液：取NaH2PO4·2H2O（分子量156.01）31.2g。
分别用蒸馏水定容到1000ml。
0.05mol/L PBS（pH7.8）的配制：分别取A母液(Na2HPO4) 228.75ml，B母液(NaH2PO4) 21.25ml，用蒸馏水定容至1000ml。
参考文献：李合生主编：植物生理生化实验原理和技术.高等教育出版社，2000：267～268。
（2）14.5mM甲硫氨酸溶液：取2.1637g Met用磷酸缓冲液（pH7.8）定容至1000ml。
（3）30μM EDTA-Na2溶液：取0.001gEDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至100ml。
（4）60μM核黄素溶液：取0.0023g核黄素用磷酸缓冲液定容至100ml，避光保存。
（5）2.25mM 氮蓝四唑(NBT)溶液：取0.1840g NBT用PBS定容至100ml，避光保存。
酶液制备：取0.2g（可视情况调整）样品（新鲜叶片或根系）洗净后置于预冷的研钵中，加入1.6ml 50mmol/L预冷的磷酸缓冲液（pH7.8）在冰浴上研磨成匀浆，转入离心管中在4℃、12000g下离心20min，上清液即为酶液。
2、酶活性测定（1）反应混合液配制(以60个样为准)：分别取Met溶液162ml，EDTA-Na2溶液0.6ml，磷酸缓冲液5.4ml，NBT溶液6ml，核黄素溶液6ml,混合后摇匀；（2）分别取3ml反应混合液和30μl酶液于试管中（3）将试管置于光照培养箱中在4000 lux光照下反应20min；同时做两支对照管，其中1支试管取3ml反应混合液加入30μl PBS（不加酶液）照光后测定作为最大光还原管，另1支只加缓冲液置于暗中测定时用于调零。
抗坏血酸氧化酶(ascorbate oxidase,AAO)活性测定试剂盒说明书
货号：MS1303 规格：100管/96样抗坏血酸氧化酶（ascorbate oxidase，AAO）活性测定试剂盒说明书微量法注意：正式测定之前选择 2-3个预期差异大的样本做预测定。
测定意义：AAO是定位于植物细胞壁的糖蛋白，属“蓝铜氧化酶”家族。
细胞壁内的抗坏血酸和AAO 与细胞壁的代谢和生长有着密切的联系。
AAO氧化AsA所形成的MDHA可通过质膜上的细胞色素b 还原，该过程中电子的跨膜运输能够促进细胞生长。
测定原理：AAO可直接氧化AsA，通过测定AsA的氧化量，可计算得AAO活力。
实验中所需仪器及设备：低温离心机、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板（UV 板）、可调式移液器、研钵、冰、蒸馏水。
试剂组成和配制：试剂一：液体×1 瓶，4℃保存。
试剂二：液体×1 瓶，4℃保存。
试剂三：粉剂×1 瓶，4℃保存。
临用前加入2mL蒸馏水充分溶解。
粗酶液提取：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10 的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL 试剂一）进行冰浴匀浆。
16000g，4℃离心10min，取上清置冰上待测。
AAO 测定操作：1. 分光光度计/酶标仪预热30 min，调节波长到265 nm。
2. 试剂二在 25℃水浴锅中预热30 min。
3. 依次在微量石英比色皿/96孔板中加入20μL上清液、170μL预热的试剂二和10μL试剂三，迅速混匀后在265nm测定10s和130s光吸收A1和A2，△A =A1-A2。
AAO 活性计算公式：a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下(1). 按蛋白浓度计算AAO 活性单位定义：25℃中每毫克蛋白每分钟氧化1nmol AsA为1个酶活单位。
AAO(nmol/min /mg prot) = △A÷(ε×d）×V 反总×109÷(Cpr×V 样)÷T= 92.4×△A÷Cpr(2). 按样本质量计算AAO 活性单位定义：25℃中每克样本每分钟氧化1nmol AsA 为1个酶活单位。
抗氧化酶活性等测定方法之欧阳治创编
叶绿体的提取一、试剂配置1、PBS提取液：每L水依次加入MES(195.2×0.05=9.76g)、山梨糖醇(0.33×182.2=60.126g)、NaCl （0.010×58.5=0.585g）、MgCl （0.002×95=0.19g）、EDTA（292.25×0.002=0.5845g）、KH2PO4（200×0.0005=0.1g）；使用时加入ASA-Na （198.1×0.002=0.3962g）;2、悬浮液：将PBS提取液中的MES换为238.3×0.05=11.915g的HEPES （238.3×0.05=11.915g）；3、80%Percol：80ml原液+20ml水；40%Percol：40ml原液+60ml水；实际配制：PBS 提取液2000ml(3个处理*2个品种*3个重复*20ml*3次=1080ml),悬浮液100ml （3个处理*2个品种*3个重复*1ml*3次=54ml ）;80%Percol 200ml; 40%Percol 200ml.（3个处理*2个品种*3个重复*3ml*3次=162ml ）二、提取步骤1、10g 鲜样加20ml 提取PBS （50mM MES PH6.1，含0.33M 山梨糖醇，10mM NaCl ，2mM MgCl 2，2mM EDTA ，0.5 mMKH 2PO 4，2mM ASA-Na ，ASA-Na 使用前现配现加）2、快速研磨，使叶片碎成绿豆粒大小，4层纱布过滤，去除残渣（注意过滤时不可用力挤压，以免叶绿体膜破碎）3、滤液2000g3min ，小心倒出上清液，将离心管放入离心机后，使离心机的加速很快上升到预定值(水平转头，加速度调到9)，约经30s 后很快使其下降停止，整个离心持续大约2-3min 左右完成；4、沉淀用1ml 提取液漂洗表面悬浮物；5、用1ml 悬浮液（50mM HEPES pH 7.6，含0.33 mM 山梨糖醇，10mM NaCl ，2mM MgCl 2，2mM EDTA ，0.5 mMKH 2PO 4，2mM ASA-Na ，ASA-Na 使用前现配现加）将沉淀悬浮，在分散叶绿体时宜用毛笔轻轻刷，或者用手握住离心管在冰块之间搅动，使叶绿体由于震动分散开来，不要用棉球吸滤，以防被膜压破。
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货号：QS1303 规格：50管/48样抗坏血酸氧化酶（ascorbate oxidase ，AAO）活性测定试剂盒说明书
紫外分光光度法
注意：正式测定之前选择 2-3个预期差异大的样本做预测定。
测定意义：
AAO是定位于植物细胞壁的糖蛋白，属“蓝铜氧化酶”家族。
细胞壁内的抗坏血酸和AAO 与细胞壁的代谢和生长有着密切的联系。
AAO 氧化 AsA 所形成的 MDHA 可通过质膜上的细胞色素b还原，该过程中电子的跨膜运输能够促进细胞生长。
测定原理：
AAO可直接氧化AsA，通过测定AsA的氧化量，可计算得AAO活力。
自备实验用品及仪器：
低温离心机、紫外分光光度计、1mL石英比色皿、可调式移液器、研钵、冰、蒸馏水。
试剂组成和配制：
试剂一：液体50mL×1瓶，4℃保存。
试剂二：液体50mL×1瓶，4℃保存。
试剂三：粉剂×1瓶，4℃避光保存。
临用前加入5mL蒸馏水充分溶解。
粗酶液提取：
按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL 试剂一）进行冰浴匀浆。
16000g，4℃离心10min，取上清置冰上待测。
AAO测定操作：
1. 分光光度计预热30 min，调节波长到265 nm，蒸馏水调零。
2. 试剂二在25℃水浴锅中预热30 min。
3. 依次在1 mL石英比色皿中加入100μL上清液、850μL预热的试剂二和50μL试剂三，迅速混匀后在265nm测定10 s和130 s光吸收A1和A2，△A =A1-A2。
AAO活性计算公式：
(1). 按蛋白浓度计算
AAO活性单位定义：25℃中每毫克蛋白每分钟氧化1nmol AsA 为1个酶活单位。
AAO(nmol/min /mg prot) = △A÷(ε×d）×V反总×109÷(Cpr×V样)÷T
= 92.4×△A÷Cpr
(2). 按样本质量计算
AAO活性单位定义：25℃中每克样本每分钟氧化1nmol AsA 为1个酶活单位。
AAO(nmol/min/g鲜重) = △A÷(ε×d）×V反总×109÷(W×V样÷V样总)÷T
= 92.4×△A÷W
ε：AsA在265nm处摩尔吸光系数为5.42×104 L/mol/cm；d：比色皿光径（cm），1 cm；V反总：反应体系总体积（L），1000μL=1×10-3L；106：1mol=1×109nmol；Cpr：上清液蛋白质浓度（mg/mL），需要另外测定，建议使用本公司BCA蛋白质含量测定试剂盒；V样：加入反应体系中上清液体积（mL），100μL=0.1 mL；V样总：加入提取液体积，1mL；W，样本质量，g；T：催化反应时间（min），2min。
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注意事项:
配制好的试剂放在4℃保存，三天内使用完。
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