辣椒疫霉纤维素合酶蛋白及其编码基因与应用的制作方法

本技术介绍了一种来自辣椒疫霉菌的纤维素合酶蛋白PcCesA2和PcCesA4及其编码基因与应用。本技术的纤维素合酶蛋白序列为如序列3或序列4。PcCesA2蛋白缺失后辣椒疫霉菌丝生长减慢、休止孢畸形膨大且萌发率降低、细胞壁结构变化、菌落形态改变、致病力降低等；PcCesA4蛋白缺失后辣椒疫霉菌丝生长减慢、游动孢子数量减少、致病力降低等；PcCesA2和PcCesA4蛋白同时缺失后辣椒疫霉菌丝生长减慢、游动孢子数量减少、休止孢畸形膨大且萌发率降低、细胞壁结构变化、菌落形态改变、致病力降低等。以上结论均为探究辣椒疫霉发育及致病分子机制提供了技术基础，为未来新型杀菌剂的研发提供了分子靶标。

技术要求

1.一类辣椒疫霉病菌(Phytophthora capsici)纤维素合酶蛋白，是如下A1)或A2)或A3)或A4)的蛋白质：

A1)氨基酸序列是如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示的蛋白质；

A2)在如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；

A3)将如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能由SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示的蛋白衍生的蛋白质；

A4)与如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列相似性在75％以上，优选在85％以上，更优选在95％以上且具有与如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列相同功能的氨基酸序列。

2.编码权利要求1所示的纤维素合酶蛋白的编码基因；优选的，所述编码基因为如下B1)或B2)或B3)：

B1)序列表中SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.9所述的核苷酸序列所示的DNA分子；

B2)与B1)所示的核苷酸序列的具有75％以上或85％以上或95％以上同一性，且编码权利要求1中所述纤维素合酶蛋白的cDNA分子或DNA分子；

B3)在严格条件下与B1)或B2)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1中所述纤维素合酶蛋白的cDNA 分子或DNA分子。

3.权利要求2所述的编码基因转录得到的RNA分子；

优选的，所述RNA分子的序列为如下C1)或C2)：

C1)与如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的DNA序列转录的RNA序列的相似性在75％以上，进一步优选在85％以上，更优选在95％以上且具有与如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的DNA序列转录的RNA序列相同功能的RNA序列；

C2)如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的DNA序列转录的RNA序列。

4.含有与权利要求2所示的编码基因或权利要求3所述的RNA分子相关的核酸分子的生物材料，为下述D1)至D10)中的任一种：

D1)含有权利要求2所述编码基因的表达盒；

D2)含有权利要求2所述编码基因的重组载体、或含有D1)所述表达盒的重组载体；

D3)含有权利要求2所述编码基因的重组微生物、或含有D1)所述表达盒的重组微生物、或含有D2)所述重组载体的重组微生物；

D4)含有权利要求2所述编码基因的转基因植物细胞系、或含有D1)所述表达盒的转基因植物细胞系；

D5)含有权利要求2所述编码基因的转基因植物组织、或含有D2)所述表达盒的转基因植物组织；

D6)含有权利要求2所述编码基因的转基因植物器官、或含有D2)所述表达盒的转基因植物器官；

D7)抑制权利要求2所述编码基因表达或使其缺失的核酸分子；

D8)含有D7)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因植物细胞系；

D9)抑制权利要求3所述RNA分子翻译的核酸分子；

D10)产生D9)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因植物细胞系。

5.一组成套使用的辣椒疫霉病菌纤维素合酶蛋白组合或者DNA组合，是下述E1)或E2)：

E1)由序列表中SEQ ID NO.3所示的蛋白质、序列表中SEQ ID NO.4所示的蛋白质的组合；

E2)由序列表中SEQ ID NO.1所示的DNA分子、序列表中SEQ ID NO.2所示的DNA分子的组合。

6.权利要求1所述纤维素合酶蛋白、权利要求2所示的编码基因或权利要求3所述的RNA分子或权利要求4所述的生物材料或权利要求5所示的辣椒疫霉病菌纤维素合酶蛋白组合或者DNA组合的应用，其特征在于：所述应用为下述1)-6)中任一种或几种：

1)在调控辣椒疫霉游动孢子产量和/或休止孢萌发率、和/或维持或破坏休止孢野生型形态中的应用；

2)在维持或破坏辣椒疫霉细胞壁正常结构和菌落正常形态中的应用；

3)在调控辣椒疫霉菌丝生长速率中的应用；

4)在调控辣椒疫霉侵染寄主能力中的应用；

5)在调控辣椒疫霉对寄主的致病性中的应用；

6)在抑制和/或杀灭辣椒疫霉病菌中的应用。

优选的，包括通过抑制如权利要求2所述的编码基因中的转录或使其灭活，或抑制如权利要求3所述的RNA分子的翻译，或抑制和/或灭活如权利要求1所述的纤维素合酶蛋白来实现1)-6)所述的应用。

7.权利要求1所述纤维素合酶蛋白、权利要求2所示的编码基因或权利要求3所述的RNA分子或权利要求4所述的生物材料或权利要求5所述的蛋白组合或者DNA组合在作为抑菌或杀菌剂靶标筛选辣椒疫霉病菌抑菌或杀菌剂中的应用。

8.一种筛选或辅助筛选辣椒疫霉病菌抑菌和/或杀菌剂的方法，所述方法包括将待检测物应用于所述辣椒疫霉病菌，当所述待检测物能够抑制如权利要求2所述的编码基因的转录，或抑制如权利要求3所述的RNA分子的翻译，或抑制如权利要求1所述的纤维素合酶蛋白的活性或使其灭活，则所述待检测物为所述辣椒疫霉病菌的抑菌和/或杀菌剂。

9.一种降低辣椒疫霉病菌的活性的方法，包括下述步骤：抑制如权利要求2所述的编码基因的转录或使其缺失，或抑制如权利要求3所述的RNA分子中的翻译，或抑制如权利要求1所述的纤维素合酶蛋白的活性或使其灭活；

其中，所述降低辣椒疫霉病菌的活性为降低辣椒疫霉病菌对寄主的侵染能力和/或对寄主的致病性，和/或抑制辣椒疫霉病菌的游动孢子产量，和/或抑制休止孢萌发，和/或破坏休止孢野生型形态，和/或降低辣椒疫霉病菌的菌丝生长速度，和/或使辣椒疫霉细胞壁结构形态改变；和/或使辣椒疫霉菌落形态畸形；

优选的，通过对辣椒疫霉中序列表中SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的基因进行基因敲除，以使序列表中SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示的蛋白质灭活。

10.抑制权利要求1所述纤维素合酶蛋白质表达和/或活性的物质在制备植物辣椒疫霉病菌杀菌剂中的应用；优选的，所述抑制纤维素合酶蛋白质表达和/或活性的物质为抑制纤维素合酶蛋白质表达，和/或抑制纤维素合酶蛋白质的编码基因的转录，和/或抑制纤维素合酶蛋白质的编码基因转录得到的RNA分子的翻译的物质。

技术说明书

辣椒疫霉纤维素合酶蛋白及其编码基因与应用

技术领域

本技术属于生物技术领域，具体涉及来自辣椒疫霉(Phytophthora capsici)的纤维素合酶蛋白PcCesA2和PcCesA4及其编码基因与应用。