辣椒疫霉纤维素合酶蛋白及其编码基因与应用的制作方法

本技术介绍了一种来自辣椒疫霉菌的纤维素合酶蛋白PcCesA2和PcCesA4及其编码基因与应用。

本技术的纤维素合酶蛋白序列为如序列3或序列4。

PcCesA2蛋白缺失后辣椒疫霉菌丝生长减慢、休止孢畸形膨大且萌发率降低、细胞壁结构变化、菌落形态改变、致病力降低等；PcCesA4蛋白缺失后辣椒疫霉菌丝生长减慢、游动孢子数量减少、致病力降低等；PcCesA2和PcCesA4蛋白同时缺失后辣椒疫霉菌丝生长减慢、游动孢子数量减少、休止孢畸形膨大且萌发率降低、细胞壁结构变化、菌落形态改变、致病力降低等。

以上结论均为探究辣椒疫霉发育及致病分子机制提供了技术基础，为未来新型杀菌剂的研发提供了分子靶标。

技术要求1.一类辣椒疫霉病菌(Phytophthora capsici)纤维素合酶蛋白，是如下A1)或A2)或A3)或A4)的蛋白质：A1)氨基酸序列是如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示的蛋白质；A2)在如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；A3)将如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能由SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示的蛋白衍生的蛋白质；A4)与如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列相似性在75％以上，优选在85％以上，更优选在95％以上且具有与如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列相同功能的氨基酸序列。

2.编码权利要求1所示的纤维素合酶蛋白的编码基因；优选的，所述编码基因为如下B1)或B2)或B3)：B1)序列表中SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.9所述的核苷酸序列所示的DNA分子；B2)与B1)所示的核苷酸序列的具有75％以上或85％以上或95％以上同一性，且编码权利要求1中所述纤维素合酶蛋白的cDNA分子或DNA分子；B3)在严格条件下与B1)或B2)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1中所述纤维素合酶蛋白的cDNA 分子或DNA分子。

3.权利要求2所述的编码基因转录得到的RNA分子；优选的，所述RNA分子的序列为如下C1)或C2)：C1)与如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的DNA序列转录的RNA序列的相似性在75％以上，进一步优选在85％以上，更优选在95％以上且具有与如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的DNA序列转录的RNA序列相同功能的RNA序列；C2)如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的DNA序列转录的RNA序列。

4.含有与权利要求2所示的编码基因或权利要求3所述的RNA分子相关的核酸分子的生物材料，为下述D1)至D10)中的任一种：D1)含有权利要求2所述编码基因的表达盒；D2)含有权利要求2所述编码基因的重组载体、或含有D1)所述表达盒的重组载体；D3)含有权利要求2所述编码基因的重组微生物、或含有D1)所述表达盒的重组微生物、或含有D2)所述重组载体的重组微生物；D4)含有权利要求2所述编码基因的转基因植物细胞系、或含有D1)所述表达盒的转基因植物细胞系；D5)含有权利要求2所述编码基因的转基因植物组织、或含有D2)所述表达盒的转基因植物组织；D6)含有权利要求2所述编码基因的转基因植物器官、或含有D2)所述表达盒的转基因植物器官；D7)抑制权利要求2所述编码基因表达或使其缺失的核酸分子；D8)含有D7)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因植物细胞系；D9)抑制权利要求3所述RNA分子翻译的核酸分子；D10)产生D9)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因植物细胞系。

5.一组成套使用的辣椒疫霉病菌纤维素合酶蛋白组合或者DNA组合，是下述E1)或E2)：E1)由序列表中SEQ ID NO.3所示的蛋白质、序列表中SEQ ID NO.4所示的蛋白质的组合；E2)由序列表中SEQ ID NO.1所示的DNA分子、序列表中SEQ ID NO.2所示的DNA分子的组合。

6.权利要求1所述纤维素合酶蛋白、权利要求2所示的编码基因或权利要求3所述的RNA分子或权利要求4所述的生物材料或权利要求5所示的辣椒疫霉病菌纤维素合酶蛋白组合或者DNA组合的应用，其特征在于：所述应用为下述1)-6)中任一种或几种：1)在调控辣椒疫霉游动孢子产量和/或休止孢萌发率、和/或维持或破坏休止孢野生型形态中的应用；2)在维持或破坏辣椒疫霉细胞壁正常结构和菌落正常形态中的应用；3)在调控辣椒疫霉菌丝生长速率中的应用；4)在调控辣椒疫霉侵染寄主能力中的应用；5)在调控辣椒疫霉对寄主的致病性中的应用；6)在抑制和/或杀灭辣椒疫霉病菌中的应用。

优选的，包括通过抑制如权利要求2所述的编码基因中的转录或使其灭活，或抑制如权利要求3所述的RNA分子的翻译，或抑制和/或灭活如权利要求1所述的纤维素合酶蛋白来实现1)-6)所述的应用。

7.权利要求1所述纤维素合酶蛋白、权利要求2所示的编码基因或权利要求3所述的RNA分子或权利要求4所述的生物材料或权利要求5所述的蛋白组合或者DNA组合在作为抑菌或杀菌剂靶标筛选辣椒疫霉病菌抑菌或杀菌剂中的应用。

8.一种筛选或辅助筛选辣椒疫霉病菌抑菌和/或杀菌剂的方法，所述方法包括将待检测物应用于所述辣椒疫霉病菌，当所述待检测物能够抑制如权利要求2所述的编码基因的转录，或抑制如权利要求3所述的RNA分子的翻译，或抑制如权利要求1所述的纤维素合酶蛋白的活性或使其灭活，则所述待检测物为所述辣椒疫霉病菌的抑菌和/或杀菌剂。

9.一种降低辣椒疫霉病菌的活性的方法，包括下述步骤：抑制如权利要求2所述的编码基因的转录或使其缺失，或抑制如权利要求3所述的RNA分子中的翻译，或抑制如权利要求1所述的纤维素合酶蛋白的活性或使其灭活；其中，所述降低辣椒疫霉病菌的活性为降低辣椒疫霉病菌对寄主的侵染能力和/或对寄主的致病性，和/或抑制辣椒疫霉病菌的游动孢子产量，和/或抑制休止孢萌发，和/或破坏休止孢野生型形态，和/或降低辣椒疫霉病菌的菌丝生长速度，和/或使辣椒疫霉细胞壁结构形态改变；和/或使辣椒疫霉菌落形态畸形；优选的，通过对辣椒疫霉中序列表中SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的基因进行基因敲除，以使序列表中SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示的蛋白质灭活。

10.抑制权利要求1所述纤维素合酶蛋白质表达和/或活性的物质在制备植物辣椒疫霉病菌杀菌剂中的应用；优选的，所述抑制纤维素合酶蛋白质表达和/或活性的物质为抑制纤维素合酶蛋白质表达，和/或抑制纤维素合酶蛋白质的编码基因的转录，和/或抑制纤维素合酶蛋白质的编码基因转录得到的RNA分子的翻译的物质。

技术说明书辣椒疫霉纤维素合酶蛋白及其编码基因与应用技术领域本技术属于生物技术领域，具体涉及来自辣椒疫霉(Phytophthora capsici)的纤维素合酶蛋白PcCesA2和PcCesA4及其编码基因与应用。

背景技术辣椒疫霉是一种世界性分布的重要植物病原卵菌，可以侵染茄科、豆科、葫芦科等多种植物，引起猝倒、萎蔫及根茎果实腐烂，造成严重经济损失。

该病菌于1918年首次发现，已在美洲、欧洲、亚洲等世界各地造成了许多蔬菜上严重的病害流行。

20世纪60年代，该病害在我国江苏省首次发现，目前已在中国南北方广泛发生，且有逐年加重的趋势。

辣椒疫霉可在寄主的任何生长时期侵染，两到三天就可发生一代，是一种发病周期短流行速度迅猛的毁灭性病害，因其重要性被归为十大卵菌病害之一，受到国内外学者广泛关注和研究。

卵菌细胞壁作为细胞与外界接触的最外层结构，在其生长发育过程中发挥着重要作用，如提供机械强度保护内层细胞，维持渗透压平衡，信息交流等等。

卵菌细胞壁生物合成抑制剂，能够通过抑制细胞壁的合成达到抑制卵菌生长发育和侵染寄主的效果，可以成为卵菌病害防治的有效措施。

游动孢子作为卵菌再侵染的重要来源，当其附着于寄主可转变为休止孢，进一步萌发形成菌丝，直接侵入或通过伤口或自然孔口侵入寄主，这一过程伴随着卵菌细胞壁的形成和结构变化，对于卵菌成功侵染寄主至关重要。

卵菌细胞壁的主要组成为β-1,4糖苷键连接的纤维素，β-1,3葡聚糖及β-1,6葡聚糖，其中纤维素可占整个细胞壁多糖的30％以上。

因此，通过抑制辣椒疫霉细胞壁纤维素的合成，进而抑制其生长发育和侵染过程，可以达到控制辣椒疫病的目的。

技术内容通过技术人的研究发现，辣椒疫霉中的纤维素合酶蛋白与辣椒疫霉细胞壁结构变化，菌丝的生长速率、游动孢子的产量、休止孢萌发以及菌落正常的结构形态密切相关，而植物病害正常的侵染循环与菌丝的细胞壁结构变化，菌丝的生长速率、游动孢子的产量、休止孢萌发以及存活时间呈正相关。

因此可以通过调控纤维素合酶蛋白来破坏细胞壁的结构，减慢菌丝的生长、阻断正常的游动孢子产生，降低休止孢的萌发率，使辣椒疫霉生长发育和侵染寄主的能力减弱，从而控制辣椒疫病的发生发展。

因此，本技术的目的之一是提供一类辣椒疫霉纤维素合酶蛋白，命名为PcCesA2和PcCesA4，来源于辣椒疫霉菌株BYA5，是如下A1)或A2)或A3)或A4)：A1)氨基酸序列是如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示的蛋白质；A2)在如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；A3)将如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示的蛋白衍生的蛋白质；A4)与如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列相似性在75％以上，优选在85％以上，更优选在95％以上且具有与如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列相同功能的氨基酸序列。

为了使A1)中的蛋白便于纯化，可在如序列表中SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上Poly-Arg(RRRRR)、Poly-His(HHHHHH)、FLAG(DYKDDDDK)、Strep-tag II(WSHPQFEK)、c-myc(EQKLISEEDL)等标签。

上述A1)-A4)中的蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述A2)-A4)中蛋白质的编码基因可通过将序列表中SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个核苷酸对的错义突变，和/或在其5’端和/或3’端连上述标签的编码序列得到。