蛋白酶

8.蛋白酶（酸性、中性、碱性）的特征与相应的发酵微生物菌。

答：中性蛋白酶生产菌枯草杆菌1.398,S114,172,放线菌166，栖土曲霉3.942；

碱性蛋白酶生产菌地衣芽孢杆菌2709，短小芽孢杆菌289，209；

酸性蛋白酶生产菌黑曲霉3.350，宇佐美曲霉537，肉桂色曲霉No.81，浆油工业用的米曲霉3042。

按酶的最适pH分类：

①酸性蛋白酶，最适pH2.0-5.0。

②中性蛋白酶，pH7-8。

③碱性蛋白酶，pH9.5-10.5。

为方便起见，微生物蛋白酶常用此分类法。

酸性蛋白酶主要来源于哺乳动物的消化道, 如胃蛋白酶; 部分微生物是酸性蛋白酶的主要来源, 如:目前的商品酸性蛋白酶制剂主要是由黑曲霉发酵生产

分子特性: 酸性蛋白酶的最适pH在2-5范围, 酶蛋白的等电点在pI3-5, 分子量MW30,000-35,000。

②催化特性: 酸性蛋白酶的最适温度因来源不同而有差异, 一般霉菌的蛋白酶的最适温度较高, 大部分在50-60℃范围, 而来源于动物胃粘膜的蛋白酶的最适温度较低, 一般在40℃左右, 但酸性蛋白酶的热稳定性都较差, 一般在50℃都很快失活, 此外, 酶的热稳定性还受到基质的pH的影响; 有些酸性蛋白酶不耐低温, 在低温条件下,很快失活。许多酸性蛋白酶分子中含5-10%多糖，对酶的稳定有益。

中性蛋白酶是最早用于酶制剂工业化生产的蛋白酶, 目前的微生物生产的商品酶制剂的菌种主要有: 枯草杆菌、耐热解蛋白芽孢杆菌、灰色链霉菌、寄生曲霉、米曲霉、栖土曲霉。

除上述微生物生产中性蛋白酶外, 来源于植物的木瓜蛋白酶、无花果蛋白酶、菠萝蛋白酶等都属于中性蛋白酶。

①分子特性: 大部分微生物产生的中性蛋白酶属于金属蛋白酶, 一分子酶蛋白含有一个锌原子, 酶蛋白的分子量在35,000-40,000范围, 等电点pI 8-9, 微生物蛋白酶中, 中性蛋白酶的稳定性最差, 分子之间最容易发生自溶, 即使在低温条件下, 也会发生明显的自溶, 造成分子量明显降低。

②催化特性: 中性蛋白酶的热稳定性较差, 如枯草杆菌的中性蛋白酶在pH7, 60℃处理15min, 失活90%; 栖土曲霉的中性蛋白酶在pH7, 55℃处理10min, 失活80%以上; 以酪蛋白为底物时, 枯草杆菌蛋白酶的最适pH7-8、热解蛋白芽孢杆菌的中性蛋白酶的最适pH7-9、栖土曲霉的中性蛋白酶pH6.5-7.5; 最适温度受测定时的反应时间有直接关系, 因为酶蛋白的稳定性较差, 所以反应时间的长短影响着反应结果, 一般在10-30min 最适温度为45-50℃。钙离子可以增加酶蛋白的稳定性,并减少自溶。

碱性蛋白酶主要是由微生物产生, 微生物中主要是细菌的部分菌种产生碱性蛋白酶, 目前碱性蛋白酶主要是用于洗涤剂、皮革工业、丝绸脱胶。

几乎所有的细菌碱性蛋白酶都是胞外蛋白酶, 主要包括两类: 其一是在中性条件下生产的碱性蛋白酶, 如枯草杆菌、地衣芽孢杆菌、短小芽孢杆菌等; 其二是嗜碱微生物, 其必须在碱性条件下[pH8-10]才能生产的碱性蛋白酶。

①酶蛋白特性: 碱性蛋白酶的分子量比中性蛋白酶的分子量小, 一般在20,000-34,000Da, 而且等电点较高, 一般在pH8-9。

②催化特性: 大部分碱性蛋白酶的最适pH在7-11范围, 当以酪蛋白为底物时, 最适pH为9.5-10.5, 碱性蛋白酶除能够水解肽键外, 还具有水解酯键的能力和转肽能力, 最适温度因菌种不同而有差异, 一般在50 ℃左右, 酶蛋白的热稳定性不高, 50-60℃处理15分钟, 几乎有50%的酶活力丧失, 我国目前生产的几种碱性蛋白酶的热稳定性一般都在60℃以下。

中性蛋白酶——枯草芽胞杆菌、栖土曲霉、灰色链霉菌、放线菌等

碱性蛋白酶——地衣芽孢杆菌、短小芽孢杆菌等

酸性蛋白酶——大都采用曲霉

中性蛋白酶作为一种内切蛋白酶，具有纯天然、安全无毒、水解能力强、作用范围广等。2、中性蛋白酶应用于焙烤，可降低面团湿筋度、改良面团可塑性及理化性质，同时使蛋白质大分子水解成短肽和氨基酸，从而有利于糖类和氨基

类物质进行复杂的美拉德反应。3、中性蛋白酶通过采用生物工程技术,微滤、超滤膜分离及真空冷冻干燥技术，产品质量达到食品级和医药级的质量标准。最适温度：50℃。最适pH：7.0

碱性蛋白酶是由造育的地衣芽孢杆菌发酵而得，主要成分为枯草杆菌蛋白酶，是一种内切酶，催化部位为丝氨酸，分子量约为27300.底物浓度10~25%，温度50~60℃，PH值6.0~8.5，反应时间3~6小时（根据要求可长可短）添加酶0.03~0.06%（以水解溶液重量计)

和氏璧酸性蛋白酶是由黑曲霉经受控发酵过程获得，它能在pH值为酸性的条件下水解蛋白质为氨基酸和多肽。其使用于酒精、白酒、果酒、啤酒、黄油以及酱油的生产，可澄清发酵醪液和成熟醪液。增强酵母生长，得到更快的发酵速度，更高的产品收率。在啤酒生产中应用，还能有效阻断双乙酰生成，缩短啤酒成熟期。本产品符合食品添加剂要求使用温度为10℃~55℃，最佳50°C,pH为2.5~6.0，最佳3.5

9.关于纤维素酶。

纤维素酶

纤维素酶是具有纤维素降解能力酶的总称。

能利用晶体纤维素的微生物都能或多或少地分泌纤维素酶。

纤维素酶主要来自真菌和细菌，真菌的纤维素酶产量较高。

纤维素分子是由葡萄糖残基以β-1,4-糖苷键连接组成的不分支的直链葡聚糖，是植物中最广泛存在的骨架多糖，构成植物细胞壁的结构。

1.葡聚糖内切酶：能在纤维素分子内部任意断裂β-1,4（CX酶）糖苷键,产生大量非还原末端的小分子纤维素。（E.C 3.

2.1.4）

2.葡聚糖外切酶或纤维二糖酶：能从纤维分子的非还原端依（C1酶）次裂解β-1,4糖苷键释放出纤维二糖分子。（E.C

3.2.1.91）

3.β-葡萄糖苷酶：能将纤维二糖及其他低分子纤维糊精分解为葡萄糖。（E.C 3.2.1.21）

提高纤维素酶降解纤维素效率的研究主要包括：

通过筛选产酶菌种和培养条件，寻找高活性纤维素酶；

采用各种方法处理纤维素，使其更易于分解，如：物理法（爆破法、机械法)、化学法(酸或碱处理法)、生物法等；

筛选酶解工艺条件：温度50、pH值4-5，酶促反应时间，激活剂等。

8.作业：Mg2+、K+、NH4+、Fe2+、Mn2+在柠檬酸合成中各起什么作用？

a.黑曲霉的磷酸果糖激酶（PFK）是一种调节酶;

b.AMP、无机磷和NH4+ 对PFK有活化作用;NH4+ 还能解除柠檬酸和ATP对此酶的抑制，即细胞内NH4

+ 浓度升高使PFK对细胞内积累的大量柠檬酸不敏感；

c.NH4+升高的原因：Mn2+ 缺乏至使蛋白质和核酸合成受阻，NH4+异常升高，致使丙酮酸和草酰乙酸水平升高，并减少柠檬酸对PFK的抑制；

d.黑曲霉的丙酮酸羧化酶是组成型，不被乙酰-CoA抑制，从而维持了丙酮酸生成乙酰CoA和草酰乙酸这两个物质的平衡。

3.Mn2+的效应是通过NH4+水平升高而减少柠檬酸对PFK的抑制，NH4+ 水平升高是因为Mn2+ 缺乏使HMP 和TCA循环的酶水平降低，生长菌体的蛋白质和核酸合成受阻。生物素对谷氨酸代谢和天冬氨酸代谢的影响机理。

葡萄糖经糖酵解(EMP途径)和己糖磷酸支路(HMP途径)生成丙酮酸，再氧化成乙酰辅酶A(乙酰CoA)，然后进入三羧酸循环，生成α-酮戊二酸。α-酮戊二酸在谷氨酸脱氢酶的催化及有NH4+存在的条件下，生成谷氨酸。

当生物素缺乏时，菌种生长十分缓慢；当生物素过量时，则转为乳酸发酵（讨论）。因此，一般将生物素控制在亚适量条件下，才能得到高产量的谷氨酸。

提示：谷氨酸在细胞内的积累和释放到细胞外，并非细菌的正常生理现象。