叶绿素荧光研究技术

3. 增加热耗散
● 依赖叶黄素循环的热耗散 ● 作用中心可逆失活 ● 状态转换
光合机构处理过剩激发能的方式
●第一道防线：天线热耗散（又称“高 能态耗散”）此类热耗散依赖于： （1）类囊体膜内外的pH梯度（非环式电子传递、 假环式电子传递和环式电子传递均可加大pH梯度）
（2）叶黄素循环
依赖于叶黄素循环的热耗散
传递 速率
Relationship between PSII and CO2 in maize leaves grown in the field at different dates.
荧光参数是研究植物光化学效率、 光抑制与光破坏防御的有效的工具
该技术被广泛的使用在植物生态、植物抗 逆性、筛选高光效或抗逆品种、转基因植物 的功能分析、光抑制和光破坏的防御机制等 方面的研究。
2H(ASCORBAT E)
H2O OH
Z E 的 作 用
2H(NADP H)+ 2 O
ANT HERAXANT HIN 花药黄质
O HO H2O
2H(ASCORBAT E)
H2O OH
2H(NADP H)+ 2 O
ZEAXANT HIN 玉米黄质
HO
V D E 的 作 用
VDE：紫黄质脱环氧化酶
叶黄素循环中三种色素的相互转变
叶黄素循环的运转被跨膜ΔpH促进，此外叶 黄素循环库在强光下明显增大。
叶黄素循环耗散过剩光能的机理： 玉米黄质的直接作用（猝灭三线态叶绿素）； LHCII色素蛋白复合物与叶黄素各自形成聚 集态并互相靠近，有利于过剩光能的热耗散。
ZE：玉米黄质环氧化酶
OH O O HO H2O
VIOLAXANT HIN 紫黄质
2.脉冲调制式荧光仪（如FMS-2)，可以避 免上述问题。在测定时，仪器提供一种脉冲 调制式光，能诱导出的脉冲式的荧光。当有 其它光线同时存在时，会产生以下三种光信 号： 1.自然光中具有荧光波长的红光信号 2.自然光诱导的非脉冲荧光信号 3.脉冲调制光诱导的脉冲荧光信号
（5）
（6）
7）
1：调制测量光； 2：作用光； 3：饱和脉冲光； 4：远红光； 5：检测器及放大器； 6：短波通过滤光片； 7：长波通过滤光片； 8：样品
第三条防线:状态转换
光合机构通过可逆磷酸化,调节PSII捕光 色素复合体(LHCII)的捕光量,从而实现 激发能在两个光系统间均衡分配的过程。 能量满溢（PSII向基粒边缘的PSI靠近）
强光下，PSII吸收过多激发能（状态II）
PQ处于过度还原态
蛋白磷酸激酶被激活 LHCII磷酸化
LHCII与PSII反应中心脱离，向PSI靠近
光钝化: photoinactivation 光破坏: photodamage
光破坏: solarigation
光漂白: photobleaching
光抑制的基本特征
AQY及Fv/Fm下降. 说明叶片吸收的光能不能有效地转化为化学能。 光抑制的机理
光合机构的破坏。PSII是光抑制损伤的主要场所，破坏也 可能发生在反应中心也可能发生在与次级电子受体结合的蛋 白上。发生光破坏后的结果：电子传递受阻，光合效率下降。
由于以上原因 叶绿素荧光动力学技术在： ●光合作用生理生态 ●逆境生理 等研究领域得到了较快的普及和 广泛的应用
直观的叶绿素荧光现象
叶绿素溶液在投射光下呈绿色， 在反射光下呈红色的现象。
荧光现象的本质是什么？为什么 活体植物的叶片看不到荧光现象？
透射光下
反射光下
叶绿体吸收光后，激发了捕光色素蛋白复合体 （LHC），LHC将其能量传递到光系统2或光系统1。其间 所吸收的光能有所损失，大约3%-9%的所吸收的光能被重 新发射出来，其波长较长,也即叶绿素荧光 .
当一个叶绿素分子a的电子从激发态回到到基态的去激过程 中，一小部分激发能（3-9%）以红色的荧光形式耗散。
在生理温度下，叶绿素荧光的波长 峰值大约为685nm的红光，并且一致延 伸到800nm的远红光处
荧光是研究光能分配的探针
热耗散
激发能
光化学反应 形成同化力
荧光
CO2固定 光呼吸 Mehler 反应 N代谢
天线热耗散的最大特点是在 过剩光能尚未引起PSII反应中 心电荷分离之前，就在天线中 将其耗散，这种对过剩激发能 处理的方式
一是安全可靠 二是反应快速
●
第二道防线：反应中心耗散
主要是通过PSII反应中心的可逆（或不可 逆）失活，使一部分PSII反应中心由原来的 光能转化中心变为过剩光能耗散中心，但是， 这种耗散方式实际上已经使一部分PSII复合 体受到暂时的或永久性的损伤。
将时间标尺放大后的荧光动力学曲线
暗 反 应
光活化过程
对（Kautsky Effect）的解释 ：连续光下荧光产量瞬态上升，这是 因为照光后某些碳同化酶需要光活化，因此碳同化途径产生延迟。这 使得照光初期相当多的QA处于还原状态，从而导致了荧光产量的瞬态 上升。这之后，由于光化学过程和热耗散过程的发生，荧光产量产生 淬灭到一个稳态数值（Ft）。
Ft(或Fs ): 稳态荧光产量 steady-state fluorescence yield。
φPSⅡ=(Fm’-Fs)/Fm’ ： PSⅡ实际光化学效率，它反
映在照光下PSⅡ反应中心部分关闭的情况下的
实际光化学效率。
qP =(Fm’ -Fs)/(Fm’-Fo’) ： photochemical quenching
8
脉冲调整式叶绿素荧光仪原理图
高选择性监测器可以排除前两种信号 而只保留脉冲过程中所产生的荧光信号。 用脉冲调制式方法，可以在全光照情况 下测量叶绿素荧光信号，而不被其它光 所干扰。
最大荧光
荧光波动
荧光稳态
荧光快速上升过程
当对暗适应叶片照光时，叶绿素荧光迅速上升，随后 有一系列的慢的波动，逐渐下降到稳态。这称为 “Kautsky Effect”，是Kautsky等在1931年首先报道的。 荧光产量的变化反映了光化学效率和热耗散能力的变化。
P680+ + β-Car
P680 + β-Car+
PSⅡ供体侧 H2O的光解受阻时易产生此种破坏。P680+还能氧 化D1蛋白肽链中酪氨酸残基和叶绿素等色素。
激发态叶绿素的4种去激发途径
一切影响CO2同化的外接界
因素如低温、高温、水分 亏缺、矿质元素亏缺等都 会减少对光能的利用，、 导致过剩光能增加，进而 加重光破坏。
产生光破坏的原因： 过剩光能产生的高能电子无法利用， 产生如 chl*, 单线态氧、超氧阴离子等氧化性很强的分子破 坏光合机构。
光破坏的概念
当过剩的光能不能及时有效地排散
时，对光合机构造成不可逆的伤害， 如对光合色素造成光漂白、光合作 用中心D1蛋白的降解及光合机构的 光氧化等。
3P 680
叶绿素荧光动力学研究得到广泛应用的原因
1、叶绿素荧光动力学特性包含着光合作用过程的丰富信 息 ●光能的吸收与转换 ●能量的传递与分配 ●反应中心的状态 ●过剩光能及其耗散
●光合作用光抑制与光破坏……等等
2、可以对光合器官进行“无损伤探查”，获得 “原位” 的（in situ）信息。
3、操作步骤简单快捷。
Fv/Fm：暗适应下PSⅡ反应中心完全开放时的最大 光化学效率，反映PSⅡ反应中心最大光能 转换效率。 Fv/Fo：代表PSⅡ潜在光化学活性，与有活性的反 应中 心的数量成正比关系。 Fo’： 光适应下初始荧光。
Fm’： 光适应下最大荧光。 Fv’=Fm’-Fo’：光适应下可变荧光。 Fv’/Fm’：光适应下PSⅡ最大光化学效率，它反映有 热耗散存在时PSⅡ反应中心完全开放时的 光化学 效率，也称为最大天线转换效率。
光抑制概念:
强光造成光合功能下降的过程称为光抑制
特征：光合效率下降；Fv/Fm 及AQY 下降
过去人们把光抑制与光破坏等同起来，认 为发生了光抑制就意味着光合机构遭到破坏。 甚至把光抑制 、光破坏、光漂白、光氧化等 概念通用。
光抑制: photoihibition
光氧化: photooxidation
PSII捕光截面变小，PSI捕光截面变大
用荧光动力学曲线区分过剩光能耗 散的不同方式
可将非光化学猝灭qNP区分为三部分：
qNP＝qE+qT+qI
qE－高能态荧光猝灭 qT－与状态转换有关的荧光猝灭 qI －与光抑制有关的荧光猝灭
½ 暗驰豫时间：qE<1min; qT~8min; qI>40min
+ O2
P680 + 1O2
氧化性极强的1O2首先攻击反应中心色素P680，使PSⅡ反应中 心失去电荷分离能力，最终引起D1蛋白降解.PSⅡ受体侧电子传 递受阻时易产生此种破坏。
Fd－ + O2
Fd +
－ O2·
O2。－启动类囊体膜的脂质过氧化，破坏光合色素、类囊体系 统以及膜结合酶使电子传递效率下降，严重时使电子传递系统 失活。
如何测定叶绿素荧光？ 现有两类荧光仪可以用来测定叶绿素荧光。 1.续激发式荧光仪（如PEA)，必须将测 定叶片在避光下测定，在照光条件下，仪器 无法区分叶绿素荧光和自然光中与荧光波长 相同的红光和远红光。 但是这类荧光仪有很高的分辨率，每秒 钟能够测定10万次荧光变化，因此是研究光 合机构中电子传递瞬间变化的有力工具。
叶绿素荧光分析技术在植 物生理生态研究中的应用
叶绿素荧光现象的发现
Kautsky and Hirsh（1931）发现，将暗
适应的绿色植物突然暴露在可见光下后，植
物绿色组织发出一种暗红色，强度不断变化
的荧光（Kautsky效应）。
荧光随时间变化的曲线称为叶绿素荧光
诱导动力学曲线。
上世纪80年代，Ögren（1985）和 Schreiber（1986）相继创制出便 携的调制式荧光仪，并实现了商品 化。
光化学猝灭系数，它反映了PSⅡ反应中心的开
放程度。 1- qP 用来表示PSⅡ反应中心的关闭程度。
qNP =(Fm-Fm’)/(Fm-Fo’) ：非光化学猝灭系数 NPQ = (Fm-F’m)/F’m ＝Fm/Fm’-1 ：非光化学猝灭 non-photochemical quenching ETR = φPSⅡ ×absorbed PFD ×0.5 ：PSII电子
X Pheo Q PQ Cytf H2O Z P680 PC 光量子 P700

wk.baidu.comFd
NADP O2 光量子
光合电子传递链
Fv/Fm =(Fm-Fo)/Fm ； qP=(F’m-Ft )/(F’m-F’o) ； ΦPSII =(F’m-Ft )/F’m ；
NPQ =(Fm-F’m)/F’m ；qNP= (Fm-Fm’)/(Fm-Fo’)
光破坏防御机制
热耗散
激发能
光化学反应 形成同化力
荧光
CO2固定 光呼吸 Mehler 反应 N代谢
植物防御光破坏的措施
1 减少对光能的吸收 ● 增加叶片的绒毛、蜡质 ● 减少叶片与主茎的夹角 增强代谢能力 ● 碳同化 ● 光呼吸与活性氧清除系统 ● 氮代谢 ● Mehler反应与活性氧清除系统
2
t
(Fs)
主要荧光参数及其意义
Fo： 初始荧光产量（Original fluorescence yield ） 也 称基础荧光，是PSⅡ反应中心（经过充分暗适 应以后）处于完全开放状态时的初始荧光产量。
Fm：最大荧光产量（Maximal fluoreseence yield ）， 是PSⅡ反应中心完全关闭时的荧光产量。通常叶片 经暗适应20min后测得。 Fv=Fm-Fo：可变荧光，反映PSⅡ的电子传递最大潜 力。经暗适应后测得。
通过调节PSII反应中心的开放的程度干涉荧光的 发射，根据不同情况下荧光的变化来分析光合机 构运行情况。
ΦF =
kf kf + kp+ kd
ФF:叶绿素荧光产量；kf： 叶绿素荧光的速率常数； kp：光化学反应的速率常数；kd：热耗散的速率常数
荧光发射与原初光化学活动、热耗散过程是互相竞 争的一种关系。因此，荧光产量的变化反映了光化学效 率和热耗散能力的变化。
是光抑制的狭义的概念。
PSII反应中心可逆失活的特点
● PSII的失活可能与天线的脱离有关。 ●正常的PSII反应中心位于基粒类囊体膜， 电子传递功能正常； ●失活的PSII反应中心位于间质片层膜，不 能还原QB，失活反应中心的Fo增高，Fm降低。 ●失活的反应中心可以修复，涉及D1蛋白的 磷酸化。 ●失活反应中心可形成围绕PSII的循环电子 流 （P680→Pheo→Cyb559→P680） ,电子进行无效循 环。