体外受精-胚胎移植技术

抽吸法 注射器吸取采卵液，轻刺入卵泡中，吸取卵母细胞。 切割法 切割卵巢，回收液体，实体显微镜下捡出卵母细胞。 剥离法 剥取完整的圆形卵泡，切开卵泡，收集卵母细胞。麻烦，损 伤小 腔前卵泡-无腔卵泡的收集 剪碎卵巢，胶原酶消化(或组织切碎机)，过网筛，收集卵母 细胞。
抽吸法 用装有5号针头的5mL注射器吸取2mL采卵液，将针头轻轻 刺入人2~5mm(羊)或2~8mm(牛)的卵泡中连同卵泡液吸取卵 母细胞，每吸2~5个卵泡后，将注射器内的液体缓慢注入检 卵杯中，以备检查。
1.5精子体外获能 定义：哺乳动物的精子必须在子宫或输卵管内经过一定的时 间，发生一定的生理变化，才能获得穿透卵子的能力，此现 象称为精子获能。 有效的体外获能技术是成功地进行体外受精的前提和保证。
（1）精子体外获能 Ⅰ.精子体外获能的主要途径 1、高离子强度液 2、钙离子载体 3、氨基多糖法 Ⅱ.获能精子的特征及检测 1、获能精子的特征 2、获能精子的检测
2、培养方法 在灭菌石蜡油中，制作0.05-0.2 mL培养液微滴，1-6个微滴/ 培养皿。 选取A和B级卵母细胞，用培养液洗涤2～3次，移入微滴中， 10-15个卵母细胞/微滴，在5%CO2、饱和湿度条件下培养。
（三）影响卵母细胞体外成熟的因素 1.动物种类-卵母细胞结构不同，需要条件也不同。 2.卵母细胞供体母畜年龄、性机能及卵巢状态-初情期、性成 熟卵母细胞。 3.卵母细胞类型A级和B级具有较高受精率。 4.卵巢运输、取卵方式和季节-温度过低，冷休克。 5.培养系统，包括温度、湿度、空气环境和培养基等。
（1)控制性超数排卵 由于自然月经周期的长短因人而异，同一患者不同周期也存 在差异，所以不易安排取卵时间，而且自然周期中只有一个 优势卵泡发育，受精后只能形成一个胚胎，而移植一个胚胎 的妊娠率是很低的。所以需要采用控制性超排卵来增强与改 善卵巢功能，以达到不受自然周期的限制、获得多个健康卵 子的目的，提供多个胚胎移植，并尽可能使黄体发育与子宫 内膜功能同步。控制性超排卵一般是先用GnRHa使体内FSH和 LH降调，再施与HMG或FSH排卵药物，刺激卵巢中的卵泡成长， 依据患者对药物的反应性调整药物使用剂量，患者的年龄及 药物的使用剂量不同，所获得的卵子数亦不同。
Ⅰ.精子体外获能的主要途径 生殖道液体中存在诱导获能和顶体反应的因子和钙离子。 加入诱导获能的有效成分： 钙离子载体、氨基多糖、脂类、咖啡因、肾上腺素、cAMP、 鞘磷脂酶等。
1.高离子强度液 置换精子表面抗原物质或去能因子，从而诱发顶体反应。 2.钙离子载体 精子的顶体反应是一个Ca2+依赖过程。钙离子载体携带钙 离子进入精子内，可诱发顶体反应并激活顶体酶。 3、氨基多糖法（GAGs) GAGs可促进精子对Ca2+的吸取，从而诱发顶体反应。 其作用程度有赖于氨基多糖的硫酸化程度。 肝素是硫酸化程度最高的GAG，其作用也最强。
ICSI, intracytoplasmic sperm injection,
assisted hatching
Preimplantation genetic diagnosis (PGD)
Polar body PGD Blastomere PGD
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1.4体外受精过程
1.4.1卵母细胞的采集 卵母细胞的采集方法通常有三种： (1)超数排卵。 (2)从活体卵巢中采集卵母细胞。 (3)从屠宰后母畜卵巢上采集卵母细胞。
（一）卵母细胞成熟的特征 卵母细胞成熟是指充分生长卵母细胞向成熟卵母细胞转化的 过程。 包括：减数分裂的恢复和完成，以及细胞质、细胞膜、透明 带和卵丘细胞的成熟变化。
(二) 卵母细胞体外成熟培养方法 1.培养液 合成培养液如TCM-199(80%)、Ham’s F10和F12。 缓冲体系对卵母细胞体外成熟有重要影响。 胎牛血清比添加BSA有更高的成熟率。 血清含有某种能促进卵母细胞或体外受精的成分，可阻止透 明带硬化和促进受精
20世纪60年代以后，体外受精研究迅速发展，在家兔、小鼠、 大鼠、人、牛、猪、狒狒、猕猴、绵羊、山羊和老虎等10多 种动物获得了试管后代。 1978年7月25日，第一例试管婴儿Louise Brown在英国诞生， 这是体外受精技术走向全面应用的标志性事件，是医学和生 物学上的一次伟大的革命。 1988年，中国大陆首例试管婴儿郑萌珠诞生。由北京医科大 学的张丽珠等人完成。
(3)从屠宰后母畜卵巢上采集卵母细胞 离体卵巢卵母细胞的采集一般用于从屠宰的大中型动物卵巢 上采集卵母细胞或收集腔前卵泡卵母细胞。 采卵前准备卵巢保存液、采卵液、采集卵巢器械及采卵器械。
Ⅰ.离体卵巢卵母细胞的采集 屠宰家畜，30分钟内取出卵巢； 0.9%温生理盐水冲洗； 11h内送回实验室采卵。 25℃, 超净工作台内，去除韧带和输卵管，冲洗血污； 有腔卵泡采用抽吸法、切割法或剥离法收集卵母细胞。 特点：快速、无菌
体外受精-胚胎移植技术（IVF-ET）
1.体外受精
1.1定义：体外受精(In Vitro Fertilization)是指哺乳动 物的精子和卵子在体外人工控制的环境中完成受精过程的技 术，英文简称为IVF。
In vitro fertilization or fertilisation (IVF) is a process by which an egg isfertilised by sperm outside the body: in vitro ("in glass"). The process involves monitoring and stimulating a woman's ovulatory process, removing an ovum or ova (egg or eggs) from the woman's ovaries and letting sperm fertilise them in a liquid in a laboratory. The fertilised egg (zygote) is cultured for 2–6 days in a growth medium and is then implanted in the same or another woman's uterus, with the intention of establishing a successful pregnancy.
1.2体外受精的发展历史 1878年，德国科学家Schenk就开始进行哺乳动物卵子体外受 精的尝试。 1945年，美籍华人张明觉成功的进行了兔体外受精，但在此 后的5年里没有能再重复出这一结果。这个时期的体外受精 工作主要建立在经验基础上。 1951年，张明觉和澳大利亚的Austin几乎同时发现只有在雌 性生殖道内停留一段时间的精子才能成功的与卵结合，进行 体外受精。精子获能现象的发现是体外受精史上的一个里程 碑。 1959年，张明觉利用体内获能处理的精子进行体外受精实验， 获得世界上首例“试管动物”—试管兔，为哺乳动物体外受 精工程奠定了基础。从此结束了生殖生物学界几十年来对哺 乳类卵子体外受精能否成功的争论。
2.2胚胎移植的发展历史 1890年，Heape在英国剑桥大学首次报道获得兔子胚胎移植 成功。 20世纪30年代后开始大量研究，1951年willett首次成功地 进行了牛的胚胎移植。 1974年，第一头胚胎移植的何斯坦奶牛在美国出生。 1976年，一些研究小组报道了采用导管高效采集胚胎的非手 术方法，随后胚胎移植在奶牛中的应用得到飞速发展。 我国对牛胚胎移植研究起步较晚，1978牛手术法胚胎移植犊 牛降生，1980年非手术法移植成功，1982年冷冻胚胎移植成 功。
1.6体外受精 将获能精子与成熟卵子置于受精液中共同培养，使之完成受 精过程。 影响因素： 精子浓度 精卵相遇的时间 操作：石蜡油中悬浮0.1mL小液滴（精液），移入10-15枚成 熟卵母细胞/小液滴，培养箱中培养至囊胚。
1.7研究意义 1.7.1.基础研究领域 再现体内受精过程，揭示受精的本质和机理，研究胚胎的分 化和发育。 1.7.2.应用研究领域 治疗不孕症。 胚胎工厂化生产，为胚胎移植业开辟胚胎来源。 保护珍稀动物种质资源。
(2）从活体卵巢中采集卵母细胞 卵巢卵母细胞的活体采集主要用于非屠宰大中型动物重复进 行卵母细胞的采集。 可采用手术法也可以在超声波图像或腹腔镜引导下进行卵巢 卵母细胞活体采集。
Ⅰ.卵巢卵母细胞的活体采集 手术活体采集 暴露动物卵巢，用含有采卵液的注射器抽吸卵泡的卵泡液。 超声波图像引导下的卵巢卵母细胞活体采集 优点：穿刺孔小。 缺点：不如腹腔镜直观，且回收率低 腹腔镜引导下的卵巢卵母细胞活体采集 非手术法，对母体无伤害。
2.3 胚胎移植的基本原则 1.胚胎移植前后所处的环境的同一性 （1）供体和受体在分类学上属于同一物种 （2）胚胎发育阶段与受体发情时间上的一致性 （3）胚胎发育阶段与受体生殖道解剖位置的一致性 2.胚胎质量 3.经济效益和科学价值
（二）获能精子的特征及检测 1、获能精子的特征 代谢改变，呼吸代谢明显增加。 运动方式改变，超活化运动。 顶体形态变化，顶体帽部分的质膜和顶体外膜在多处发生融 合，膜泡状化。 超活化运动发生于顶体反应之前。
2、获能精子的检测 运动方式：镜检精子活力、运动类型和运动速度。 顶体反应：顶体反应是判断精子获能的有效方法之一。 电镜：头部质膜与顶体外膜泡状化，或仅残存顶体内膜。 顶体染色法(三重染色技术)光镜观察： 品红色，无顶体反应。 顶体帽 白色，有顶体反应。 蓝黑色，死精子 顶体后区 棕色，活精子。
（四）卵母细胞形态分类 依据卵丘细胞-卵母细胞复合体(COC)的外形。 只有A和B级卵母细胞可用于成熟培养。 A级：3层以上完整而致密的卵丘细胞 B级：卵丘细胞3层以下，部分脱落。 C级：卵丘细胞扩展而松散。 D级：卵丘细胞全部脱落，裸卵。
1.4.2卵母细胞体外成熟培养 体外受精获取成熟卵母细胞主要通过以下两条途径： （1）体内成熟，经超数排卵处理后，采取成熟卵泡内的卵 母细胞或从输卵管内回收刚刚排出的卵母细胞； （2)体外成熟，采集卵泡中未成熟的卵母细胞，经体外培养 使之成熟。后一种方法可以充分利用母畜的卵巢，是解决卵 子来源最有效的途径，具有更大的实用价值。
“试管婴儿之父”、英国科学家罗伯特-爱德华兹，2010年 获得诺贝尔生理学或医学奖。(帕特里克·斯特普托)
1.3体外受精的发展阶段 第一代：1978年英国专家steptoe和Edowrds定制了世界上第 一个试管婴儿，被称为人类医学史上的奇迹。它是将精子和 卵子置于体外利用各种技术使卵子受精，培养几天后移入子 宫，使女性受孕生子。 第二代：1992年由比利时Palermo医师首次在人体成功应用 卵浆内单精子注射（ICSI），使试管婴儿技术的成功率得到 很大的提高。 第三代：随着分子生物学的发展，近年来，在人工助孕与显 微操作的基础上，胚胎着床前遗传病诊断（PGD）开始发展 并用于临床，使不孕不育夫妇不仅能喜得贵子，而且能优生 优育。
2.胚胎移植
2.1定义:胚胎移植(Embryo Transfer)又称受精卵移植，俗称 借腹怀胎，是指将雌性动物的早期胚胎，或者通过体外受精 及及其他方式得到的胚胎，移植到同种的、生理状态相同的 其他雌性动物体内，使之继续发育为新个体的技术。
Embryo transfer refers to a step in the process of assisted reproduction in which embryos are placed into the uterus of a female with the intent to establish a pregnancy. This technique (which is often used in connection with in vitro fertilization (IVF)), may be used in humans or in animals, in which situations the goals may vary.