南海红树林内生真菌GX—3代谢产物研究

南海红树林内生真菌GX—3代谢产物研究

摘要：采用反复硅胶柱色谱法、Sephadex LH-20凝胶色谱法等分离纯化南海红树林内生真菌GX-3的代谢产物，并通过理化常数测定和光谱分析鉴定其化学结构。结果表明，从南海红树林内生真菌GX-3的菌体中分离得到6个代谢产物。经波谱解析，分别为：环（苯丙-甘）二肽（1）、环（丙-亮）二肽（2）、Fusaric acid （3）、3，6-di-sec-butyl-1，4-dihydroxypiperazine-2，5-dione（4）、环（脯-亮）二肽（5）、环（甘-亮）二肽（6）。初步药理活性显示化合物1对口腔癌细胞KB、KBv200的抗肿瘤活性的LD50值分别为6.5和11.2 μmol/L。通过鉴定，所有化合物均系首次从南海红树林内生真菌GX-3中分离得到。

关键词：红树林；内生真菌；代谢产物

海洋微生物资源由于具有可持续开发性，其活性物质生产不受天然资源难再生的限制，能通过发酵进行胞外生产，与现代微生物技术相结合，较容易实现工业化生产，特别是其生产不对环境造成危害，符合当今绿色化学发展的方向。而多数报道均显示海洋真菌都与红树林有着紧密的联系[1，2]，对红树林真菌生物活性物质的研究已成为海洋微生物资源开发利用，寻找天然药物先导化合物的重要途径。近十几年来，已有学者对中国南海红树林内生真菌进行了系统的研究，并从中分离获得了一系列结构新颖、药理活性良好的海洋天然化合物[3-9]。

1 材料与方法

1.1 仪器和试剂

美国Varian公司的INOV A-500NB超导核磁共振谱仪、INOV A-300NB核磁共振仪、VG ZAB-HS双聚焦质谱仪、Thermo DSQ电子轰击电离质谱仪和Thermo MAT95XP高分辨质谱仪；北京泰克仪器有限公司的X-4数字显示显微熔点测定仪。所用试剂均为广州化学试剂厂生产，化学纯，溶剂经重蒸后使用；柱层析硅胶为青岛海洋化工厂生产的200～300目硅胶，硅胶H，薄层硅胶GF254。

1.2 菌种培养

红树林内生真菌GX-3采自中国香港，经鉴定为拟茎点霉菌（Phomopsis sp.），保存于中山大学化学与化学工程学院。发酵培养基为葡萄糖10 g/L、蛋白胨2 g/L、酵母膏1 g/L、粗海盐2 g/L、pH 7.0。500 mL三角瓶内装培养基200 mL，1.25×105 Pa 灭菌15 min后接种100 mL，在25 ℃静置培养30 d。分别收集发酵液和菌体。

1.3 提取与分离

100 mL发酵物过滤得菌体和发酵液，发酵液浓缩后用乙酸乙酯充分萃取，菌体用甲醇多次浸泡。提取浓缩物分别以体积比1∶2拌硅胶（200～300目）进

行柱层析，以石油醚/乙酸乙酯/甲醇进行梯度加压洗脱。收集各组分再经反复柱层析，制备薄层层析，重结晶等方法进行纯化。从菌体粗提物（约20 g）分离p 2 结果与分析

化合物1～6的结构图如图1所示。

化合物1：白色粒状晶体，FABMS显示分子离子峰为205[M+1]+，NMR 结合质谱，得到分子式为C11H12N2O2。1HNMR中，δ 8.07 （brs，1H）和7.80 （brs，1H）表明存在2个酰胺质子信号；δ 7.27 （m，3H）和7.17（m，2H）提示存在单取代苯环；δ 4.05 （dd，8.0，5.0 Hz，1H）说明存在连接杂原子的-CH；δ 3.09（dd，13.5，4.5Hz，1H）和2.89 （dd，13.5，5.0Hz，1H）是苄亚甲基的特征；δ 3.36 （dd，17.5，3.0Hz，1H）和2.80 （d，17.5Hz，1H）mg/L的偶合常数相同，说明是连接杂原子的-CH2的2个同碳质子。根据这些信息推出该化合物为环（甘-苯丙）二肽。进一步与标准谱图及文献[11]对比得到确证。

化合物2：白色粉末，IR（KBr）νmax1 679、1 648/cm提示分子中存在酰胺键，2个活泼氢8.09（brs，1H），8.00（brs，1H）证实了酰胺基的存在。δ 3.99（q，7 Hz，1H）和δ 3.93（dd，4.5，5.5 Hz，1H）分别为连在酰胺氮上的CH，分子中有3个甲基，其中一个裂分为两重峰δ 1.44（d，7 Hz，3H），与δ 3.99的CH相连，另外2个也裂分为双峰，与δ 1.64（m，1H）相连，说明分子中存在异丙基结构。1HNMR谱中还剩下一个与δ 3.93的CH相连的CH2。根据NMR 数据参照文献[12]可确定其为环（丙-亮）二肽。

化合物3：无色晶体，薄层层析显示有拖尾现象，可能推断是羧酸类化合物。EIMS给出分子离子峰m/z 179，结合NMR数据分析推出分子式C10H13NO2，不饱和度为5。1HNMR中 2.7 （t，7.8 Hz，2H），1.6（m，7.8，7 Hz，2H），1.4（m，7.5，7 Hz，2H），0.9（t，7.5 Hz，3H）几组氢之间的偶合关系，表明分子中的CH3与3个CH2互相连接成一个丁基链，8.8（s，1H），8.2（d，8.1 Hz，1H），7.8 （d，8.1 Hz，1H）显示分子中存在两个邻位芳香质子和一个孤立的芳香质子。13C NMR和DEPT谱图显示10个碳，其中3个季C，3个CH，3个CH2，1个CH3。除掉丁基链的4个碳外，剩余的6个碳的化学位移和类型分别为165.6 （C）、147.7（CH）、145.4（C）、143.2（C）、138.8（CH）、124.6 （CH），其中165.6（C）应为羧酸基团，其余5个碳同剩下的一个N对应4个不饱和度，可推测为吡啶环。综合以上信息，可以推测该化合物为一个取代了一个丁基和一个羧酸的吡啶。对照文献[13]，确定该化合物的结构为5-丁基-2吡啶甲酸，又名Fusaric acid。化合物4：无色晶体，溶于甲醇。TLC碘缸显色为泛白拖尾尖头带状。EIMS显示分子离子峰为258，结合核磁可得化合物C12H22N2O4。在13CNMR只显示六组碳信号[161.5（C），65.8 （CH），36.3 （CH），25.8 （CH2），14.9 （CH3），12.2 （CH3）]，表明化合物存在对称结构。参照文献[14]，确定化合物的结构为3，6-di-sec-butyl-1，4-dihydroxypiperazine-2，5-dione，该化合物也曾在黑曲霉真菌中被分离得到过。

化合物5：白色粉末固体，溶于常见溶剂。EIMS显示分子离子峰为210，结合核磁数据可推出该化合物的分子式为：C11H18N2O2。13CNMR和DEPT谱