基于系统获得性沉默的果树砧木分子育种

收稿日期:2011-01-10

基金项目:国家自然科学基金项目(30871689);辽宁省教育厅创新团队项目(2009T089)

作者简介:代红艳(1970-),女,沈阳农业大学副教授,博士,从事果树生物技术研究。*通讯作者Corresponding author:张志宏(1968-),男,沈阳农业

大学教授,博士,从事果树分子生物学研究。

沈阳农业大学学报,2011-04,42穴2雪:131-135

Journal of Shenyang Agricultural University,2011-04,42穴2雪:131-135基于系统获得性沉默的果树砧木分子育种

代红艳,刘月学,张志宏*

(沈阳农业大学园艺学院,沈阳110866)

摘要:在果树栽培生产中嫁接是主要的繁殖方式,砧木育种是果树育种的重要内容。近些年来的研究表明,一些mRNA 和小RNA 能够在植物细胞间移动,并且能够穿过嫁接口在植物体内长距离运输传递。总结了能够通过嫁接长距离传递的植物内源RNA 分子的种类,介绍了基因沉默原理和技术,提出了基于系统获得性沉默原理的果树砧木分子育种策略,并分析了其可能存在的问题,为进一步开展果树砧木分子育种提供思路和参考。

关键词:果树砧木;分子育种;RNA 传递;基因沉默

中图分类号:S66-3文献标识码:A 文章编号:1000-1700(2011)02-0131-05

Molecular Breeding of Fruit Tree Rootstock Based on Systemic Acquired Silencing

DAI Hong-yan,LIU Yue-xue,ZHANG Zhi-hong*

(College of Horticulture,Shenyang Agricultural University,Shenyang 110161,China,China)Abstract :Grafting is the main method of propagation in fruit tree cultivation,so rootstock breeding is a very important research field in fruit tree breeding.Recently,studies showed that some mRNAs and small RNAs move between cells and transport long distance across the graft union.This review summarized the endogenous plant RNAs having long -distance transportability as demonstrated by experiments based on grafting,and introduced the principle and technology of gene silencing.The strategy of molecular breeding of fruit tree rootstock based on systemic acquired silencing was analyzed and its problem was discussed.The aim of this review is to provide ideas and guidance for further study on molecular breeding of fruit tree rootstock.Key words :fruit tree rootstock;molecular breeding;RNA transport;gene silencing

在果树栽培生产中嫁接是主要的繁殖方式。砧木与接穗之间相互作用,使砧木和接穗表现出不同的性状,从而影响果树的抗性、树势、产量和果品质量等,进而影响经济效益。果树嫁接已经有两千多年的历史[1],但是砧木与接穗互作的机制至今不是十分清楚。RNA 分子既具有贮存及转移遗传信息的作用,又可以作为核酶直接在细胞内发挥代谢功能。一系列的研究表明,在植物体中,RNA 也可以作为活跃的信号分子调控基因表达。这些RNA 可以在细胞间转移[2],并可以通过嫁接长距离传递至接穗的顶端分生组织[3]。RNA 传递性的研究进展为果树砧木分子育种提供了全新的思路,即将编码小RNA (small RNA )或者能长距离运输的mRNA 的基因导入砧木中,当非转基因接穗嫁接到转基因砧木上后,砧木表达的外源RNA 分子可以运输到接穗,导致接穗性状改变[4]。但是RNA 在砧木/接穗间传递的机制非常复杂,哪些RNA 分子具有传递性,影响RNA 传递能力的主要因素是什么?这些目前都不是很清楚。而且至今的研究基本上都是以草本植物为试材。本研究总结具有长距离传递能力的RNA 种类,提出基于系统获得性沉默原理的果树砧木分子育种策略并分析其可能性。

1mRNA 传递

mRNA 是从DNA 转录合成的带有遗传信息的一类单链RNA ,为蛋白质合成的模板。近年来的研究结果表明,蓖麻、拟南芥、大麦、甜瓜等植物的韧皮部汁液中有数百种mRNA [5],其中,PP16(与病毒移动蛋白同源的植物蛋白)[6]、NACP (NAC 结构域蛋白)[7]、PFP-T6(依赖焦磷酸的磷酸果糖激酶与LeT6的融合基因)[8]、GAI (gibberellic acid insensitive )蛋白[9]、BEL5转录因子[10]和AUX/IAA14(生长素响应基因的转录阻遏蛋白)[11]的

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沈阳农业大学学报

第42卷mRNA能够通过嫁接口长距离传递。1999年美国加州大学戴维斯分校Lucas实验室的XOCONOSTLE-CáZARES等在《Science》上首次报道mRNA在植物体内长距离运输。他们发现南瓜PP16基因的mRNA存在于南瓜筛管中,能够在细胞间移动,而且通过异种嫁接试验证明PP16基因的mRNA能够从作为砧木的南瓜长距离运输到作为接穗的黄瓜中[6]。随后,同一实验室的RUIZ-MEDRANO等发现NACP的mRNA也能够在植物中长距离运输[7]。同样采用异种嫁接试验的方法,KIM等[8]表明PFP-T6的mRNA能够穿过嫁接口到达接穗,并改变接穗的表现型。关于mRNA的传递性研究,多研究mRNA从砧木到接穗的长距离运输,而BANERJEE等[10]在马铃薯上的研究结果表明,转录因子BEL5的mRNA能够从接穗向砧木长距离运输,进而增加马铃薯块茎数量。

目前mRNA传递研究集中在一、二年生草本植物上,近来,果树上也有报道,如宫磊等[5]成功地从鸭梨和杜梨中克隆了全长的NACP基因,并进一步证明了梨内源性的NACP基因mRNA可以通过韧皮部进行传递; KANEHIRA等[12]发现苹果的AUX/IAA14基因(MpSLR/IAA14)的mRNA能够通过嫁接口长距离运输。

2小RNA介导的基因沉默及传递

2.1RNA沉默

RNA沉默(RNA silencing),也称作RNA干扰(RNA interference,RNAi)或转录后基因沉默(posttranscriptional gene si1ence,PTGS),是指由RNA介导的通过核酸序列特异性相互作用抑制同源基因表达的现象。1990年NAPOLI等[13]发现将强启动子驱动的查耳酮合成酶基因导入矮牵牛后,自身和内源的查耳酮合成酶基因都发生沉默,推断这种现象是RNA介导的,这是人们最早发现的基因沉默现象。1998年FIRE等[14]在线虫中证明双链RNA能够阻断线虫特异基因的表达,并称其为RNA干扰。此后,人们发现在水蛭、锥体虫、果蝇等无脊椎动物中RNAi都非常有效,而且在植物中也广泛存在,从此RNA沉默一直是分子生物学领域的一个研究热点。业已表明,RNA沉默是长度为20~30nt的小RNA介导的。

2.2植物小RNA种类和特性

植物细胞中存在miRNA(microRNA)、siRNA(small interfering RNA)、ta-siRNA(trans-acting small interfering RNA)和nat-siRNA(natural antisense siRNA)等内源的小RNA分子[15],其中最主要的是miRNA和siRNA。miRNA是基因编码的长度约22nt的单链RNA分子,其前体是长约70nt具有茎环结构的RNA分子; siRNA没有特定的编码基因,是由处于异染色质区的重复序列和转座元件等转录产生,其长度约24nt的单链RNA分子,由长的双链RNA(dsRNA)分子切割产生。病毒侵染和转基因也能诱发siRNA的产生。植物体内的miRNA和siRNA都对具有RNaseШ活性的DCL蛋白切割产生,而且其作用都需要Argonaute蛋白[16]。

植物miRNA通过PTGS的方式使靶基因沉默,即通过切割靶基因的mRNA和翻译抑制两种方式使靶基因沉默[17]。目前的研究表明,miRNA在植物生长发育及胁迫应答等方面都扮演着重要角色。许多miRNA的靶标是转录因子,如miR156通过降解转录因子SPL(Squamosa promoter binding protein like)的mRNA而使拟南芥植株处于幼年期[18]。miR160和miR167的靶标是生长素响应因子,而miR393的靶标是生长素受体蛋白TIR1,生长激素应答途径的调控影响植物的生长发育和对病菌的抗性[19]。

近来的小RNA高通量深度测序结果表明,植物细胞中80%以上的小RNA是siRNA[20]。siRNA介导DNA 甲基化和转录基因沉默(transcriptional gene silencing,TGS),由于siRNA主要是处于异染色质区域的重复序列和转座元件转录产生的,所以siRNA的主要作用是维持基因组的完整性[21]。

2.3小RNA的传递性与系统获得性沉默

RNA沉默现象在真核生物中普遍存在。RNA沉默信号不仅局限于单个细胞内,而且还可以在细胞与细胞之间甚至由诱导部位向更远的组织传播,这种现象称为系统获得性沉默(systemic acquired silencing,SAS)[22]。多个嫁接试验结果表明,转基因沉默的砧木能够有效地诱发接穗中产生相应的基因沉默现象[23-24]。系统获得性沉默研究多以易于嫁接并且易于遗传转化的草本植物为试材,最近系统获得性沉默研究在木本植物上开始出现,如HATTASCH等[25]构建了针对gus基因的hpRNAi植物表达载体并转化苹果品种Pinova,以获得的hpRNAi转基因植株为砧木,以gus基因过量表达的嘎啦苹果转基因植株为接穗,嫁接4周后,20%~70%的嘎啦苹果叶片表现出gus基因被沉默的现象。