超声波提取桑叶中总黄酮的工艺研究

食品科学
中国农学通报 第 ２２ 卷 第 ４ 期 ２００６ 年 ４ 月 ｈｔｔｐ：／／ｚｎｔｂ．ｃｈｉｎａｊｏｕｒｎａｌ．ｎｅｔ．ｃｎ
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１．３ 试剂 聚酰胺树脂购买于（ 天津市精细化工研究所 粒度
范围 ０．３￣１．２５ｍｍ） 芦丁标准品（ 纯度 ９５％生化试剂 湖南林产化工重点实验室提供）９５％乙醇、Ａｌ（ＮＯ３）３、 ＮａＮＯ２、ＮａＯ（Ｈ ＡＲ）中性醋酸铅、浓硫酸、硼酸、盐酸、 碳酸钠、ＰＨ 试纸 ２ 实验方法 ２．１ 树脂预处理
２．５ 纯化工艺 ２．５．１ 静态吸附量及吸附率的测定 分别取浓缩后的 样液 １ｍｌ、５ｍｌ、１０ｍｌ、１５ｍｌ、２０ｍｌ 放入盛有 ５ 份 等 量 的聚酰胺的三角瓶中，振摇 ２４ｈ，过滤，并定容到 １００ｍＬ 容量瓶中。取 １ｍｌ 溶液按照样品吸光度测定 方法，显色后测定吸光度代入标准曲线方程计算吸 附平衡后溶液中总黄酮的浓度（ Ｐ２），按பைடு நூலகம்式计算静态 吸附容量 Ｅ（＝ Ｐ１－ Ｐ２）×Ｖ／（Ｍ 单位：ｍｇ／ｇ）和吸附率 Ｚ＝ （ Ｐ１－ Ｐ２）／Ｐ１ 式中 Ｐ１ 为样品溶液中总黄酮的初始浓度， Ｐ２ 为吸附平衡后溶液中总黄酮的浓度，Ｖ 为母液体 积，Ｍ 为树脂干重［１，９］。 ２．５．２ 静态解吸附率测定 将上述过滤后的聚酰胺树 脂，用水洗至洗脱液无色，去除树脂表面残留的溶 液，精密加入 ７０％乙醇 ５０ｍ（ｌ Ｖ０），振摇 ２４ｈ 后，过滤， 精密量取 １ｍｌ 于 １００ｍｌ 容量瓶中，按照样品吸光度
表 ２ 乙醇浓度对总黄酮类物质提取效果的影响
由表 ２ 可知：桑叶中总黄酮物质得率随乙醇浓度 的增加，呈上升趋势。在乙醇浓度为 ７０％时，提取效果 最好，总黄酮物质得率最高为 ２．０７％。浓度进一步增 加，总黄酮物质得率略有下降。故以乙醇浓度为 ７０％ 为宜。 ３．１．２ 浸泡时间对醇浸法提取效果的影响 在其他条件 相同情况下，用浓度为 ５０％的乙醇分别浸泡 １ｈ、３ｈ、 ５ｈ、５ｈ 以上，测定提取液中的吸光度，结果如表 ３ 所 示。
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超声波提取桑叶中总黄酮的工艺研究
高中松， 丁 文， 高 亮 （ 吉首大学城乡资源与规划学院，湖南张家界 ４２７０００）
称取聚酰胺树脂 ８０ｇ，先用 ９５％的乙醇浸泡 ２４ｈ， 然后用 ０．１ｍｏｌ／Ｌ 的 ＮａＯＨ 浸泡 ４ｈ 后用蒸馏水冲至中 性，最后用 ０．１ｍｏｌ／ＬＨＣｌ 处理 ４ｈ，也可用蒸馏水冲至
中性，再用洗脱液洗脱一次［１］。 ２．２ 测定方法 ２．２．１ 标 准 曲 线 的 绘 制 准 确 称 取 芦 丁 标 准 试 剂 １０．００ｍｇ，用 ６５％乙醇溶解，并定容于 ５０ｍｌ 容量瓶中， 分 别 吸 取 上 述 芦 丁 标 准 液 ０、０．５ｍｌ、１．０ｍｌ、２．０ｍｌ、 ３．０ｍｌ、４．０ｍｌ 于 １０ｍｌ 容量瓶中，加 ０．５ｍｌＮａＮＯ２（１：２０） 溶液，摇匀放置 ６ｍｉｎ，加入 ０．５ｍｌＡｌ（ＮＯ３）３（１：１０）６ｍｉｎ 后，再加 ４ｍｌ１ｍｏｌ／Ｌ 的 ＮａＯＨ 溶液，定容，摇匀放置 １０￣２０ｍｉｎ。在 ５００ｎｍ 波长处，以第一管溶液作为空白。 测得不同浓度下吸光度值，以吸光度值为纵坐标，浓度 为横坐标进行回归，绘制标准曲线。如下图。
第 一 作 者 简 介 ： 高中松，女，１９６６ 年出生，讲师，本科学历，主要从事植物活性成分研究工作。Ｔｅｌ：０７４４－２１１５０５８，８２０２０７２，Ｅ－ｍａｉｌ：ｓｏｎｇｚｉ３２０＠１６３．ｃｏｍ。通信 地址：４２７０００ 湖南省张家界市三角坪 吉首大学（ 张家界校区）城乡资源与规划学院。 收 稿 日 期 ： ２００５－１１－２１，修回日期：２００５－１２－０７。
Ｓｔｕｄｙ ｏｎ Ｕｌｔｒ ａｓｏｎｉｃ Ｅｘｔｒ ａｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｍｕｌｂｅｒ ｒ ｙ Ｌｅａｖｅｓ Ｇａｏ Ｚｈｏｎｇｓｏｎｇ， Ｄｉｎｇ Ｗｅｎ， Ｇａｏ Ｌｉａｎｇ
（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ ａｎｄ Ｐｉａｎｎｉｎｇ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｊｉｓｈｏｕ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｚｈａｎｇｊｉａｊｉｅ Ｈｕｎａｎ ４２７０００）
１ 材料、仪器及试剂 １．１ 材料
桑叶于 ２００５ 年 ４ 月采于湖南省吉首大学（ 张家界 校区）校园内，经吉首大学城乡资源与规划学院廖博儒 副教授鉴定，将采回来的新鲜桑叶放入烘箱中 ６０℃烘 干，再用粉碎机过 ６０ 目筛粉碎备用 １．２ 仪器
ＵＶ－１６０Ａ 分光光度计（ 日本岛津），ＬＤ５－２Ａ 离心 机（ 北京医用离心机厂）ＢＭ４００ 旋转蒸发仪（ 日本岛 津）ＳＨＺ－（Ｄ Ⅲ）循环水式真空 巩义市英峪予华仪器厂 ＤＶ－６３ 烘箱（ 日本岛津）ＦＤ－２３０ 红外水分仪（ 日本岛 津）ＢＳ－６５ 水浴锅（ 日本岛津）粉碎机
表 ３ 浸泡时间对总黄酮类物质提取效果的影响
由表 ３ 可知：桑叶中总黄酮物质得率随浸泡时间 延长，呈上升趋势。乙醇浸泡 ３ｈ 得率最高，其得率为 １．８５％。但随浸泡时间延长，得率反而下降。故以浸泡 时间 ３ｈ 为宜。 ３．１．３ 不同料液比对醇浸法提取效果的影响 不同的料 液比为 １：５、１：１０、１：１５ 在用 ５０％乙醇 ８０℃下浸泡 ３ｈ， 测定提取液中吸光度，结果如表 ４ 所示。
桑叶始载于《 神农本草经》，为桑科植物桑（Ｍｏｒｕｓ ａｌｂａ Ｌ．）的干燥叶，味苦、甘，性寒，归肺、肝经；功能疏 散风热，清肺润燥、清肝明目；主治风热感冒、头昏头 痛、目赤昏花等症［１￣５］。近代医家也常将桑叶用于治疗 糖尿病且得到满意的疗效。现代药理研究证实桑叶具 有抑制血清脂质增加和抑制动脉粥样硬化形成及降血 糖的作用［６］。桑叶中有很多成分如黄酮、生物碱、多糖、 氨基酸、维生素和微量元素等，其中黄酮、多糖、生物碱 是主要活性成分［７￣１０］。因此桑叶中黄酮类成分提取分离 纯化对开发利用桑叶具有重要意义。笔者对桑叶总黄 酮的提取进行正交优化筛选，并用聚酰胺吸附树脂进 行分离纯化及含量测定研究［１１］。
（Ｌ９ ３４）正交表进行实验（ 见表 ９）［３，８］。
表 １ 正交实验因素水平表
总黄酮得率（％）＝（Ｘ×Ｖ／Ｖ０×Ｗ×１００００００）×１００％ Ｖ— ——样液定容后的体积
Ｖ０— ——测定吸光度用样液的体积 Ｗ— ——称取样品桑叶粉重量 ２．３ 桑叶总黄酮提取工艺流程 新鲜桑叶→烘干→粉碎→过筛（ ６０ 目）→浸提→ 离心→过滤→硅藻土（ ０．５ｇ ２４ｈ）→抽滤→上树脂柱→ 水洗→不同浓度的乙醇洗脱→浓缩并定容到 ５０ｍｌ→ 测定吸光值→分析计算［７］。 ２．４ 桑叶黄酮的提取 ２．４．１ 乙醇浸泡法提取单因素实 验 准确称取 ５．０ｇ 桑 叶干粉末 ３ 份，用不同乙醇浓度、浸泡时间、料液比、提 取温度分别进行单因素实验［２，７］。 ２．４．２ 超声波法提取单因素实验 准确称取 ５．０ｇ 桑叶 干粉末 ３ 份，用不同超声时间、乙醇浓度、料液比分别 进行单因素实验［３，７］。 ２．４．３ 超声波提取正交优化实验设计 准确称取 ５．０ｇ 桑叶干粉末以不同的超声时间﹑乙醇浓度﹑料液比为
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测定方法，显色后测定吸光度值，代入标准曲线方程 计算洗脱液中总黄酮浓度（ Ｐ３）并按照下式计算解吸 率 Ｈ（＝ Ｐ３×Ｖ１）（／ Ｅ×Ｍ）式中 Ｐ３ 为乙醇溶液中总黄酮浓 度，Ｖ１ 为乙醇溶液的体积。 ３ 结果分析与讨论 ３．１ 乙醇浸泡法提取单因素实验结果 ３．１．１ 乙 醇 浓 度 对 醇 浸 法 提 取 效 果 的 影 响 分 别 用 ３０％、５０％、７０％、９０％的乙醇溶液，以料液比为 １：１５，在 ８０℃下浸泡 ３ｈ，测定提取液中吸光度，结果如表 ２ 所 示。
摘 要： 采用醇提法、超声提取法探讨了从桑叶中提取总黄酮类物质的最佳工艺。试验结果表明：通过 单因素试验和正交试验， 超声提取效果最好。其最佳条件是：用浓度为 ７０％、按料液比 １：１５ 的比例的 乙醇浸泡 ３ｈ， 再用超声提取 ４５ｍｉｎ， 其桑叶中总黄酮类物质的提出率可达 ２．１８％ 采用聚酰胺树脂为 层析柱填充料， 对桑叶黄酮的提取液进行了纯化。还通过样品的总黄酮与 ＦｅＣｌ３、浓 Ｈ２ＳＯ４ 等试剂的 特征反应对所得提取物进行了定性分析， 确定了所得提取物为黄酮类物质。 关键词： 桑叶； 黄酮化合物； 聚酰胺； 超声波提取 中图分类号： ＴＱ２５３．１ 文献标识码： Ａ
表 ４ 不同料液比对总黄酮类物质提取效果的影响
由表 ４ 可知： 桑叶中总黄酮物质得率随料液比值 的增大，其得率有所上升。５．０ｇ 桑叶干粉末在料液比为 １：１５ 时，经乙醇浸泡提取后，提取效果最好，总黄酮类 物质的得率为 ２．３６％。但随料液比值的再增大，其得率 反而下降。故以料液比 １：１５ 时为最佳。 ３．１．４ 不同温度对醇浸法提取效果的影响 在温度为 ４０℃、６０℃、８０℃下用 ５０％乙醇浸泡 ３ｈ，料液比 １：１５， 测定提取液中吸光度，结果如表 ５ 所示。
Ａｂｓｔｒ ａｃｔ： Ｉｔ ｉｓ ｓｔｕｄｉｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ ｔｏｔａｌ ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ ｆｒｏｍ ｍｕｌｂｅｒｒｙ ｌｅａｖｅｓ ｂｙ ａｌ－ ｃｏｈｏｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ ａｎｄ ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ ｍｅｔｈｏｄ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔ ｉｎｄｉｃａｔｅｓ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ ｉｓ ｔｈｅ ｂｅｓｔ ｂｙ ｔｈｅ ｓｉｎｇｌｅ ｆａｃｔｏｒ ａｎｄ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｄｅｓｉｇｎ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ． Ｔｈｅ ｍｏｓｔ ｏｐｔｉｍａｌ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ａｒｅ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｃｏｎ－ ｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｌｃｏｈｏｌ ｉｓ ７０％， ｔｈｅ ｒａｔｅ ｏｆ ｒａｗ ｍａｔｅｒｉａｌ ｔｏ ａｌｃｏｈｏｌ ｉｓ １：１５， ｔｈｅ ｉｍｍｅｒｓｉｏｎ ｔｉｍｅ ｉｓ ３ｈｒｓ， ｔｈｅｎ ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ ｆｏｒ ４５ｍｉｎ． ｂｙ ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ ｍｅｔｈｏｄ． Ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ ｒａｔｅ ｏｆ ｔｏｔａｌ ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ ｃａｎ ｒｅａｃｈ ２．１８％． Ｉｔ ｉｓ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｏｆ ｔｈｅ ｍｕｌｂｅｒｒｙ ｌｅａｖｅｓ ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ ｂｙ ｐｏｌｙａｍｉｄｅ ｃｏｌｕｍｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ， Ｔｈｅ ｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ ｓａｍｐｌｅ ｉｓ ｃｏｎｄｕｃｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｏｔａｌ ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ ｗｉｔｈ ＦｅＣｌ ３ ，ｓｕｌｆｕｒｉｃ ａｃｉｄ ａｎｄ ｓｏ ｏｎ， Ｉｔ ｉｓ ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｍａｔｅｒｉａｌ ｉｓ ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ． Ｋｅｙ ｗｏｒ ｄｓ： Ｍｕｌｂｅｒｒｙ ｌｅａｖｅｓ， Ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ， Ｐｏｌｙａｍｉｄｅ， Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ