质粒DNA的提取及电泳检测

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质粒DNA的提取与电泳鉴定_百替生物

质粒DNA的提取与电泳鉴定质粒DNA的提取是从事基因工程工作中的一项基本实验技术，但提取方法有很多种，以下介绍一种最常用的方法：碱裂解法：此方法适用于小量质粒DNA的提取，提取的质粒DNA可直接用于酶切、PCR扩增、银染序列分析。

方法如下：1、接1%含质粒的大肠杆菌细胞于2ml LB培养基。

2、37℃振荡培养过夜。

3、取1.5ml菌体于Ep管，以4000rpm离心3min，弃上清液。

4、加0.lml溶液I(1％葡萄糖，50mM/L EDTA pH8.0，25mM/L Tris-HCl pH8.0)充分混合。

5、加入0.2ml溶液II(0.2 mM/L NaOH，1％SDS)，轻轻翻转混匀，置于冰浴5 min 。

6、加入0.15m1预冷溶液III(5 mol/L KAc，pH4.8)，轻轻翻转混匀，置于冰浴5 min 。

7、以10，000rpm离心20min，取上清液于另一新Ep管8、加入等体积的异戊醇，混匀后于?0℃静置10min。

9、再以10，000rpm离心20min，弃上清。

10、用70％乙醇0．5ml洗涤一次，抽干所有液体。

11、待沉淀干燥后，溶于0．05mlTE缓冲液中煮沸法1、将1.5ml培养液倒入eppendorf管中,4℃下12000ｇ离心30秒。

2、弃上清，将管倒置于卫生纸上几分钟，使液体流尽。

3、将菌体沉淀悬浮于120ml STET溶液中, 涡旋混匀。

4、加入10ml新配制的溶菌酶溶液(10mg/ml), 涡旋振荡3秒钟。

5、将eppendorf管放入沸水浴中,50秒后立即取出。

6、用微量离心机4℃下12000g离心10分钟。

7、用无菌牙签从eppendorf管中去除细菌碎片。

8、取20ml进行电泳检查。

质粒DNA的大量提取和纯化在制作酶谱、测定序列、制备探针等实验中需要高纯度、高浓度的质粒DNA,为此需要大量提取质粒DNA。

大量提取的质粒DNA一般需进一步纯化,常用柱层析法和氯化绝梯度离心法。

实验八质粒DNA的提取及琼脂糖凝胶电泳检测

当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液恢复 pH至中性时，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那么迅速而准确，它们缠绕形成网状结构，通过离心，染色体 DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
2.简要叙述酚氯仿抽提ＤＮＡ体系后出现的现象及其成因?
3.沉淀ＤＮＡ时为什么要用无水乙醇及在高盐、低温条件下进行？
质粒3种构型
1.超螺旋的共价闭合环状质粒DNA(covalelltly closed circular DNA，简称cccDNA); 2.开环质粒DNA，即共价闭合环状质粒DNA的一条链断裂，(open circular DNA，简称ocDNA); 3.线形质粒DNA，即共价闭合环状质粒DNA 两条链发生断裂(linear DNA，简称LDNA)。
2. 琼脂糖凝胶电泳检测DNA
一、实验目的
通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测 DNA的方法和技术。
二、实验原理
DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在高于等电点的pH 溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖—磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型。具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样，可进行分离。DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系。
２．取1.4 ml培养液至Eppendorf管中，12000rpm离心30 秒，弃上清，取沉淀。
３．将细菌沉淀悬浮于100µl预冷溶液Ⅰ中，振荡混匀。４．加入200µl溶液Ⅱ，缓慢颠倒离心管，混匀（勿剧烈

质粒dna提取及电泳检测实验报告

质粒dna提取及电泳检测实验报告质粒DNA提取及电泳检测实验报告引言质粒DNA提取及电泳检测是生物学实验中常用的技术手段，用于分离和检测质粒DNA样本中的目标序列。

本实验旨在通过提取质粒DNA并进行电泳检测，验证提取的质粒DNA的纯度和完整性。

材料与方法1. 材料：- 质粒DNA样本- 细菌培养液- 细菌裂解液- 氯仿- 异丙醇- TE缓冲液- 琼脂糖- TAE缓冲液- DNA分子量标记物2. 方法：1. 质粒DNA提取：a. 将细菌培养液中含有质粒DNA的细菌进行离心，收集细菌沉淀。

b. 加入适量的细菌裂解液，裂解细菌细胞，释放质粒DNA。

c. 加入氯仿，离心分离上清液和有机相。

d. 收集上清液，加入异丙醇，使DNA沉淀。

e. 用TE缓冲液溶解DNA，得到质粒DNA提取物。

2. 质粒DNA电泳检测：a. 准备琼脂糖凝胶，加入TAE缓冲液，制备电泳槽。

b. 加载质粒DNA提取物和DNA分子量标记物于琼脂糖凝胶孔中。

c. 连接电源，进行电泳分离。

d. 观察电泳结果，记录质粒DNA的迁移情况和分子量。

结果与讨论通过质粒DNA提取及电泳检测实验，我们成功地提取到质粒DNA，并进行了电泳分离和检测。

在电泳结果中，我们观察到质粒DNA 片段在凝胶中呈现出带状分布，且迁移距离与分子量呈正相关关系。

根据电泳结果，我们可以初步判断质粒DNA的纯度和完整性。

如果质粒DNA在电泳过程中呈现单一的清晰带状分布，且没有明显的附加杂带，说明质粒DNA的纯度较高，没有明显的污染物。

而如果质粒DNA呈现模糊或多条不清晰的带状分布，可能存在其他DNA片段或杂质的污染。

通过电泳结果中质粒DNA片段的迁移距离，我们可以估算出质粒DNA的大致分子量。

通过与DNA分子量标记物的比对，我们可以初步判断质粒DNA的大小和可能的构造。

这对于进一步的研究和应用具有重要意义。

结论通过质粒DNA提取及电泳检测实验，我们成功地提取到质粒DNA，并验证了其纯度和完整性。

实验一质粒DNA提取纯化、DNA电泳检测

实验⼀质粒DNA提取纯化、DNA电泳检测实验⼀质粒DNA提取纯化、DNA电泳检测⼀、实验⽬的1．掌握质粒DNA的制备的原理和⽅法2．了解质粒琼脂糖凝胶电泳分离⼆、实验原理1．质粒DNA的制备⽅法质粒(Plasmid)是独⽴存在于染⾊体外、能⾃主复制并能稳定遗传的⼀种环状双链DNA 分⼦，分布于细菌、放线菌、真菌以及⼀些动植物细胞中，但在细菌细胞中含量最多。

细菌质粒⼤⼩介于1～200Kb之间，是应⽤最多的质粒类群，在细菌细胞内它们利⽤宿主细胞的复制机构合成质粒⾃⾝的DNA。

质粒DNA的制备包括3个步骤：①培养细菌，使质粒DNA⼤量扩增；②收集和裂解细菌；③分离和纯化质粒DNA。

主要⽅法包括：碱裂解法：0.2molNaOH+1%SDS；煮沸裂解法：沸⽔煮沸40秒；SDS裂解法：10%SDS，⼀般⽤于质粒⼤量提取。

在实际操作中可以根据宿主菌株类型、质粒分⼦⼤⼩、碱基组成和结构等特点以及质粒DNA的⽤途进⾏选择。

本实验选择碱裂解法提取质粒DNA。

2．碱裂解法质粒DNA具特定的形态结构，在特殊的环境条件下，如加热、极端pH值、有机溶剂、尿素、酰胺试剂等会导致质粒DNA变性，去除变性条件⼜可以使DNA复性。

碱裂解法根据共价闭合环状质粒DNA和线性染⾊体DNA在拓扑学上的差异来分离质粒DNA。

SDS是⼀种阴离⼦表⾯活性剂，它既能裂解细菌细胞，⼜能使细菌蛋⽩质变性。

SDS 处理细菌细胞后会导致细菌细胞壁破裂，从⽽使质粒DNA及细菌基因组DNA从细胞中同时释放出来。

细菌环状基因组DNA在操作过程中会断裂成线状DNA分⼦，在pH值介于12.0～12.5这个狭窄的范围内，线性的DNA双螺旋结构解开⽽被变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕结合在⼀起。

当加⼊pH4.8⼄酸钾缓冲液时，pH恢复⾄中性，因为共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在⼀起，因此复性迅速⽽准确，⽽线性的染⾊体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那么迅速⽽准确，它们相互缠绕形成不溶性⽹状结构，⽽复性的质粒DNA恢复原来构型，保持可溶性状态。

质粒dna的提取与鉴定实验报告

质粒DNA的提取与鉴定实验报告引言质粒DNA的提取与鉴定是分子生物学实验中常用的技术之一。

质粒DNA是一种圆形的DNA分子，广泛存在于细菌和真核生物中。

提取和鉴定质粒DNA能够帮助研究人员进行基因克隆、基因表达调控等实验。

本实验旨在介绍质粒DNA的提取与鉴定步骤，以供初学者了解和学习。

实验材料•细菌培养物•质粒DNA提取试剂盒•去离子水• 1.5 mL离心管•微量离心管•离心机实验步骤步骤一：培养细菌并收获培养物1.取一支含有目标质粒的细菌培养物，将其接种至含有适当抗生素的培养基中。

2.在37℃恒温摇床上培养过夜，确保细菌得到充分生长。

步骤二：收获细菌培养物1.将培养基离心机中以12000转/分钟离心2分钟，以沉淀细菌细胞。

2.弃去上清液，将细菌细胞沉淀保留在离心管中。

步骤三：质粒DNA的提取1.选择一款质粒DNA提取试剂盒，按照说明书中的步骤操作。

不同试剂盒所用方法有所差异，详细操作请参照试剂盒说明书。

2.在质粒DNA提取试剂盒提供的试剂中加入细菌细胞，充分混合。

3.通过离心将细菌细胞裂解，释放出质粒DNA。

不同试剂盒所用离心条件有所不同，一般为高速离心1-3分钟。

4.弃去上清液，留下含有裂解细胞的混悬液。

步骤四：质粒DNA的纯化1.将质粒DNA混悬液转移到新的离心管中。

2.加入适量的洗涤缓冲液，充分混合。

3.通过离心将质粒DNA沉淀，弃去上清液。

4.加入适量的洗涤缓冲液，充分混合。

5.通过离心将质粒DNA沉淀，弃去上清液。

6.加入适量的洗涤缓冲液，充分混合。

7.通过离心将质粒DNA沉淀，弃去上清液。

8.加入适量的洗涤缓冲液，充分混合。

9.通过离心将质粒DNA沉淀，弃去上清液。

10.加入适量的洗涤缓冲液，充分混合。

11.通过离心将质粒DNA沉淀，弃去上清液。

12.使用去离子水溶解沉淀的质粒DNA，使其浓度适宜。

步骤五：质粒DNA的鉴定1.使用紫外可见光分光光度计测定溶解后的质粒DNA的浓度。

2.准备一份对照组，即只含有去离子水的样品。

质粒dna提取及电泳检测实验报告(一)

质粒dna提取及电泳检测实验报告(一)质粒DNA提取及电泳检测实验报告实验目的•提取质粒DNA并检测其纯度和浓度•进行电泳检测，分析质粒DNA的大小和完整性实验材料•培养基含有质粒DNA的细菌培养物•高纯度DNA提取试剂盒•离心管、移液器、显微镜等常规实验仪器设备实验步骤1.收取 mL培养基含有细菌的培养物样品，放入离心管中。

2.将离心管置于高速离心机中，以12000 rpm离心5分钟，使细菌沉淀于离心管底部。

3.弃掉上清液，轻轻地加入合适的缓冲溶液悬浮沉淀的细菌细胞。

4.加入适量的裂解液使细菌细胞裂解，使质粒DNA释放到溶液中。

5.加入蛋白酶K进行蛋白质降解，使DNA更易提取。

6.加入冷乙醇混合液，沉淀DNA。

7.使用离心机离心，将沉淀的DNA分离出来。

8.用缓冲液洗涤提取的DNA，去除杂质。

9.使用专门的仪器或试剂盒检测提取的质粒DNA的浓度和纯度。

10.备取质粒DNA样品，进行电泳检测。

结果与分析•通过电泳检测，可以观察到质粒DNA的带状图案。

•根据带状图案的迁移距离，可以初步判断质粒DNA的大小。

•如果带状图案清晰且没有模糊的杂带，说明质粒DNA的完整性良好。

•通过测量提取的质粒DNA的浓度和纯度，可以进一步评估实验结果的可靠性。

结论•本实验成功提取并检测了质粒DNA，并通过电泳检测初步分析了其大小和完整性。

•经测量，质粒DNA的浓度和纯度符合实验要求。

•本实验结果可应用于后续实验或研究中，为进一步分析质粒DNA 的功能提供了基础。

实验注意事项•操作过程需严格遵守实验室安全规范，避免接触有毒或有害物质。

•仪器设备使用前需检查并确保正常工作。

•实验室内要保持清洁，避免污染样品。

•测量和记录数据时，要仔细操作，确保准确性和可重复性。

参考文献（如果有的话，请列出相关参考资料）。

质粒DNA的提取纯化与电泳检测

法、煮沸法、去污剂 (如Triton或SDS)裂解
法、羧基磷灰石柱层析法、质粒DNA释放
法、酸酚法等。
1 .碱裂解法提取质粒DNA
1.1原理

共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓
扑学上的差异来分离它们。
在pH值介于12.0~12.5这个狭窄的范围内，线
性的DNA双螺旋结构解开而被变性，共价闭合
接种含pUC-mT质粒的大肠杆菌到1.5ml含有60μg/ml Amp抗生素
的LB 液体培养基
37℃摇培过夜（10~12h）12000rpm,
3min
弃去上清液，倒立于滤纸之上，尽量去净上清。
加100μl Ⅰ液，涡旋震荡，充分混匀
配制适量的Ⅱ液
加200μl Ⅱ液，迅速轻轻混匀（以颠倒EP管5-10次为宜），
电泳介质相同（电泳液和凝胶）：
• 分子在电场中迁移的速度主要取决于
分子本身的大小和形状。
• 形状相似的分子的迁移速度主要与分
子量相关: 分子量越大，移动越慢。
凝胶板
（二）琼脂糖凝胶电泳介绍
琼脂糖:
是一种线性多糖聚合物，从红色海藻产物
琼脂中提取而来。
琼脂糖凝胶:
琼脂糖在水里（或电泳液）中加热到沸点
电泳缓冲液的组成。

5.溴化乙锭染料
Biblioteka EB:溴化乙锭（ 3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶溴盐
Ethidium Bromide，EB），EB能插入DNA分子碱基
对之间，导致EB与DNA结合。DNA吸收的260nm的紫
外光传递给EB，或者结合的EB本身在300和360吸收的
射线，均可在可见光区以590波长发射出来，呈橙红色。
离子交换层析法

质粒dna的提取及电泳检测实验报告

质粒dna的提取及电泳检测实验报告一、实验目的本实验的主要目的是学习质粒DNA的提取方法和电泳检测技术，并通过实验观察质粒DNA的提取情况和电泳检测结果。

二、实验原理质粒DNA的提取方法主要采用碱裂解法，通过将细胞裂解后，用酸性物质中和碱性物质，使DNA分离出来，最后用酒精沉淀纯化。

电泳检测是通过将DNA 样品置于琼脂糖凝胶上，加上电场后，DNA在凝胶中移动，通过电泳带电的原理，将DNA分离出来，从而观察DNA的大小和形状。

三、实验步骤1.准备样品：将含有目标DNA的菌落挑出放入EP管中，加入100μl TE缓冲液（10mmol/L Tris-HCl,1.0mmol/L EDTA,pH8.0），用微量移液器均匀混合。

2.制备裂解液：取10μl 0.25mol/L NaOH加入菌液中，轻轻摇匀，并立即加入200μl 1%SDS（十二烷基硫酸钠）液，翻转混匀。

3.裂解DNA：加入150μl NaOH-SDS溶液，翻转10次，置于80℃水浴中裂解细胞壁和细胞膜，20min后取出，加入150μl冷KAc/EDTA溶液（3mol/L KAc，pH5.2，0.5mol/L EDTA），翻转混匀，冰上静置5min。

4.离心沉淀：10000r/min离心10min，将上清液移至新的96孔板中，加入0.6倍体积的冰凉乙醇，反复翻转，置于-20℃上进行冷却，离心12000r/min 10min，去掉上清液，用95%乙醇洗涤沉淀物，最后用300μl TE缓冲液溶解沉淀DNA。

5.电泳检测：取相同浓度的DNA样品，加入琼脂糖，混合后加入电泳槽中，通电检测10min。

四、实验结果经过实验操作后，取出DNA样品，通过电泳检测，观察到有一条长度合适的条带，证明质粒DNA已经成功提取，并且检测结果与对照组差异不大，说明实验操作规范，结果可信。

五、实验结论本次实验通过碱裂解法成功提取了质粒DNA，并通过电泳检测技术检测到了DNA条带，证明提取质粒DNA的方法可行，同时也说明电泳检测是一种可靠的分子生物学技术，对于DNA分离和检测有着重要的应用价值。

质粒提取、纯化、电泳检测

质粒DNA的提取、纯化和电泳检测【实验目的】1、掌握碱变性提取法的原理及各种试剂的作用；2、掌握碱变性法提取质粒DNA的方法；3、学习并掌握凝胶电泳进行DNA分离纯化的实验原理；4、学习并掌握凝胶的制备方法；5、学习并掌握凝胶中DNA的分离纯化方法；6、验证E.coli DH5α与E.coli DH5α（pUC19）在含有氨苄培养基上的生长情况并了解其原理。

【实验原理】1、携带外源基因并将外源基因导入宿主细胞，使之进行扩增和表达的媒介称为载体。

在基因工程操作中载体具有以下性质：A.具有自主复制的起点；B.具有多个限制性核酸内切酶的单一识别位点（多克隆位点）；C.具有可供选择的遗传标记；D.具有高拷贝数。

2、质粒 DNA 是原核生物除类核中的染色体 DNA以外 ,细胞质中含有的一个或多个能独立复制并稳定遗传的小环状双链 DNA 分子。

除酵母的杀伤质粒为RNA 外 , 迄今发现的所有质粒均为双链环状DNA 。

多数质粒只有几千个 bp但也有一些质粒达105bp 以上 ,一般分子量在 ( 4～100) × 106道尔顿范围内。

不同的质粒在细胞内的拷贝数不同。

细胞内含有1-3个拷贝的质粒为低拷贝质粒（严紧型复制），当质粒数在10个拷贝以上，为高拷贝质粒（松弛型复制），用于载体构建质粒多为松弛型。

3、pUC19质粒大小约为2.69kb，含有以下构件：来自于E.coli质粒ColE1的松弛型复制起点；氨苄青霉素抗性基因（Amp r）；E.coliβ-半乳糖苷酶基因（LacZ）的启动子及编码β-半乳糖苷酶的DNA序列；多克隆位点（MCS）区段。

图1.pUC18/pUC19质粒图谱4、质粒在细胞内以共价闭合环状DNA的形式存在，呈超螺旋状态（cccDNA）。

在抽提质粒DNA的过程中，由于各种因素影响，使超螺旋的共价闭合环状结构的质粒DNA的一条链断裂，变成开环DNA(ocDNA)，若两条链发生断裂则转变为线状DNA（L DNA）。

实验六、大肠杆菌质粒DNA的提取与电泳检测

实验步骤
2.质粒DNA的提取（碱裂解法） ①将收集的细菌沉淀悬浮于100μ l冰预冷的溶液Ⅰ中，强
烈振荡混匀； ②加入200ul新配的溶液Ⅱ于细菌悬液中，迅速颠倒离心管
5次（不应振荡），以混合内容物，室温放置5min或冰上放置3min. ③加入150μ l预冷的溶液Ⅲ，盖紧管口，颠倒离心管5～10 次，使溶液Ⅲ在黏稠的细菌裂解物中分散均匀，随后将管置于冰上5～10min。
实验原理
同一质粒DNA的不同构型尽管相对分子质量相同，但在琼脂糖凝胶电泳中的电泳迁移率却是不同的。一般情况下，泳动速率由快至慢依次为：超螺旋质粒（SC）、线性质粒（L）、开环质粒（OC）。质粒DNA的提取方法较多，要根据宿主菌和质粒的特性选择适合的提取方法。目前常用的质粒提取方法有：碱裂解法、煮沸法。几种方法的提取流程是一样的：培养细菌扩增质粒 →收集菌体裂解细胞→分离和纯化质粒DNA。
（2）溶液Ⅱ：0.2mol/L NaOH 1% SDS（pH值12.6）
（3）溶液Ⅲ：5mol/L KAc 60ml 冰乙酸 11.5ml 水28.5ml（pH4.8）
（4）LB培养基（5）琼脂糖（7）1×TAE电泳缓冲液（pH 8.0）：10 mmol/LTris·Cl
1 mmol/L EDTA （8）上样缓冲液（溴酚蓝（9）溴化乙锭（1mg/ml）
电泳结束后取出胶膜，使用凝胶成像系统拍照,观察。对比标准DNA条带和未知DNA条带，观察其带型和迁移距离，即可获得未知样品的浓度、纯度和相对分子质量大小。
质粒DNA 电泳检测过程示意图称脂糖加TAE灌胶
凝固
点样
电泳
加热溶解
加EB
放入电泳槽
加溴酚蓝
观察拍照

实验一、质粒DNA的提取及检测实验报告

实验一、质粒DNA的提取及检测【实验目的】1、掌握碱裂解法提取质粒的原理和步骤2、掌握琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术3、学会PCR操作的基本技术第一部分质粒DNA的提取一、实验原理：碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。

在pH值介于～这个狭窄的范围内，线性的DNA双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕，仍会紧密地结合在一起。

当加入的乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那么迅速而准确，它们缠绕形成网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。

二、仪器与试剂1、仪器恒温摇床、台式离心机2、试剂溶液I、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ、无水乙醇、TE缓冲液、胰RNA酶、酚、氯仿三、实验步骤1、将2mL含相应抗生素（Amp:50μg/mL）的LB液体培养基加入到试管中，接入含pUC19质粒的大肠杆菌，37℃振荡培养过夜。

2、取培养物倒入微量离心管中，4000r/min离心2min。

3、吸去培养液，使细胞沉淀尽可能干燥。

4、将细菌沉淀悬浮于100μL溶液I中，充分混匀，室温放置10 min。

5、加200μL溶液Ⅱ（新鲜配制），盖紧管皿，混匀内容物，将离心管放冰上5min。

6、加入150μL溶液Ⅲ（冰上预冷），盖紧管口，颠倒数次使混匀。

冰上放置15min。

7、12000r/min，离心15min，将上清转至另一离心管中。

8、向上清中加入等体积酚：氯仿（1：1）（去蛋白），反复混匀，12000r/min，离心5min，将上清转移到另一离心管中。

9、向上清加入2倍体积无水乙醇，混匀后，室温放置5～10min。

12000r/min，离心5min。

质粒DNA提取,电泳鉴定

试剂中的主要成分和作用
重悬细菌
GTE缓冲液： Tris-HCl溶液：调节pH。葡萄糖：使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管
子底部。 EDTA：二价金属离子螯合剂，抑制DNase活性。
变性
NaOH-SDS溶液： NaOH：溶解细胞，破坏核酸碱基配对使氢键断裂
从而让核酸变性。 SDS：裂解细胞，结合蛋白质，形成SDS-蛋白质
定要充分混匀！
6. 4℃，12000rpm离心5min，取上清300ul 转移的EP管中。
至另一支新
7. 加180ul异丙醇，冰浴20min，12000rpm离心5min，弃上清液。
8. 缓慢加入70%乙醇0.5ml，轻轻上下颠倒， 12000rpm离心 1min，吸弃大部分上清，挥干剩余乙醇。
agrose gel电泳是分离鉴定和纯化DNA分子的常用方法，不同浓度的琼脂糖胶可分离100bp-60kb的DNA片段，在琼脂糖电泳中， DNA迁移的速率不仅与其分子量的对数值成反比，即分子量越大，移动速率越慢，而且还与分子构型有关如质粒开环DNA<线性DNA< 共价闭合环状DNA。
预期实验结果
RNase溶液：水解上清中小分子RNA。异丙醇：快速沉淀质粒DNA，但难以挥发。 70%乙醇：去除异丙醇，且易于挥发除去。 TE缓冲液：溶解质粒DNA沉淀，含有EDTA能
够使DNA保存时间更长。
琼脂糖凝胶电泳
溴化乙锭（EB）能够嵌入到DNA分子的碱基对中形成荧光复合物，在紫外线激发下发射荧光
基本原理
当菌体在NaOH-SDS溶液中裂解时，蛋白质与 DNA会发生变性。加入中和液（乙酸钾）后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；而染色体DNA、大分子RNA 以及蛋白质-SDS复合物等形成沉淀，可通过离心去除。

质粒DNA的提取与电泳检测

2008
分子实生验
物学
2。质粒DNA的提取：
已经提出过许多方法用于从细菌中提纯质粒 DNA，这些方法都含有以下3个步骤：
◆ 细菌培养物的生长。 ◆ 细菌的收获和裂解 ◆ 质粒DNA的纯化。
2008
分子实生验
物学
三. 仪器和试剂
试剂:
1、质粒快速提取试剂盒
溶液1（SET缓冲液）、溶液2（Lysis Buffer)、溶液3（3M NaAc,Ph4.8)、结合缓冲液、漂洗液、洗脱缓冲液、吸附柱、废液收集管
2008
分子实生验
物学
(5)向吸附柱加入700ul漂洗液， 12000rpm离心 30秒。倒掉废液，装回吸附柱。
(6)重复（5），再次12000rpm离心2分钟以完全去除漂洗液。
(7)回收质粒：将吸附柱移到一个新的1.5ml eppendorf管中，向吸附膜中央加入50ul 洗脱缓冲液（水浴预热至70度），溶解提取物,室温放置2分钟，12000rpm离心2分钟.
(8)琼脂糖凝胶电泳检测提取结果.
2008
分子实生验
物学
五、试验结果六、结果分析
2008
分子实生验
物学
一. 实验目的
1.通过质粒DNA的提取和检测，掌握提取质粒的方法以及用凝胶电泳分离鉴定质粒DNA的方法。
2008
分子实生验
物学
二. 实验原理
1.质粒概述:
质粒是染色体外能够进行自主复制的遗传单位，现在习惯上用来专指细菌、酵母菌和放线菌等生物中染色体以外的DNA分子。在基因工程中质粒常被用做基因的载体。
(3)裂解：加入100ul溶液1（用完后4度保存）,充分吹打混匀后, 加入150ul溶液2（用完立即拧紧瓶盖）,温和颠倒5-10次,零下20度放置3分钟.加入150ul溶液3,温和颠倒 5-10次,放置5分钟. 12000rpm离心5分钟

质粒DNA的提取与酶切电泳鉴定.ppt

8、彻底弃上清，将管口敞开倒置于卫生纸上使所有液体流出，加入 1ml70％乙醇洗沉淀一次，4℃下12000 rpm离心2分钟。
9、吸除上清液，将管倒置于卫生纸上使液体流尽，室温开盖放置1015min，使乙醇挥发殆尽。
10、将沉淀溶于30-50μl TE缓冲液（pH8.0，含20μg/mlRNaseA）中，储于-20℃冰箱中。
5、加入350μl预冷的溶液Ⅲ，盖紧管口，反复颠倒离心管5次，出现白色沉淀，使沉淀混匀， 4℃ 12000rpm 离心10分钟。
6、上清液移入干净离心管中，加入等体积的酚/氯仿（1:1），振荡混匀，4℃下12000 rpm离心2分钟。
7、将上层水相移入干净离心管中，加入2倍体积的无水乙醇，振荡混匀后室温放置2分钟，然后4℃下12000 rpm离心5分钟。
2、取2 ml培养液倒入1.5ml EP管中（分次加入，离心）， 4℃ 12000 rpm 离心30s -1min，弃去上清；
3、用涡旋混匀器使菌体沉淀重悬浮于250μl冰预冷的溶液Ⅰ。
4、加入新配制的溶液Ⅱ250μl，盖紧管口，快速温和颠倒离心管5次，菌液变得透亮，以混匀内容物（千万不要振荡）。
11、酶切鉴定并将没有酶切的质粒与酶切的质粒进行琼脂糖凝胶电泳。（酶切体系一般1-2ul提取的质粒，10×buffer，相应的酶，余下加水，一般鉴定所用的酶切体系建议10ul）
质粒提取关键：
基因组DNA与质粒DNA的有效分离（碱裂解法）
高pH使质粒DNA和染色体DNA变性，同时沉淀蛋白质。再将pH值调至中性，质粒DNA较小，很容易复性成双链。而染色体DNA较大，不会复性，缠结成网状不溶物质，从而可以通过离心除去。
注意事项:
实验方法
碱裂解法

质粒DNA提取+电泳+质粒酶切实验报告

实验一：质粒DNA提取+琼脂糖凝胶电泳*实验目的：1.掌握质粒DNA提取的基本原理和方法2.掌握琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法*实验原理：1.DNA提取原理1）DNA提取要求：①保证DNA一级结构的完整性；②排除其他分子的污染，使其纯度尽可能提高。

2）DNA样品来源：①培养细胞；②组织样本；③血液样本。

3）主要试剂和材料及仪器：试剂和材料：RNA酶A、细胞悬浮液（Buffer P1)、细菌裂解液（Buffer P2）、中和液（Buffer P3）、漂洗液PW1、漂洗液PW2、洗脱液、质粒DNA吸附柱、滤液收集管仪器：微量移液器、台式微量高速离心机、电泳仪、水平电泳槽、紫外透射仪或凝胶成像系统。

2.电泳原理：1）概念：电泳是指带电粒子在电场中向电势降低的方向移动的现象，移动速度与粒子大小及所带电荷多少有关。

在一定pH条件下，核酸及蛋白质等生物分子呈带电状态，可以进行电泳分析。

2）迁移方向：DNA由负极向正极迁移3）影响目标物迁移速率的因素：分子大小、构象、凝胶浓度、琼脂糖种类、电泳缓冲液、嵌入染料的存在和使用电压等。

4）荧光强度（得率）：荧光的强度是同DNA片段的大小或数量成正比的。

5）琼脂糖凝胶电泳原理：(1)关于电泳技术:电泳常用于分离和纯化那些分子大小电荷性状或分个构象有所不同的生物大分子一尤其是蛋白质和核酸。

正因为如此，电泳已成为生物化学和分子生物学中应用最为广泛的技术之一，其中在分子生物学实验中最为常用的是琼脂糖凝胶电泳。

琼脂糖是一种海藻多糖，琼脂糖胶分离范围很大，但其分辨率却相对较低。

通过改变琼脂糖凝胶的浓度,应用标准的电泳技术可以分离200到50,000 bp大小的DNA片断。

一般琼脂糖胶浓度在0.5%到4%之间，琼脂糖凝胶浓度越大,凝胶就越硬。

较高浓度的琼脂糖胶有利于较小的DNA片断分离,而较低浓度的琼脂糖胶则可以分离较大的DNA片断。

(2)琼脂糖凝胶电泳条带的观察:通过观察示踪染料的迁移距离可以判断DNA的迁移距离。

实验一、质粒DNA的提取及检测实验报告(2020年整理).pptx

学海无涯
实验一、质粒 DNA 的提取及检测
【实验目的】 1、掌握碱裂解法提取质粒的原理和步骤 2、掌握琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 的方法和技术 3、学会 PCR 操作的基本技术
第一部分质粒DNA 的提取
一、实验原理：碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒 DNA 与线性染色体 DNA 在拓扑学上的差
二、仪器与试剂 1、仪器恒温摇床、台式离心机 2、试剂溶液 I、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ、无水乙醇、TE 缓冲液、胰 RNA 酶、酚、氯仿
三、实验步骤 1、将 2mL 含相应抗生素（Amp:50μg/mL）的 LB 液体培养基加入到试管中，接入含 pUC19
质粒的大肠杆菌，37℃振荡培养过夜。 2、取 1.5mL 培养物倒入微量离心管中，4000r/min 离心 2min。 3、吸去培养液，使细胞沉淀尽可能干燥。 4、将细菌沉淀悬浮于 100μL 溶液 I 中，充分混匀，室温放置 10 min。 5、加 200μL 溶液Ⅱ（新鲜配制），盖紧管皿，混匀内容物，将离心管放冰上 5min。 6、加入 150μL 溶液Ⅲ（冰上预冷），盖紧管口，颠倒数次使混匀。冰上放置 15min。 7、 12000r/min，离心 15min，将上清转至另一离心管中。 8、向上清中加入等体积酚：氯仿（1：1）（去蛋白），反复混匀，12000r/min，离心 5min，
变性
94℃
45s
退火
56℃
45s
延伸
72℃
45s
完全延伸
72℃
3min
（3）PCR 结束后，取 10μl 产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定。
在紫外灯（254nm）下观察染色后的电泳凝胶。DNA 存在处应显出桔红色荧光条带。
第三部分 PCR 扩增制备目的基因

质粒DNA的提取及检测实验报告

四川大学实验报告题目：质粒DNA的提取及检测一．实验目的:1.学习碱裂解法提取质粒的原理和方法；2.学习DNA琼脂糖凝胶电泳的原理和方法。

二．实验原理1. 质粒 (Plasmid)：一种染色体外的稳定遗传因子，大小从1-200kb不等，为双链、闭环的DNA分子，并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。

主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，常常编码一些对宿主有利的酶的基因，这些基因的表型包括抗生素抗性，产生抗生素、限制酶、修饰酶等。

2.载体(Vector)：要把一个有用的外源基因通过基因工程手段，转化到细胞中去进行繁殖和表达，需要运载工具，携带外源基因进入受体细胞的这种工具就叫载体。

目前除了大肠杆菌中的质粒、λ噬菌体、噬菌粒外，还有酵母人工染色体载体以及动、植物病毒载体等。

噬菌体、M133.分离质粒DNA：（1）培养细菌使质粒扩增；（2）收集和碱裂解细菌；（3）分离和纯化质粒DNA。

4.碱裂解法（1）溶液Ⅰ：50mmol/L葡萄糖，10mmol/EDTA-Na，25mmol/LTris-HCl (pH8.0) 作用：分散细胞，螯合金属离子使酶失活，防止DNA的降解（2）溶液Ⅱ：0.4mol/L NaOH，2% SDS，临用前1：1配制作用：细胞在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与染色体DNA发生变性1 / 9四川大学实验报告（3）溶液Ⅲ：5mol/L 醋酸钾60ml，冰醋酸11.5ml，双蒸水28.5ml作用：酸性条件上质粒DNA复性，留在上清液。

大肠杆菌DNA和蛋白质-SDS复合物等发生沉淀。

5.电泳带电荷的物质，在电场中的趋向运动称为电泳。

DNA的琼脂糖凝胶电泳可以分离长度为200bp至近50kb的DNA分子。

DNA的迁移率（U）的对数与凝胶浓度（T）之间存在反平行线性关系。

因此，要有效地分离不同大小的DNA片段，选用适当的琼脂糖凝胶浓度是非常重要的。

6.提取质粒在质粒提取的过程中，由于操作原因，提取的质粒可能有三种：线性DNA、开环DNA 、闭环超螺旋DNA 。