L_色氨酸工业化技术研究进展

微生物转化法的不足之处在于当转化液中前 体物浓度较高时，转化率有所下降，通过分批次少 量流加前体可以减少其抑制作用。 另外，L-色氨 酸前体物的价格比较昂贵，不利于降低成本。这种 方法很早就投入了工业化生产， 目前世界上最大 的 L-色氨酸生产厂家日本的昭和电工就是采用 以氨茴酸为前体物，利用 Hansenula 或 Bacllius 菌 种将其转化为 L-色氨酸。 Nakayama 等（JP 1982, 5:694）进—步 改 造 变 异 株 ，使 其 具 有 5-FT 和 8-
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系统。 随着重组 DNA 技术在微生物育种中的应 用，为优良的 L-色氨酸生产菌株的筛选和产酸水 平的提高提供了可靠的技术保障， 使微生物直接 发酵法生产 L-色氨酸成为—种廉价的工业化生 产方法。 发酵法生产 L-色氨酸大体上可以分为： 直接发酵法和前体添加发酵法。
直接发酵法中常用的 L-色氨酸产生菌有：谷 氨酸棒杆菌，黄色短杆菌，枯草杆菌，北京棒杆菌 等。如 Fukui（JP1974,20:391）等由枯草杆菌选育的 5—氟 色 氨 酸(5-FT)抗 性 变 异 株 ，可 积 累 L-色 氨 酸 9.6g/L。
色氨酸酶 3.2 吲哚+丙酮酸-铵离子 → L-色氨酸
此途径由于吲哚对色氨酸酶抑制作用较弱，
且丙酮酸价格不高， 因而已被 Genex 等公司所采
用。 但该途径是 L-色氢酸水解的逆反应要求底物
浓度较高，反应平衡不易把握。近几年国内已经有
单位对该工艺进行工业化开发。
2000 年 ，oikwa 等 人 （JP2000342294，2000）发
色氨酸合成酶或丝氨酸消旋酶 3.1 吲哚+DL-丝氨酸 → L-色氨酸
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第 39 卷
该方法的优点是酶转化反应周期短、投资少、 收率高、分离提取工艺简单。
由于商品 l-丝氨酸价格几乎与 L—色氨酸相 当， 致使该工艺很难推广到饲料级 L—色氨酸的 工业化生产。 如能解决低成本 L-丝氨酸和吲哚的 来源问题，该工艺可能是一种成本较低的 L-色氨 酸工业化生产方法， 与发酵法工艺相比具有投资 规模小、工艺控制简单和生产成本低等优点。
3 生物酶法
酶法是利用微生物中 L-色氨酸生物合成酶 系的催化功能生产 L-色氨酸。 这些酶包括色氨酸 酶、色氨酸合成酶、丝氨酸消旋酶等。 根据提供这 些酶的微生物种类数， 可以分为双酶菌法和单酶 菌法两种类型。 该法既可以直接加入细胞壁溶解 酶使细胞破壁后再使用， 也可以将所需的酶固定 化后再使用，—般由酶源菌体的培养、菌体的分离 洗涤、固定化和反应几个阶段组成。酶法能够利用 化工合成的前体物为原料， 既充分发挥了有机合 成技术的优势，又具有产物浓度高、收率高、纯度 高、副产物少、精制操作容易的优点，是—种成本 较低的生产 L-色氨酸的工业化生产方法。L-色氨 酸的酶法生产途径主要有四条工艺路线：
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L-色氨酸工业化技术研究进展
焦庆才 赵根海 刘均忠 刘 茜 （南京大学生命科学学院 医药生物技术国家重点实验室 江苏南京 210093）
摘 要：介绍了 L-色氨酸的发酵法、化学合成法以及生物酶法等工业化技术的最新研究并作了生 产研究的展望。
关键词：L-色氨酸 工业化技术 展望
第 39 卷第 4 期 2010 年 10 月
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氮鸟嘌呤（8-AG）双重抗性，连续流加邻氨基苯甲 酸，可积累 L-色氨酸 15.6g/L。
微生物发酵法是 L-色氨酸的主要生产技术, 它提供了一种适合于大规模工业生产、 成本低廉 的生产方法。 根据料报道，目前国内生产企业 L色氨酸发酵产酸浓度 5%左右， 发酵时间 35h 左 右，饲料级产品收率 85%，医药级产品收率 70%， 糖酸转化率 20%以上。
经过多年开发研究， 色氨酸酶催化法生产 L—色氨酸的转化率获得很大提高， 生产周期大 大缩短，生产成本逐步下降。 但是，其工业应用中 依然存在一些问题，如：一为吲哚难溶于水，为操 作带来很多不便； 二为在高浓度底物下转化率不 高，由于底物本身成本很高，造成了总的生产成本 较高。 因此，如何进一步提高转化率、降低底物成 本是该方法能否工业化成功运行的关键。
1 发酵法
以葡萄糖、甘蔗糖蜜等廉价原料为碳源，利用 优良的 L-色氨酸生产菌种来生产 L-色氨酸。 对 这种方法的研究进行得比较早， 但在相当长的— 段时间内达不到工业化生产的要求。 主要原因是 从葡萄糖到 L-色氨酸的生物合成途径比较漫长， 其代谢流也比较弱，而且 L-色氨酸的合成需要多 种前体物(如 PRPP 等)，若 想 进 —步 提 高 L-色 氨 酸的积累量， 就必须设法增强合成这些前体物的 代谢流。 另—方面，L-色氨酸生物合成途径中的 调控机制比较复杂， 除了反馈抑制和反馈阻遏 这—粗调系统之外， 还存在着细调系统—弱化子
2 化学合成法
L-色 氨 酸 的 化 学 合 成 途 径 很 多 ， 主 要 有 以 吲 哚为原料及在合成过程中生成吲哚环两大类 （氨 基酸杂志，1983，4：29-33）。 但上述二种方法合成 色氨酸或合成路线长、 或需采用价格昂贵的特殊 原料、或构建吲哚环的路线反应步骤多，涉及原料 多，工艺条件较苛刻，操作难度大，而不适合大规 模工业化生产。
厂家(南京台硝生物工程有限公司)运用色氨酸酶
催 化 L-半 胱 氨 酸 和 吲 哚 合 成 L-色 氨 酸 ，10h 内
L-半胱氨酸的转化率达到 95％以上，L-色氨酸收
率 90％以上，年生产能力达到 100t 以上。
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2006 年 之 前 横 店 集 团 普 洛 医 药 科 技 有 限 公 司采用该方法进行过工业化生产， 但目前改成发 酵工艺生产 L—色氨酸。
—般化学合成法得到的氨基酸都是无光学活 性的 DL-型外消旋混合物，所以必须将其进行光 学拆分以获得 L-型氨基酸。 外消旋氨基酸拆分的 方法有物理法、化学法、酶法等，其中以酶法最有 效，能够产生光学纯度高达 100%的 L-氨基酸，目 前氨基酸拆分应用最广泛的酶是氨基酰化酶。
N- 乙 酰 -DL- 氨 基 酸 经 过 氨 基 酰 化 酶 的 水 解 得到 L-氨 基 酸 和 未 水 解 的 N-乙 酰-D-氨 基 酸 ， 这两种产物的等电点不同、溶解度不同，因而很容 易分离。 未水解的 N-乙酰-D-氨基酸经外消旋作 用后又成 DL 型， 可再进行拆分， 或者水解制备 D-型氨基酸。
使用葡萄糖作为碳源，同时添加合成 L-色氨 酸 所 需 的 前 体 物 （ 如 氨 茴 酸 、 吲 哚 、L- 丝 氨 酸 等 ）， 利用微生物的色氨酸合成酶系转化前体来合成 L-色氨酸。 这种方法同直接发酵法一样，需要解除 生物合成途径中大部分酶所受到的反馈调节，以 使 L-色氨酸能够高浓度积累。 另外，所添加的前 体物大都是抑制微生物生长的， 因此添加量不可 过高，一般采取分批少量添加的方法。 同时可以筛 选前体物的抗性突变株来提高前体物的添加量。
L-色氨酸是继蛋氨酸、赖氨酸之后的第三代 饲料添加剂， 其使用效果是赖氨酸的 3～4 倍，具 有十分广泛的使用前景,近年来在医药、化妆品、 食品、保健等行业也得到广泛的应用。世界市场色 氨酸年需求量约为万 t 以上， 每年市场增长率超 过 10%，但 现 在 全 球 范 围 生 产 量 不 足 ，因 而 该 产 品具有很好的市场前景。
在日本、美国 L-色氨酸主要应用于医药和饲 料领域。 目前国内使用的 L-色氨酸主要依赖进 口， 而过高的价格严重影响了其在饲料添加剂行 业的应用。 目前该产品的生产技术和市场主要被 日本三井化学、 美国 ADM 等几家跨国公司所垄 断,我国每年需要大量进口。 为了加快该产品的国 产化进程, 我国外经贸委曾把此项目列入鼓励外 商投资指导目录。 在工业上，L-色氨酸的生产方 式主要有以下几种方式。
1998 年，Hatakeyama 等人(US 5776740，1998) 发明了采用一步法生产 L-色氨酸的方法，即在含 有甘氨酸、甲醛、吲哚和具丝氨酸羟甲基转移酶和 色氨酸合成酶的微生物细胞水溶液中酶法合成 L-色氨酸。 目前，体内和体外的遗传操作技术已 经用于新型色氨酸产生菌的选育。
为了解决转化底物 L—丝氨酸的廉价来源问 题，2009 年南京大学与湖北新生源生物工程股份 有限公司合作开发 (中国发明专利， 200910027192．4) 以含有高浓度 L-丝氨酸的混合 氨基酸料液作为转化底物， 开发出一条具有中国 特色的高效低成本生产饲料级 L—色氨酸的工业 化新工艺。 该公司将根据现有 L-丝氨酸资源新建 一 套 年 产 饲 料 级 L—色 氨 酸 数 103t 级 工 业 化 装 置。
色氨酸合成酶+丝氨酸消旋酶 3.4 吲哚+DL-丝氨酸 → L-色氨酸
此途径已被日本三井东亚公司工业化应用， 但该途径所需两种酶 (色氨酸合成酶和丝氨酸消 旋酶)之一的丝氨酸消旋酶基因尚未被克隆，野生 菌产酶活力较低，所以该途径效率不高。
4 展望
L-色 氨 酸 工 业 化 生 产 具 有 良 好 的 市 场 前 景 。 近 年 来 ，L- 色 氨 酸 的 工 业 化 主 题 集 中 在 微 生 物 发 酵法和生物酶转化法两种方法上，两者各有利弊， 因而为不同的生产厂家所采用。 如何进一步降低 每种生产方法的成本， 提高产率是摆在科技工作 者和企业家面前的重要课题。
1ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ57 年 Greenstein 最 早 采 用 氨 基 酰 化 酶 进
对 N-乙酰-DL-氨 基 酸 进 行 不 对 称 水 解 获 得 L氨基酸，其利用猪肾中的氨基酰化酶拆分 40 种酰 化 的 DL-氨 基 酸 ， 每 种 氨 基 酸 及 其 异 构 体 产 率 60%~90%， 含 量 99%， 光 学 纯 度>95%。 此 后 ， Chibata 等比较了不同菌株酰化酶活力，发现米曲 霉菌(Aspergillus oryzae No.9)酰化酶活力最高，葡 酒色青霉菌(Penvinaceum.sp)次之，两种 酶 均 可 以 拆分芳香族酰化氨基酸， 从此氨基酰化酶不必从 动物肾脏中提取，而改由霉菌发酵产生。国内采用 米曲酶 602 或 3042 菌为酶源，也可以水解芳香族 氨基酸。 韩沾元采用药用淀粉酶中提取氨基酰化 酶 ，并 用 DEAE-葡 聚 糖 A-50 固 定 化 ，对 DL-色 氨酸进行拆分，所得 L-色氨酸产率 72%，光学纯 度 99%，N-乙酰-D-色氨酸经水解， 可得 64%的 D-色氨酸，光学纯度 99%。 廖本仁等人采用氨基 酚化酶拆分 N-乙酰-DL-色氨酸，所得 L-色氨酸 光学纯度 98.8%。 同时将 N-乙酰-D-色氨酸进行 水解，得到 D-色氨酸光学纯度 99.2%。