05-05-18邻苯三酚改进

邻苯三酚法测定超氧阴离子自由基的清除作用

1. 邻苯三酚自氧化改进：

1.1 试剂的配制

1. pH8.2 50mM Tris-HCl（含EDTA）缓冲液 500mL：

称取 3.028g Tris固体溶于250mL蒸馏水中，溶解后加入0.9542mL浓盐酸，加入0.1gEDTA后定溶到500mL，装入棕色瓶备用。

2. HCl配0.1mM 邻苯三酚：

称取62.22mg邻苯三酚（即焦性没食子酸），溶于5mL10mM HCl（吸取0.0833mL浓盐酸稀释到100mL），吸出100μL溶于10mL同样的HCl中，装入棕色瓶备用（室温一般保存3天）。

1.2 试验方法

按下表取50mM Tris-HCl缓冲液、蒸馏水、多糖，混匀后在25℃水浴保温20分钟，取出后立即加入25℃预热过0.1mM 邻苯三酚（用10mM HCl配），迅速摇匀后倒入比色杯（1cm），325nm下测OD，30秒记录一次数据。实验重复三次。抑制率AI（％）＝（A对照－A样品）×100%/A对照。

举例：

反应体系Tris-HCl

(ml)

蒸馏水或者

10mMHCl(ml) 多糖(ml)

邻苯三酚

(ml)

空白 2 1 0 0

对照 2 0.6 0 0.4

处理组1 2 0.5 0.1 0.4

处理组2 2 0.4 0.2 0.4

处理组3 2 0.3 0.3 0.4

处理组4 2 0.2 0.4 0.4

处理组5 2 0.1 0.5 0.4

注意事项：

1．多糖母液浓度最好选在1~2mg/ml

2．邻苯三酚一般现用现配，放置一般放3天，

3．A325nm/分的读数一般为0.7~1之间，实验系统才比较准确，

4．用蒸馏水代替HCl配制邻苯三酚是可以的，只是放置时间不能太长

2. 试验结果

2.1 虎乃菇水提多糖对超氧阴离子自由基的清除作用

从图21和表26实验结果看，虎乃菇水提多糖对超氧阴离子自由基有清除作用，且清除作用的大小随多糖浓度增加而增加，表现出一定的线性关系。分别加入100μL、200μL、300μL、400μL、500μL多糖后，对超氧阴离子的清除率分别为14.167%、34.286%、54.762%、70.592%、85.714%。从方差分析可知，虎乃菇水提多糖的清除作用的影响则十分显著。

图21 虎乃菇水提多糖对超氧阴离子自由基的清除作用表26 虎乃菇水提多糖对超氧阴离子自由基的清除作用

实验数实验中多糖的

量（μL）

多糖浓度

（mg/mL)

平均OD值（已去底色）

平均清除率（%）

A0 A5

空白对照0 0 0.05 0.47 0

实验组1 100 0.047 0.163 0.524 14.167±2.943 实验组2 200 0.093 0.158 0.434 34.286±0.558 实验组3 300 0.14 0.147 0.337 54.762±2.75 实验组4 400 0.187 0.152 0.274 70.592±0.069 实验组5 500 0.233 0.164 0.224 85.714±1.225 表27 虎乃菇水提多糖对超氧阴离子自由基的清除作用方差分析

变异来源Source 平方和

SS

自由度

df

均方和

MS

统计量

F

P值

Sig F 0.05 F 0.01

组间9746.517 4 2436.629 675.602 4.07E-12 3.478 5.994 组内36.066 10 3.606

总计9782.583 14

2.2 虎乃菇碱提多糖对超氧阴离子自由基的清除作用

从图21和表26实验结果看，虎乃菇水提多糖对超氧阴离子自由基有清除作用，且清除作用的大小随多糖浓度增加而增加，表现出一定的线性关系。分别加入100μL、200μL、300μL、400μL、500μL多糖后，对超氧阴离子的清除率分别为12.353%、30.321%、47.846%、73.251%、84.094%。从方差分析可知，虎乃菇水提多糖的清除作用的影响则十分显著。

图21 虎乃菇碱提多糖对超氧阴离子自由基的清除作用

表26 虎乃菇碱提多糖对超氧阴离子自由基的清除作用

实验数实验中多糖的

量（μL）

多糖浓度

（ mg/mL)

平均OD值（已去底色）

平均清除率（%）

A0 A5

空白对照0 0 0.075 0.418 0

实验组1 50 0.074 0.199 0.498 12.353±3.238 实验组2 100 0.149 0.180 0.417 30.321±0.073 实验组3 150 0.223 0.209 0.386 47.846±3.122 实验组4 200 0.298 0.203 0.295 73.251±3.914 实验组5 250 0.372 0.204 0.258 84.094±0.945

表27 虎乃菇碱提多糖对超氧阴离子自由基的清除作用方差分析

变异来源Source 平方和

SS

自由度

df

均方和

MS

统计量

F

P值

Sig F 0.05 F 0.01

组间10533.9 4 2633.474 361.333 9.14E-11 3.478 5.994 组内72.882 10 7.288

总计10606.78 14

3. 结果分析

对比虎乃菇水提和碱提多糖对超氧阴离子自由基的清除作用结果，发现在相同浓度下虎乃菇水提多糖对超氧阴离子自由基的清除作用比虎乃菇碱提多糖对超氧阴离子自由基的清除作用有更好的清除作用，，虎乃菇碱提多糖在终浓度为0.223mg/mL时的清除率有47.846%，而虎乃菇水提多糖在终浓度为0.233mg/mL时的清除率有85.714%。

碱提多糖终浓度（ mg/mL）抑制率

（%）

水提多糖终浓度

（ mg/mL）

抑制率

（%）

0.074 12.353 0.047 14.167 0.149 30.321 0.093 34.286 0.223 47.846 0.14 54.762 0.298 73.251 0.187 70.952 0.372 84.094 0.233 85.714