基因工程概论

二.揭示了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机 理，解决了基因的自我复制和传递的问题。 1953年James D. Watson和Francis H. C. Crick揭 示了DNA分子的双螺旋结构和半保留复制机制。
三.提出了“中心法则”和操纵子学说，并成功地破译 了遗传密码，从而阐明了遗传信息的流向和表达问题
第一章
绪 论
第一节 基因工程诞生的理论基础 一.确定了遗传信息的携带者是DNA而不是蛋白 质。明确了遗传的物质基础问题 1. 肺炎双球菌转化实验
1944年 Avery，确定了基因的分子载体是DNA， 而不是蛋白质。
2. 噬菌体转染实验 1952年Alfred Hershy和Marsha Chase进一步 证明遗传物质是DNA
4. 毒性方面，如蛋白酶抑制剂，溶血剂，神经毒素 许多食品原料生物本身会产生大量的毒性物质，如蛋白 酶抑制剂、溶血剂和神经毒素等，那么转基因作物中是否有 毒素以及毒素的含量就成为争议的重要内容之一 5. 伦理方面
许多民族都有其独特的饮食习惯和制约，某些宗教团体 禁止食用的动物基因转入他们通常食用的动物中（如将猪的 基因转入绵羊中），这可能触犯某些民族的饮食戒律；另外 将动物基因转入植物中可能使素食者感到困惑。
根据“实质等同性”原则，转基因食品安全性分成三个等级： I级，转基因食品成分、营养价值、体内代谢途径、杂质水平 和传统食品相同，或变异在已知的范围内，这类食品无需做 进一步的分析评价； Ⅱ级，与传统食品极其相似，但产生或缺少某个新成分或特 性，对不同成分或特性应作进一步的分析评价； Ⅲ级，与传统食品既不相同也不相似，需要作广泛的营养学 和毒理学评价。
2000年，人和拟南芥测序完成
第四节 基因工程的定义及其主要的研究内容
一.基因工程的诞生 1. Berg的开创性实验
1972年斯坦福大学的Paul Berg小组完成了首次体外重 组实验：将SV40的DNA片断与噬菌体的DNA片断连 接起来(用DNA末端转移酶，而非限制性内切酶)。
2. Boyer-Cohen实验 1973年斯坦福大学的S. Cohen小组将含有卡那霉素抗性基因的 大肠杆菌R6-5质粒与含有四环素抗性基因的另一种大肠杆菌质 粒pSC101连接成重组质粒，具有双重抗药性。 后来又把非洲爪蟾核糖体基因片断同pSC101质粒重组，转化大 肠杆菌，并在菌体内成功转录出相应的mRNA。这是第一次成 功的基因克隆实验。
Werner Arber 理论预见限制酶
1968年H.O. Smith等分离出第一种限制性核酸内切酶 Daniel Nathans 用限制酶切得SV40 DNA片断 3人于1978年获得Nobel生理或医学奖 2. DNA连接酶（ligase）
1967年5个实验室几乎同时发现了DNA连接酶
二. DNA分子的核苷酸序列分析 1975年F. Sanger、A. Maxam和W. Gilbert发明了DNA快速测 序技术, 1980年Nobel化学奖
基因克隆（gene cloning）， 分子克隆（molecular cloning）
4. Clone(名词)：是指从一个共同祖先无性繁殖下来的一 群遗传上同一的DNA分子细胞或个体所组成的特殊的生 命群体 Clone(动词)：是产生一个遗传上同一的DNA分子细胞 或个体所组成的特殊的生命群体的过程
三.载体的构建 1972年前后使用小分子量的细菌质粒和噬菌体作载体。在 细菌细胞里的大量扩增
四.转化技术 1970年M. Mandel和A. Higa发现经过氯化钙处理的大肠杆菌 容易吸收噬菌体DNA。1972年S. Cohen发现这种处理过的细菌同 样能吸收质粒DNA
五.琼脂糖凝胶电泳和southern转移杂交技术 1960s发明了琼脂糖凝胶电泳，可将不同长度的DNA分 离开;DNA印迹技术由Southern于1975创建,称为Southern 印迹技术
6. 其他 除以上争论外，对转基因食品安全性的争议还表现在 微生物作为宿主细胞的安全性问题，转基因动物激素、食 品、饲料添加剂等对动物本身的生长、发育和繁殖的安全 性问题等方面。 基于上述诸多方面的异议，转基因食品的安全性问题 的研究成为转基因技术研究的一个热点。
所以关于GMO（genetic modified origanism）的争论主 要集中于安全性，宗教，贸易
5.研究内容 (1)目的基因的获取
从复杂的生物基因组中，经过酶切消化或PCR扩增等步 骤，分离出带有目的基因的DNA片断
(2)重组体的制备 将目的基因的DNA片断插入到能自我复制并带有选择性 标记（抗菌素抗性）的载体分子上
(3)重组体的转化 将重组体（载体）转入适当的受体细胞中 (4)克隆鉴定 挑选转化成功的细胞克隆（含有目的基因）
2.特征 (1)按照人们的主观愿望进行设计 (2)跨越物种屏障
外源基因到另一种不同的生物细胞内进行繁殖
(3)无性扩增 外源DNA在寄主细胞内可大量扩增，和高水平表达
3.基因工程（gene engineering）相关的概念： 基因操作（gene manipulation），
重组DNA技术（recombinant DNA technique），
1.实验室的物理安全
P1——P4是关于基因工程实验室物理安全防护上的装备规定。 P1级实验室为一般的装备良好的普通微生物实验室；
P2级实验室，在P1级实验室的基础上，还需装备负压的安全 操作柜；
P3级实验室，即全负压的实验室，同时还要装备安全操作柜； P4级实验室是具有最高安全防护措施的实验室，要求建设专 用的实验大楼，周围与其它建筑物之间应留有一定距离的隔 离带，细菌操作带手套进行，以及使用其他必要的隔离装置， 使研究者不会直接同细菌接触。 P=Protect
1961年，马太(Matthaei)和尼伦伯格(Nirenberg)破译了第 一批密码子， F.Jacob和J.Monod提出了操纵子模型
1962年，Arber等人发现限制性内切酶 1968年, Smith和wilcox在流感嗜血杆菌中分离并纯化了限制 性内切酶Hind III 1967-1968年，发现了DNA连接酶，建立了DNA序列分析方法 1972年，得到了第一个重组的DNA分子 1973年，完成了第一个细菌基因的克隆
（2）转基因食品的食用安全性 转基因食品与相应的传统食品相比，至少存在以下两个 不同点：一是转基因食品中含有利用转基因技术导入的外源 基因，而传统的食品中不含有；二是由于外源基因的表达使 转基因食品中含有了特定的外源基因表达产物(相应的蛋白 质）。
A.外源基因的毒性及其水平转移问题 转基因食品中外源基因含量很小，其化学组成与普通 DNA并无差异。通过食用转基因食品而摄入体内的外源基因 的数量与消化道中来源于其他食品中的DNA数量相比微不足 道。因此，转基因食品中的外源基因本身不会对人体产生直接 毒害作用。
第三节 基因工程发展史上的某些重要事件 1869年，F.Miescher首次从莱茵河鲑鱼精子中分离到DNA 1944年，O.T.Avery等人在肺炎链球菌转化实验中发现遗传 信息的携带者是DNA，而不是蛋白质 1952年， A.D. Hershey和M.Chase 再次证明T2噬菌体的 遗传物质是DNA 1953年，J.D.Watson和F.H.C.Crick 提出双螺旋结构模型 1958年, Meselson米西尔森和Stanl斯坦尔提出了DNA半 保留复制模型
四.转基因生物安全性评价 对转基因生物安全评价主要集中在环境安全性和食用安 全性两个方面。
1.环境安全性评价
环境安全性评价的核心问题是转基因生物是否会将所转 基因再转移到其它生物中，会不会破坏生态环境，打破原有 生物种群的动态平衡，
包括：
①转基因作物本身成为杂草的可能性； ②转基因作物便亲缘野生种成为杂草或超级杂草的可能 性； ③转基因作物可能产生新的病毒或疾病； ④转基因作物对非目标生物的危害； ⑤转基因作物作为外来种对新环境的入侵，使生物多样 性受到威胁； ⑥转基因作物对生态系统及生态过程的影响； ⑦其他一些不可预计的风险。
2.食用安全性评价 食用安全性，主要包括营养成分、抗营养因、毒性和致敏 性等。目前普遍公认的食用安全性评价的原则是经合组织 （OECD）1993年提出的“实质等同性”（Substantial equivalence）原则。
（1）实质等同性原则 实质等同性原则最早由国际经济互助开发组织于1993年提出 并已被大多数国家采用。该原则认为如果导入基因后产生的 蛋白质经确认是安全的，或者是转基因作物和原作物在主要 营养成分（脂肪、蛋白质、碳水化合物等）、形态和是否产 生抗营养因子、毒性物质、过敏性蛋白等方面没有发生特殊 的变化的话，则可以认为转基因作物在安全性上和原作物是 同等的，对人类的影响是相似的，则无需对它的安全性再作 进一步的分析。
Boyer-Cohen实验
Stanley Cohen
Herb Boyer
1986 Nobel生理或医学奖
二.基因工程的定义和特征 1. 定义
在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其它载体分子，构建 遗传物质的新组合，并使之渗入到原先没有这类分子的寄 生细胞内，而能持续稳定地繁殖 在体外对不同生物的遗传物质（基因）进行剪切、重组、 连接，然后插入到载体分子中（细菌质粒、病毒或噬菌体 DNA)，转入微生物、植物或动物细胞内进行无性繁殖， 并表达出基因产物
2.实验室的生物安全 生物防护方面，EK1——EK3级是专门针对大肠杆菌而规定 的安全防护标准。它是依据大肠杆菌在自然环境中的存活率为 前提制定的。 EK1 级大肠杆菌菌株，在自然环境中一般都要死 亡。而符合 2-3 级标准的大肠杆菌菌株，在自然环境中则是无 法存活的。
第一个安全的大肠杆菌是K12菌株，由于不适用于操作， 目前广泛应用的是K12的派生菌株。
2. 标记基因的传递可能引起的抗生素耐性 基因工程技术中应用的标记基因通常是一类抗生素基因， 人们担心食用含有此类标记基因的食品后，是否对肠道微生 物产生影响或者抗生素类药物产生耐药性。 3. 转基因食品引起的食物过敏的可能性 转基因食品引起食物过敏的可能性是人们关注的焦点之 一。特别是如果转基因食品转入的蛋白质是新蛋白时，这些 异种蛋白有可能引起食物过敏。