单克隆抗体制备注意事项
单克隆抗体(McAb)制备注意事项
单克隆抗体(McAb)制备注意事项(一) 免疫动物的选择用于免疫的动物，应选择与亲本骨髓瘤细胞同一品系的动物，因为免疫动物品系和骨髓瘤细胞种系越远，融合的杂交瘤细胞越易发生免疫排斥反应，越不稳定。
目前使用的瘤细胞系，仍限于小鼠和大鼠的骨髓瘤细胞系，其中多来源于纯系BALB/c小鼠，所以要选择该系小鼠用作免疫动物，一般认为，为了减少盲目性，融合前，应测定免疫小鼠的抗体反应性，如果呈阳性，可供融合用，那些对特定抗原不产生血清抗体的小鼠，得不到特异的杂交瘤细胞。
一般选择8～12周龄，重约20g，健康无病的纯系小鼠，雌雄均可应用。
(二) 免疫方案1 抗原免疫用的抗原尽量设法提高其纯度，并保存其活性。
同样浓度的抗原，若含有较多的杂质，会明显影响抗体的产生，并为杂交瘤细胞分泌抗体的筛选带来麻烦，获得所需的分泌特异抗体的杂交瘤细胞的机率也低。
2 免疫小鼠一次免疫务必同时免疫几只小鼠，以免小鼠中途死亡。
每次注入抗原后，次日，小鼠会出现全身反应，体温升高、盗汗、耸毛等，此时对室温和饲养均需注意，以防小鼠死亡。
在融合前末次静注或腹腔注射时，谨防速发型过敏反应发生，而导致小鼠死亡。
3 不同抗原的免疫方法可溶性抗原，在初次免疫用明矾沉淀抗原100μg与2×109灭活百日咳杆菌混合皮下注射，间隔4～6周，用盐水抗原100～200μg 加强免疫，3天后取脾作融合；细胞抗原免疫，用2×107个细胞注入小鼠腹腔，间隔2～3周，再重复一次，3周后用同样数量细胞注入小鼠腹腔，3天后取脾作融合。
除上述常规免疫方法外，近年来还建立了脾内免疫法及体外细胞免疫法。
脾内免疫是将抗原直接注入小鼠的脾脏，具有抗原用量小及免疫周期短的优点；体外细胞免疫，是将抗原加入于体外培养的淋巴细胞中，使之形成免疫细胞。
(三) 融合剂PEG对细胞有毒性，一般采用分析纯规格。
浓度越高，对细胞的毒性越大。
以40%～50%的浓度为宜，pH值以80～82促融率最高。
单克隆抗体制备及抗体保存
单克隆抗体制备及抗体保存一、单克隆抗体制备单克隆抗体是由单一B细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体，通常采用杂交瘤技术来制备，杂交瘤抗体技术是在细胞融合技术的基础上，将具有分泌特异性抗体能力的致敏B细胞和具有无限增殖能力的骨髓瘤细胞融合为既能稳定生长又能产生抗体的杂交瘤细胞。
单克隆抗体具有理化性状高度均一（纯度高、有效抗体含量高）、生物活性单一、与抗原结合特异性强、来源容易、制备成本低等优点，并且可用于疾病的诊断和治疗。
（1）单克隆抗体制备原理：抗体主要由B淋巴细胞合成。
每个B淋巴细胞有合成一种抗体的遗传基因。
动物脾脏有上百万种不同的B 淋巴细胞系，含遗传基因不同的B淋巴细胞可以合成不同的抗体。
当机体受外界抗原刺激后，可诱发免疫反应，产生相应的抗体，即单克隆抗体。
B淋巴细胞能够产生抗体，但在体外不能进行无限分裂；肿瘤细胞在体外培养的条件下可以无限传代，是“永久”的细胞，但不能产生抗体。
因此将骨髓瘤细胞与经免疫过的小鼠的脾细胞在聚乙二醇等介导下发生融合，融合后的杂交瘤细胞具有两种亲本细胞的特性，一方面可以分泌特定的抗体，另一方面也具备了肿瘤细胞无限增殖的能力，可在体外培养条件下或移植到体内无限增殖，从而分泌大量单克隆抗体。
（2）单克隆抗体制备流程：1、免疫动物免疫动物是用目的抗原免疫小鼠，使小鼠产生致敏B淋巴细胞的过程。
一般选用6-8周龄Balb/c健康雌性小鼠，按照预先指定的免疫方案进行免疫注射。
抗原通过血液循环或淋巴循环进入外周免疫器官，刺激相应B 淋巴细胞克隆，使其活化、增殖，并分化成为致敏B淋巴细胞。
２、脾细胞的准备➢拉颈处死小鼠➢无菌操作取出脾脏➢清洗研磨，收集细胞➢离心洗涤➢细胞计数３、骨髓瘤细胞的准备➢收集细胞➢离心洗涤➢活细胞计数➢调整细胞浓度４、细胞融合➢骨髓瘤细胞与脾细胞按一定比例混合1：10或1：5。
➢加入50% PEG促融剂（在PEG作用下B淋巴细胞可与骨髓瘤细胞发生融合，形成杂交瘤细胞）。
单克隆抗体制备步骤及注意事项
单克隆抗体制备步骤及注意事项单克隆抗体（Monoclonal antibody，mAb）是指由单一B细胞克隆分离得到的抗体，其具有高特异性和高亲和力。
制备单克隆抗体的方法主要有杂交瘤技术和重组DNA技术。
以下是单克隆抗体制备的步骤及注意事项。
步骤一：抗原免疫1.选择合适的抗原：根据需要检测的分子或细胞表面标志物，选择合适的抗原。
2.免疫动物：常用的动物有小鼠、兔子等。
选择适合的动物后，根据抗原的种类和免疫动物对该抗原的敏感性，设计免疫方案。
3.免疫计划：免疫计划包括免疫剂量、免疫途径和免疫次数等。
通常先进行原位免疫，然后再以单体或混合抗原进行体内免疫。
步骤二：细胞融合1.收集脾细胞：在最佳时期，解剖免疫动物，取出脾脏。
2.细胞培养：将收集的脾细胞在无菌条件下分散成单个细胞，并在培养基中培养，以供细胞融合使用。
3.准备骨髓瘤细胞：选择合适的骨髓瘤细胞，例如NS0或SP2/0等。
将其培养至对数生长期。
4.细胞融合：在抗原刺激下，将脾细胞与骨髓瘤细胞以一定比例混合，用聚乙烯醇或其他化合物促进细胞融合。
步骤三：细胞筛选与扩展1. HT增重培养：用含有hprt缺陷的培养基筛选融合细胞，以选择杂交瘤细胞。
2. Limited Dilution扩展：以一细胞一孔的方式将杂交瘤细胞进行有限稀释，使其实现单克隆化。
3.细胞培养：将单克隆细胞株移植到培养瓶中，进行培养和扩增。
步骤四：单克隆抗体鉴定1.酶联免疫吸附试验（ELISA）：用ELISA方法筛选单克隆细胞株，检测其抗原特异性。
2.免疫组织化学检测：将单克隆抗体应用于细胞和组织切片，检测其在特定细胞或组织中的反应。
3.流式细胞术：通过流式细胞仪检测单克隆抗体与特定细胞表面标志物的结合情况。
步骤五：单克隆抗体生产与纯化1.细胞培养：将单克隆细胞株培养扩增至一定程度。
2.抗体收集：将培养上清液进行抗体收集。
3.纯化与浓缩：利用亲和层析、离子交换、凝胶过滤等技术，对抗体进行纯化和浓缩。
单抗配制过程护士要注意事项_概述说明
单抗配制过程护士要注意事项概述说明1. 引言1.1 概述本文旨在概述单抗配制过程中护士需要注意的事项。
随着单克隆抗体治疗的普及，单抗配制成为了临床工作中不可或缺的环节。
正确而规范地完成单抗配制过程对于确保治疗效果、保证患者安全至关重要。
因此，本文将介绍在单抗配制过程中，护士应该关注和遵循的几个主要方面。
1.2 文章结构本文按以下几个部分进行阐述：引言、单抗配制过程护士要注意事项、警示和风险提示、术语解释与常见问题解答以及结论。
通过这些部分的详细介绍，读者将能够全面了解在单抗配制过程中所需遵循的步骤、注意事项和相关知识。
1.3 目的本文旨在提供给从事临床工作的医务人员参考，特别是与单克隆抗体治疗有关的护士。
通过详细描述单抗配制过程中需要注意和遵循的各个方面，我们的目标是帮助他们更好地理解并正确执行单抗配制工作，提高临床操作的准确性和安全性。
以上为“1. 引言”部分内容。
2. 单抗配制过程护士要注意事项:2.1 确认患者信息和医嘱:在开始单抗配制之前，护士必须仔细核对患者的个人信息，包括姓名、年龄、性别等，并与医嘱进行一致性确认。
确保所使用的单抗是给予正确的患者，并且符合医生指示。
2.2 准备工作环境和材料:在开始单抗配制之前，护士需要确保工作环境整洁无菌。
清理工作台面并使用消毒剂对其进行消毒。
同时，检查所有所需材料是否齐全并处于有效期内，包括注射器、针头、试剂、溶剂等。
2.3 配置单抗的步骤与规范操作:以下是配置单抗的步骤和规范操作：1) 准备好所有需要用到的药物及溶液。
2) 戴上手套和口罩以确保个人卫生，并避免污染药品。
3) 按照医嘱中规定的剂量准确称量所需药物。
4) 将溶剂转移到药品瓶中，并轻轻摇动使其充分溶解。
5) 将药品抽取并注入空白的注射器中。
6) 顺利进行专用贴纸（标签）的填写以确保能够识别瓶上的药物信息。
7) 在专门的装满可回收容器中丢弃废弃物和使用过的药品容器。
请注意，以上步骤只是一个基本的示例，并且应根据实际情况和医生指示进行调整。
单克隆抗体的制备流程
单克隆抗体的制备流程
一、抗体cDNA克隆
2、结合分离：抗体和抗原之间采用免疫学方法，进行亲和结合分离，在病理学中，可以采用细胞亲和免疫电泳或者细胞色素紧缩技术来进行识
别性结合分离抗体。
3、mRNA提取：使用RNAsy Plus Kit根据操作说明提取亲和结合分
离后的抗体的mRNA，用于cDNA合成。
4、cDNA合成：使用双链cDNA合成试剂盒，根据说明书操作，将mRNA合成双链cDNA。
5、克隆：将双链cDNA进行克隆，经过构建的一系列步骤，最终将cDNA克隆到载体上，构建出抗体cDNA克隆库。
二、抗体cDNA克隆抗体制备
1、选择克隆体：选择抗体cDNA克隆库中的抗体表达克隆，采用PCR
技术进行选择，并检测克隆体具有良好的免疫特性，可以快速确定最佳克
隆体。
2、表达载体构建：将最佳克隆体插入到表达载体中，构建出属于克
隆体的表达载体，以此保证克隆体的正确表达。
3、表达系统筛选：利用多种表达系统，筛选出最佳的表达系统，以
此来达到最佳的表达效果。
4、表达调控：对于最佳的表达系统，根据cDNA克隆体的特性，进行
最佳的表达调控，以此达到最佳的抗体表达效果。
单克隆抗体制备步骤及注意事项
单克隆抗体制备步骤及注意事项一、脾细胞的准备：1.将Balb/c小鼠拉颈脱臼处死，浸泡于75%酒精3～5min。
无菌操作取出脾脏，置于盛有5mL不完全培养液的平皿中，洗涤3次去除脾脏表面的脂肪和结缔组织。
2.将洗好的脾脏用剪刀剪成3～5个小块，然后将脾脏研碎，过细胞筛，收集细胞。
3.将脾脏细胞悬液在1000r/min条件下，离心5min，弃上清。
再以同样的方法洗涤离心一次。
4.将沉淀细胞重新悬浮于10mL不完全培养液中，计活细胞数，取108个脾淋巴细胞悬液备用。
注意事项：➢免疫脾细胞一般取最后一次加强免疫3天以后的脾脏，制备成细胞悬液，因为此时B淋巴母细胞比例较大，融合的成功率较高。
二、骨髓瘤细胞的准备：1.选好骨髓瘤细胞株，取体外培养对数生长期细胞或体内生长的肿瘤分离骨髓瘤细胞。
2.取对数生长骨髓瘤细胞离心，用无血清培养液洗2次。
3.制备细胞悬液，计活细胞数。
4.调整细胞浓度，取107细胞悬液备用。
注意事项：➢常用的骨髓瘤细胞系有：NS1、SP2/0、X63、Ag8.653等。
➢骨髓瘤细胞系应和免疫动物属于同一品系，这样杂交融合率高，也便于接种杂交瘤细胞在同一品系小鼠腹腔内生产大量McAb。
➢骨髓瘤细胞的培养适合于一般的培养液，如RPMI-1640基础培养液，DMEM培养基。
小牛血清的浓度一般在10～20%。
细胞的最大密度不得超过106个/mL。
➢一般扩大培养以1:10稀释传代，每3～5天传代一次。
细胞的倍增时间为16～20小时。
➢一般准备融合前的两周就应开始复苏骨髓瘤细胞，为确保该细胞对HA T的敏感性，每3～6个月应用8～AG（8氮杂鸟嘌呤）筛选一次，以防止细胞的突变。
➢保证骨髓瘤细胞处于对数生长期，良好的形态，活细胞计数高于95%，也是决定细胞融合的关键。
三、细胞融合：1.将骨髓瘤细胞与脾细胞按1:10 或1:5的比例混合，加入20～50mL RPMI-1640培养液。
2.在1000r/min条件下离心8min，弃上清，用滴管轻轻吸净残留液体。
单克隆抗体的制备方法与应用
单克隆抗体的制备方法与应用一、前言单克隆抗体是指一种具有高度特异性和亲和力的抗体，其来源于单个B细胞克隆。
相比多克隆抗体，单克隆抗体更加纯净、稳定和可靠，因此在生物医学研究、诊断和治疗等方面有着广泛的应用。
本文将介绍单克隆抗体的制备方法与应用。
二、单克隆抗体的制备方法1. 免疫动物首先需要选取适当的动物进行免疫，通常选择小鼠或大鼠。
在进行免疫前需要对动物进行预处理，例如注射低剂量的抗生素来消除潜在的感染。
2. 免疫原选择选择合适的免疫原是制备单克隆抗体的关键步骤。
常见的选择包括蛋白质、多肽、细胞表面分子等。
在选择时需要考虑到其特异性、稳定性和可重复性等因素。
3. 免疫程序在进行免疫前需要对动物进行预处理，例如注射低剂量的抗生素来消除潜在的感染。
接着，将免疫原注射到动物体内，通常需要多次免疫以增强免疫效果。
在免疫过程中需要对动物进行监测，例如采集血样检测抗体水平。
4. 融合细胞的制备在获得足够的抗体后，需要从动物体内采集B细胞并与骨髓瘤细胞进行融合。
常用的骨髓瘤细胞包括SP2/0和NS0等。
5. 单克隆抗体筛选通过限稀法或单一细胞分离法等方法将融合细胞分离为单个克隆，并通过ELISA、免疫印迹等方法筛选出特异性较高的单克隆抗体。
接着对筛选出的单克隆抗体进行扩增和纯化等处理。
三、单克隆抗体的应用1. 生物医学研究单克隆抗体在生物医学研究中有着广泛的应用，例如作为特定蛋白质或分子的检测工具、用于药物开发和治疗等。
2. 诊断单克隆抗体在诊断方面也有着重要的应用，例如用于肿瘤标志物的检测、病原体的检测等。
3. 治疗单克隆抗体在治疗方面也有着广泛的应用，例如用于治疗癌症、自身免疫性疾病等。
其中一些单克隆抗体已经被批准为药物并用于临床治疗。
四、总结单克隆抗体是一种具有高度特异性和亲和力的抗体，在生物医学领域中有着广泛的应用。
其制备方法包括适当动物选择、合适免疫原选择、多次免疫程序、融合细胞制备和单克隆抗体筛选等步骤。
单克隆抗体制备操作方法及注意事项JEN
单克隆抗体制备操作方法及注意事项JEN无菌室清洁要求：1、进入无菌间，须更换白大褂，口罩、鞋套必须戴上，最好戴上帽子、手套；2、进去后用酒精棉球擦洗手；3、生物安全柜常见酒精棉球擦洗，擦后棉球不显黑；柜内垃圾当日及时清理；柜内所有实验操作应在酒精灯前进行；经常紫外杀菌；4、无菌间物件传递，经窗口紫外照射方可；5、有关试剂使用后及时用封口膜封住；6、细胞培养盖子旋松，以便二氧化碳气体进入；拿瓶、加液体均需注意瓶口，避免污染瓶盖；7、出门后需要用钥匙锁上；8、整个无菌间两周清洁一次；免疫动物：选择与瘤细胞同一品系的动物做为免疫对象，现在常见的是Balbc/c小鼠，6-8周龄，一种抗原一次性注射2-3只小鼠，小鼠不宜过大，雌性相对较好；首次注射抗原100微克与等体积弗氏完全佐剂混匀，在背部两侧皮下与腹腔分别注射，形成几个小泡；间隔两周左右时间（14天）二次免疫注射抗原50微克与等体积弗氏不完全佐剂混匀，在背部皮下及腹腔分别注射，一般上次背部小泡依然存在；间隔两周左右时间（14天）三免小鼠注射抗原50微克与等体积弗氏不完全佐剂混匀，在背部皮下及腹腔分别注射，一般上次背部小泡依然存在；间隔7-10天左右时间尾部采血测定抗体效价：方法一：手拇指和食指从背部抓住小鼠颈部皮肤，将小鼠头朝下，小鼠保定后将其尾巴置于50°热水中浸泡数分钟，使尾部血管充盈。
擦干尾部，再用剪刀或刀片剪去尾尖1～2mm，用试管接流出的血液，同时自尾根部向尾尖按摩。
取血后用棉球压迫止血并用6%液体火棉胶涂在伤口处止血。
每次采血量0.1ml。
方法二：固定小鼠，一人捏住小鼠耳朵固定小鼠，同时抓住尾梢协助取血，另一个人左手捏住小鼠尾巴根部，右手用酒精棉球擦洗，使尾部血管充盈，食指抵住尾巴，用一次性1ml注射器穿刺血管，用10微升移液枪及时吸取全血2.5微升，加在盛有97.5微升的PBS缓冲液中稀释10倍，再稀释一百倍，之后做倍比稀释测定效价，读数到阴性血清值的 2.1倍，合理效价应高于12.8万倍。
单克隆抗体制备流程
单克隆抗体制备流程一、免疫准备1）试剂：弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂2）常用免疫原：纯化蛋白、融合蛋白、多肽。
3）耗材：1ml、2ml注射器，橡胶管，1.5ml EP管，刀片（或毛细玻璃管），酒精棉球。
4）免疫动物：小鼠（BALB/c,雌性6-8周）5）乳化器（或者手动推）二、免疫过程1）免疫前取血取血方式：酒精棉擦拭尾部后（酒精多了伤口挤压出来的血液易分散），用锋利的刀片在小鼠尾部靠近静脉处划开小口，如下图箭头所示方向从上往下挤压血管，血从伤口处流出后用枪吸取放入EP管中（30ul血够用）离心取上清放冰箱备用。
此方法取血最为简单易行，避免眼球取血毛细管扎瞎老鼠眼睛。
注意点：①避免切断老鼠尾巴②切口劲量靠近尾末端，方便挤压血管③伤口消毒酒精不要太多，不利于伤口血液凝固。
2）免疫原制备：一支2ml注射器吸抗原，另一支注射器吸等量体积佐剂，橡胶管连接两支注射器来回推几下混匀，然后放乳化器上乳化（为防止蛋白变性，乳化器上可放置冰袋），大约来回推1500次左右可乳化完全（滴一小滴到静水中若不扩散说明乳化完全）。
换上1ml注射器针头免疫小鼠（2ml注射器免疫不好控制，可将乳化液转移到1ml注射器中免疫，但这样会损失部分抗原）。
注：①每只老鼠免疫蛋白量10-100ug,初次免疫参考量50ug蛋白/只，加强免疫及融合前冲击免疫25ug蛋白/只。
初次免疫使用弗氏完全佐剂，加强免疫使用弗氏不完全佐剂，融合前冲击免疫不使用佐剂可用缓冲液如PBS等稀释抗原（如果需要）。
②免疫量100ul-300ul/每只小鼠。
③多点免疫，一针不要打太多。
3）免疫方式和免疫时间根据免疫原决定免疫方式，皮下免疫和腹腔注射较为常见(纯化蛋白、融合蛋白多肽)。
皮下注射免疫，免疫时间间隔为2周，第三次免疫一周后（8-10d）采血测效价，决定是继续加强免疫还是冲击免疫后做融合。
较好的效价应该在10W以上，附表1 免疫接种时间表天数操作佐剂免疫方式0 初次免疫CFA 皮下14 第二次免疫IFA 皮下28 第三次免疫IFA 皮下36-38 收集血清测效价＿＿42 第四次免疫（如果需要）IFA 皮下50 收集血清测效价＿＿52 融合前冲击免疫＿腹腔55 收获脾细胞和融合＿＿注：如果第四面免疫血清效价仍然达不到要求可以继续加强免疫，如果免疫超过6次仍然达不到要求免疫基本失败。
单克隆抗体
单克隆抗体技术【原理及意义】单克隆抗体技术(The technique of monoclonal antibody)是由Kǒhler与Milstein于1975年创立的。
他们发现将小鼠骨髓瘤细胞与绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合,形成的杂交细胞既可产生抗体,又可无限增殖,从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。
单克隆抗体(monoclonal antibody,M cAb)具有结构均一、纯度高、特异性强、效价高、交叉反应少或无等优点,缺点是其鼠源性对人具有较强的免疫原性,反复人体使用后可诱导产生人抗鼠的免疫应答,从而削弱其作用,甚至导致免疫病理损伤。
制备单克隆抗体包括动物免疫、细胞融合、选择杂交瘤、检测抗体、杂交瘤细胞的克隆化、冻存以及单克隆抗体的大量生产等一系列实验步骤。
下面按照制备单克隆抗体的流程顺序,逐一介绍其实验方法。
一、细胞融合前的准备(一)免疫方案选择合适的免疫方案对于细胞融合的成功,获得高质量的M cAb 至关重要。
一般要在融合前两个月左右确立免疫方案开始初次免疫,免疫方案应根据抗原的特性而定。
1.颗粒性抗原免疫性较强,不加佐剂就可获得很好的免疫效果。
下面以细胞性抗原为例:免疫细胞数为每只小鼠1×107/0.5 m L生理盐水,腹腔注射。
1)初次免疫,间隔2～3周。
2)第二次免疫,间隔3周。
3)第三次免疫10天后,取血测效价。
4)加强免疫3天后,取脾融合。
2.可溶性抗原免疫原性弱,一般要加佐剂。
将抗原与佐剂等体积混合在一起,研磨成油包水的乳糜状(放一滴在水面上不易马上扩散呈小滴状表明已达到油包水的状态)。
1)初次免疫,Ag5～50微克/只,加弗氏完全佐剂皮下多点注射,一般0.2毫升/点,间隔3周。
2)第二次免疫,剂量途径同上,加弗氏不完全佐剂,间隔3周。
3)第三次免疫,剂量同上,不加佐剂,于生理盐水中腹腔注射,7～10天后采血测其效价,检测免疫效果,间隔2～3周。
4)加强免疫,剂量50μg为宜,腹腔或静脉注射。
单克隆抗体的制备(详细材料)之欧阳美创编
单克隆抗体的研制一、单克隆抗体的概念抗体是机体在抗原刺激下产生的能与该抗原特异性结合的免疫球蛋白。
常规的抗体制备是通过动物免疫并采集抗血清的方法产生的，因而抗血清通常含有针对其他无关抗原的抗体和血清中其他蛋白质成分。
一般的抗原分子大多含有多个不同的抗原决定簇，所以常规抗体也是针对多个不同抗原决定簇抗体的混合物。
即使是针对同一抗原决定簇的常规血清抗体，仍是由不同B细胞克隆产生的异质的抗体组成。
因而，常规血清抗体又称多克隆抗体（polyclonal antibody），简称多抗。
由于常规抗体的多克隆性质，加之不同批次的抗体制剂质量差异很大，使它在免疫化学试验等使用中带来许多麻烦。
因此，制备针对预定抗原的特异性均质的且能保证无限量供应的抗体是免疫化学家长期梦寐以求的目标。
随着杂交瘤技术的诞生，这一目标得以实现。
1975年，Kohler和Milstein建立了淋巴细胞杂交瘤技术，他们把用预定抗原免疫的小鼠脾细胞与能在体外培养中无限制生长的骨髓瘤细胞融合，形成B细胞杂交瘤。
这种杂交瘤细胞具有双亲细胞的特征，既像骨髓瘤细胞一样在体外培养中能无限地快速增殖且永生不死，又能像脾淋巴细胞那样合成和高度同质的抗体，即所谓单克隆抗体（monoclonal antibody），简称单抗。
与多抗相比，单抗纯度高，专一性强、重复性好、且能持续地无限量供应。
单抗技术的问世，不仅带来了免疫学领域里的一次革命，而且它在生物医学科学的各个领域获得极广泛的应用，促进了众多学科的发展。
Kohler和Milstein两人由此杰出贡献而荣获1984年度诺贝尔生理学和医学奖。
二、杂交瘤技术（一）杂交瘤技术的诞生淋巴细胞杂交瘤技术的诞生是几十年来免疫学在理论和技术两方面发展的必然结果，抗体生成的克隆选择学说、抗体基因的研究、抗体结构与生物合成以及其多样性产生机制的揭示等，为杂交瘤技术提供了必要理论基础，同时，骨髓瘤细胞的体外培养、细胞融合与杂交细胞的筛选等提供了技术贮备。
单克隆抗体制备
10 单克隆抗体纯化
①盐析法 腹水10ml＋等量生理盐水混匀,在电磁搅拌下逐滴
缓慢加入饱和硫酸胺20ml,4℃放置0.5h以上或过夜。离 心 3000rpm 30min,弃上清。沉淀加生理盐水20ml溶解 后,再次加入饱和硫酸胺10 ml,4℃放置0.5h或过夜。离 心 3000rpm 30min,弃上清。沉淀加尽量少生理盐水溶 解,装入透析袋中,用流动自来水透析40min,再用生理盐 水透析24h,中间换液3~4次,检测无NH4离子存在即可。 -20℃备用。
加强免疫：同量抗原＋不完全佐剂,间隔7～10天一 次。约2～3次,皮下或腹腔注射。
试 血：取静脉血,ELISA法检测血清中抗体滴度, 当效价达到 1：400以上时,进行加强免疫。
弱免疫原免疫方案：0天、30天、45天、60天、75天。
2 免疫动物脾细胞悬液的制备 ：
将末次免疫后3天BALB/c小鼠处死,消毒,无菌取出 脾脏,置入无菌PBS或培养液中。在100目的钢网上研磨 脾脏。收集细胞于50ml离心管中,1500rpm离心5分,去上 清。加入10ml PBS用吸管轻微混匀,1500rpm离心5分,去 上清,用10ml RPMI培养液悬浮。
佐剂
1. 概念 佐剂属非特异性免疫增强剂,与抗原一起注射或预
先注入机体时,可增强机体免疫应答或改变免疫应答的 类型。
2. 种类 1 卡介苗 BCG 、短小棒状杆菌 CP 、脂 多糖 LPS 、细胞因子； 2 氢氧化铝、明矾； 3 双链多聚肌苷酸：胞苷酸 poly I：C 和双 链多聚腺苷酸：鸟苷酸 poly A：U ； 4 矿物油、脂质体、免疫刺激复合物 ISs 、CPG寡核苷酸。
3. 弗氏完全佐剂
1 成分：羊毛脂、液体石蜡和灭活卡介苗。 2 配方：羊毛脂：液体石蜡 为1：2,也可1：1。
单克隆抗体制备
monoclonal antibod
单抗：因单一克隆B细胞杂交瘤产生的，只识别抗原分子某一特定决定
簇的特异性抗体。
由单一B细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗 原表位的抗体，称为单克隆抗体。通常采用杂交瘤技术 来制备，杂交瘤（hybridoma）抗体技术是在细胞融合 技术的基础上，将具有分泌特异性抗体能力的致敏B细 胞和具有无限繁殖能力的骨髓瘤细胞融合为B细胞杂交 瘤。用具备这种特性的单个杂交瘤细胞培养成细胞群， 可制备针对一种抗原表位的特异性抗体即单克隆抗体。
1．材料
大鼠神经胶质细胞株瘤杂交瘤细胞株 大鼠神经胶质细胞株瘤杂交瘤细胞株 （1）经高压灭菌的降植烷。 （2）Balb/c鼠：5~8周龄。 （3）杂交瘤细胞：取对数生长期的细胞。 （4）RPMI—1640培养液 （5）新生牛血清
大鼠神经胶质细胞株瘤杂交瘤细胞株
2．操作方法
(1)于小鼠腹腔注射0.5ml降植烷，注射后1～9周内种植细胞。 (2)收取对数生长期的杂交瘤细胞，用5%FCS—1640液洗涤一次， 1000r/min离心10min。 (3)取样，用台盼兰染色，计活细胞数，重新用5%FCS—1640液配成 1.0×107细胞/ml的悬液。 (4)给注射了降植烷的小白鼠接种杂交瘤细胞，每只腹腔注射1ml（含 1.0×107个细胞/ml）。 (5)接种后10天左右时间肿瘤体积最大，此时可由腹腔抽取腹水，每隔 1~3天取1次，可取10次。血清可由腋下动脉或心脏采血后分离。
5、单克隆抗体的大量制备
单克隆抗体的大量制备主要采用动物体内诱生法和体外培养 法。 (1)体内诱生法 取BALB/c小鼠，首先腹腔注射0.5ml液体石 蜡或降植烷进行预处理。1-2周后，腹腔内接种杂交瘤细胞。 杂交瘤细胞在小鼠腹腔内增殖，并产生和分泌单克隆抗体。 约1-2周，可见小鼠腹部膨大。用注射器抽取腹水，即可获 得大量单克隆抗体。 (2)体外培养法 将杂交瘤细胞置于培养瓶中进行培养。在培 养过程中，杂交瘤细胞产生并分泌单克隆抗体，收集培养上 清液，离心去除细胞及其碎片，即可获得所需要的单克隆抗 体。但这种方法产生的抗体量有限。各种新型培养技术和装 置不断出现，大大提高了抗体的生产量。
单克隆抗体制备步骤及注意事项
单克隆抗体制备步骤及注意事项制备步骤如下：1.免疫原选择：选择具有免疫原性的抗原作为单克隆抗体制备的靶点。
免疫原可以是蛋白质、多肽、糖类等。
2.动物模型选择：根据免疫原的性质选择适合的动物模型，如小鼠、兔子等。
应考虑动物模型对免疫原的免疫响应情况以及制备成功的单克隆抗体的应用价值。
3.免疫原注射：将免疫原注射到动物模型体内，通常通过多次注射来诱导免疫反应。
在注射前，可以选择适当的佐剂来增强免疫原的免疫原性，如完全弗氏佐剂或委氏佐剂。
4.混合细胞瘤的制备：在免疫原注射后，等待免疫反应充分发生。
细胞瘤可用于细胞融合，产生融合细胞并筛选单克隆抗体。
常用的细胞瘤包括SP2/0和NS-15.细胞融合：将免疫小鼠脾细胞和癌细胞融合成杂交瘤细胞。
融合的常见方法有聚乙二醇融合法和电融合法。
6.肿瘤细胞筛选：将融合细胞播种在含有选择剂的培养基上，通过选择剂来杀死未融合细胞和不产生抗体的融合细胞，留下产生单克隆抗体的细胞。
7.单克隆抗体筛选：对产生的单克隆细胞进行筛选，常用的方法有ELISA和细胞免疫荧光检测。
8.单克隆抗体培养：将筛选出的单克隆细胞进行扩增培养，获得大量的细胞。
9.单克隆抗体纯化：将培养得到的细胞培养上清进行蛋白A/G亲和层析柱纯化，获得纯化的单克隆抗体。
10. 单克隆抗体鉴定：通过Western blot、免疫组化或其它适当的方法对单克隆抗体进行鉴定，确定其特异性和亲和力。
注意事项如下：1.免疫原的选择应根据具体实验要求合理选择，确保其免疫原性和制备成功的单克隆抗体的应用价值。
2.在注射免疫原前，应充分考虑动物模型对所选择免疫原的免疫响应情况，并进行充分的预备实验和试验。
3.免疫小鼠注射免疫原时，需要严格控制免疫原注射的剂量和频率，以避免过度免疫导致不良反应。
4.细胞融合时，应根据实验要求选择合适的融合方法，并注意细胞融合的时间和条件，以获得高效的细胞融合率。
5.单克隆抗体筛选和鉴定时，应使用多种合适的方法进行综合评估，确保获得特异性和亲和力较高的单克隆抗体。
制备单克隆抗体的技术要点
制备单克隆抗体的技术要点1．交瘤技术的技术流程如图4-1所示。
图4 杂交瘤技术制备单克隆抗体的基本流程2．技术要点1）免疫脾细胞的制备制备单克隆抗体的动物多采用纯系Balb/c小鼠。
免疫的方法取决于所用抗原的性质。
免疫方法同一般血清的制备，也可采用脾内直接免疫法。
2）骨髓瘤细胞的培养与筛选在融合前，骨髓瘤细胞应经过含8-AG的培养基筛选，防止细胞发生突变恢复HGPRT的活性（恢复HGPRT的活性的细胞不能在含8-AG的培养基中存活）。
骨髓瘤细胞用10%小牛血清的培养液在细胞培养瓶中培养，融合前24h换液一次，使骨髓瘤细胞处于对数生长期。
3）细胞融合融合是杂交瘤技术的关键一步，细胞融合应在无菌条件下，于室温或37℃水浴中进行。
瘤细胞与脾细胞之比为1：8～10，在l～2min内滴加50%PEG 1.0ml 边加边摇，静置1-2min。
然后再在2～3min内缓慢滴加无血清培养液，终止反应。
1000rpm离心10min。
最后加含20%小牛血清的HA T培养液。
将细胞混匀，接种于96孔培养板中培养，每孔加0．1ml，同时还加0．1ml的饲养细胞悬液。
4）阳性克隆的筛选应尽早进行。
通常在融合后10天作第一次检测，过早容易出现假阳性。
检测方法应灵敏、准确、而且简便快速。
具体应用的方法应根据抗原的性质，以及所需单克隆抗体的功能进行选择。
常用的方法有RIA法、ELISA法和免疫荧光法等。
其中ELISA 法最简便，RIA法最准确。
阳性克隆的筛选应进行多次，均阳性时才确定为阳性克隆进行扩增。
5）克隆化克隆化的目的是为了获得单一细胞系的群体。
克隆化应尽早进行并反复筛选。
这是因为初期的杂交瘤细胞是不稳定的，有丢失染色体的倾向。
反复克隆化后可获得稳定的杂交瘤细胞株。
克隆化的方法很多，而最常用的是有限稀释法。
（1）显微操作法：在显微镜下取单细胞，然后进行单细胞培养。
这种方法操作复杂，效率低，故不常用。
（2）有限稀释法：将对数生长期的杂交瘤细胞用培养液作一定的稀释后，按每孔1个细胞接种在培养皿中，细胞增值后成为单克隆细胞系。
人源化单克隆抗体的制备方法
人源化单克隆抗体的制备方法人源化单克隆抗体的制备方法1. 引言人源化单克隆抗体作为一种重要的生物药物，在医学诊断和治疗上发挥着重要的作用。
它们能够通过特异性结合目标物质，如病毒、癌细胞等，以识别、中和或破坏它们，具有广泛的应用前景。
人源化单克隆抗体通过将小鼠源的初始抗体进行改造和人源化，弥补了小鼠抗体在人体内产生反应的缺陷，进而提高了其临床应用的安全性和有效性。
2. 人源化单克隆抗体的制备方法2.1 选择目标抗原在制备人源化单克隆抗体之前，首先需要明确目标抗原。
这是指研究人员要制备对特定疾病或病原体具有高度特异性的抗体。
目标抗原的选择对于后续的实验设计和结果分析至关重要。
2.2 制备小鼠源的初始抗体为了制备人源化单克隆抗体，通常需要使用小鼠或其他动物作为初步制备抗体的源头。
研究人员通过免疫注射小鼠来激发其免疫系统产生特定抗原的抗体。
之后，从小鼠体内提取抗体进行初步鉴定和筛选。
2.3 克隆筛选通过克隆和筛选的过程，选择那些对目标抗原具有高度特异性的抗体克隆。
这一步骤的目的是从小鼠源的初始抗体中挑选出性能最佳的抗体克隆，为后续的人源化操作打下基础。
2.4 人源化改造人源化改造是将小鼠源的初始抗体转化为具有人源特性的抗体。
在这一步骤中，研究人员会通过基因工程技术将小鼠源抗体的大部分小鼠特异性区域替换为人源的同源区域，以减少人体对外源蛋白的免疫反应。
这可以通过重组DNA技术，将人源抗体的DNA序列嵌入到小鼠源抗体的DNA序列中，使其具有人源性。
2.5 生产和纯化经过人源化改造的抗体需要进行大规模的生产和纯化。
这通常通过基因工程的方法，在合适的细胞系中表达和生产抗体。
随后，使用各种纯化技术，如亲和层析、离子交换层析等，将抗体从混合物中纯化出来，以获得高纯度的人源化单克隆抗体。
3. 个人观点和理解人源化单克隆抗体的制备方法是一项复杂的过程，其中涉及到多个关键步骤和技术。
通过人源化改造，可以将小鼠源的初始抗体转化为具有人源特性的抗体，从而提高其在人体内的安全性和有效性。
单克隆抗体制备规范操作
单克隆抗体制备规范操作融合准备工作：融合前3天小鼠追加免疫，用灭菌的2兆水稀释抗原，足掌免疫100微克抗原/鼠，50微克/脚，50微升/脚，注意追加免疫后3-6天内融合，因为此时抗体效价较高。
融合所有用到的实验材料和工具(剪过枪头和分装液体盒)进行高压灭菌，并对小鼠骨髓瘤细胞进行传代处理(要求传入新的培养瓶中，密度达到60-70%，并且选择不同的浓度梯度以确保第二天的融合时有最佳状态的细胞)。
融合操作步骤：实验前，将PEG和100ml R-1640培养液放入37℃水浴锅中孵育。
眼球采血处死小鼠（回收血液制备阳性血清用于下一步的ELISA筛选），75%的酒精浸泡消毒，取出小鼠股内侧沟淋巴结，随后把淋巴结放入4℃R-1640培养液（含2×双抗）（准备3个培养皿，一用来剪除淋巴结上的结缔和脂肪组织；二是用来清洗淋巴结；三是用来剪碎和撕碎淋巴结的，制备免疫小鼠的淋巴细胞）。
把含有淋巴细胞或脾细胞的悬液经过有棉花（好的脱脂棉）的吸管过滤，除去残渣，分离细胞。
过滤好的细胞2000r/min，10min。
制备足够多的骨髓瘤细胞（Ag8.8），1500r/min，10min，（每次用4℃R-1640培养液漂洗骨髓瘤细胞，洗3次以上，目的去除培养骨髓瘤细胞的培养液中的的血清，因为血清中的蛋白成分有抑制融合的作用）。
淋巴细胞和骨髓瘤细胞同时洗涤3次以上，要求2000r/min，10min，用10ml 4℃R-1640不完全培养液悬浮骨髓瘤细胞，第4次洗涤前全取淋巴细胞，按照淋巴细胞：骨髓瘤细胞=1：1的数量比（淋巴细胞：骨髓瘤细胞=1：5的体积比）取骨髓瘤细胞，将两种细胞混匀，加入37℃R-1640不完全培养液至50ml，2000r/min，5min，弃除上清液。
（注意：每次离心完毕要求尽量将上清液吸干净）加入预热的1ml PEG融合剂，加入过程中注意缓慢加入（速度：保持一滴一滴地滴入），并且边加边用吸管头轻轻拨动细胞团。
单克隆抗体制备的关键因素
单克隆抗体制备的关键因素单克隆抗体在实验室和临床上有广泛的应用，它是基础免疫研究、诊断测试和疫苗质量控制方面必要的研究工具。
单克隆抗体生产中的关键步骤，特别是抗原的准备、细胞和动物的考虑( 选择) 、佐剂及复合物的制备、注射方式、细胞融合和腹水收集方法，以期在单抗制备过程中减少动物的痛苦，获得最佳的免疫反应。
当机体受抗原刺激时，抗原上的各个抗原决定簇激活具有不同基因的B 细胞。
单克隆抗体(Monoclonal antibody，mAb) ，简称单抗，是仅由一个祖先B 细胞分裂繁殖产生针对单一抗原决定簇的抗体。
1975年，分子生物学家G. J. F. 克勒和 C. 米尔斯坦发现单克隆抗体与骨髓瘤细胞融合产生的杂交瘤细胞具有无限增殖的能力并且可以产生大量的单克隆抗体。
单克隆抗体在生物学实验、医药、生物医药研究、诊断测试和治疗等方面有着广泛的应用。
单克隆抗体的制备实验周期长(需要3～6 个月)，影响因素多。
单克隆抗体生产过程中的关键步骤与因素，以便能产生有效的抗体反应，同时降低动物的疼痛和不良反应。
1 抗原的准备抗原纯度是决定免疫反应特异性和免疫反应质量的重要因素。
尤其是细菌抗原，＜1%的杂质都有可能主导整个免疫反应。
纯化的抗原可以获得特异的免疫反应，同时简化单克隆抗体后期的筛选时间。
依据制备抗原的理化特性，设计超速离心、超滤膜过滤、沉淀、透析、有机试剂提纯等抗原纯化方式。
抗原的毒性是免疫前首要考虑的因素，抗原稀释剂中不能有内毒素、脂多糖的污染。
未灭活的抗原要考虑病原微生物对动物的影响。
抗原的pH 要在动物可以接受的范围内，过高或过低的pH 都会给动物带来很大的损害，影响抗体的产生。
抗原的免疫剂量要依据待免疫动物体积的大小，过多或过少的抗原会导致免疫抑制、免疫耐受或免疫紊乱，不能产生有效的免疫反应。
计算方法常用蛋白含量( mg /mL) = ( 1. 45 × OD280nm －0. 74×OD260nm ) × 样品稀释倍数; 或蛋白含量= OD280× 样品稀释倍数/3。
单克隆抗体制备注意事项
单克隆抗体(McAb)制备技术1975年Khler和Milstein首次利用杂交瘤技术生产单克隆抗体(monoclonal antibody,McAb)获得成功，开创了免疫学和分子生物学研究的新纪元，被人们誉为“免疫学中的一场革命”，该项技术具有巨大生命力和发展前景，目前已被成功地用于分子生物学、免疫学、细菌学、病毒学、生物化学、遗传学、药物学等许多领域的研究。
下面以抗空肠弯曲菌共同抗原McAb的制备为例，介绍McAb的制备技术。
一、材料和方法(一) 材料1 PRMI1640培养液 PRMI1640培养基粉104g，双蒸馏水1000ml，抽滤或高压蒸气灭菌，每瓶80ml分装。
2 完全PRMI1640培养液 PRMI1640培养液80ml,1mol/L Hepes2ml,0.2mol/L谷氨酰胺1ml，青、链霉素溶液(1000u/ml)1ml，灭活小牛血清20ml。
3 次黄嘌呤、胸腺嘧啶核苷(HT母液×100)次黄嘌呤1361mg，胸腺嘧核苷387mg，蒸馏水加至100ml。
在45～50℃水浴中溶解，过滤除菌，分装小试管，每支5ml，置-20℃中保存。
4 氨基喋呤(A母液×100)氨基喋呤176mg，蒸馏水90ml，1mol/L NaOH 0.5ml，加蒸馏水至100ml，再加0.5ml 1mol/L HCl中和，过滤除菌，分装小试管，每支5ml，置-20℃中保存。
5 HAT选择性培养基完全PRMI1640培养液100ml,100×HT母液1ml，100×A母液1ml。
用5%NaHCO3调整pH值至7.4左右。
6 HT培养液完全RPMI1640培养液100ml，100×HT母液1ml。
用5%NaHCO3调整pH值至7.4左右。
7 50%聚乙二醇(PEG)溶液将PEG(MW4000)放在试管内加盖，121.3℃高压蒸气灭菌20min。
使用前加入等量的pH值8.2无血清培养液，置56℃混合，直至完全溶解，移置37℃备用。
单克隆抗体制备
单克隆抗体制备1. 免疫动物：三只Balb/c小鼠2. 佐剂：首先用完全弗氏佐剂（CFA），后用不完全弗氏佐剂（IFA）。
3. 免疫原：蛋白或KLH偶联多肽。
每次免疫使用50-100µg免疫原。
4. 免疫：用PBS稀释免疫原，然后与相应的佐剂1：1混合。
抗原和佐剂完全混合形成稳定的乳剂，将该乳剂在小鼠双肩周围的皮肤下进行皮下注射和后腿进行肌肉注射。
每个区域大约用1/8的免疫原。
接着将1/2的免疫原进行腹腔注射，这样免疫原可以持久存在从而提高免疫应答。
以后每个星期进行腹腔注射直到达到要求的效价。
5. 第0星期预采血完全弗氏佐剂（CFA）混合的100µg抗原免疫小鼠。
第2星期完全弗氏佐剂（CFA）混合的50µg抗原免疫小鼠。
第3星期不完全弗氏佐剂（IFA）混合的50µg抗原免疫小鼠。
第4星期溶解在PBS中的50µg抗原免疫小鼠。
第5星期取适当的细胞或组织进行ELISA和WB检测，溶解在PBS中的50µg抗原免疫小鼠。
第X星期取适当的细胞或组织进行ELISA和WB检测，溶解在PBS中的50µg抗原免疫小鼠。
6. 杂交瘤融合和筛选：用PEG方法将效价最好的小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞F0进行融合。
用抗原对融合的杂交瘤克隆进行筛选，检测它们的特异性和敏感性。
ELI SA阳性的克隆可用WB检测，筛选出来的克隆至少还需要亚克隆两次。
7. 大规模抗体生产：筛选得到两个克隆最后进行大规模培养（每个克隆1L）或者取腹水（每个克隆5只小鼠）。
用蛋白A/G对培养液或腹水进行纯化，平均每个克隆可以得到3-5mg 抗体。
8. 注意：每个融合平均可以得到900多个克隆，对于多肽抗原可以得到100个左右的ELISA阳性克隆，重组蛋白抗原可以得到100-150个ELISA阳性克隆。
亚克隆实验做的越早，越容易保存克隆。
因此，为了保存和复苏阳性克隆，尽早进行筛选检测是必需的。
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单克隆抗体(McAb)制备技术1975年Khler和Milstein首次利用杂交瘤技术生产单克隆抗体(monoclonal antibody,McAb)获得成功，开创了免疫学和分子生物学研究的新纪元，被人们誉为“免疫学中的一场革命”，该项技术具有巨大生命力和发展前景，目前已被成功地用于分子生物学、免疫学、细菌学、病毒学、生物化学、遗传学、药物学等许多领域的研究。
下面以抗空肠弯曲菌共同抗原McAb的制备为例，介绍McAb的制备技术。
一、材料和方法(一) 材料1 PRMI1640培养液 PRMI1640培养基粉104g，双蒸馏水1000ml，抽滤或高压蒸气灭菌，每瓶80ml分装。
2 完全PRMI1640培养液 PRMI1640培养液80ml,1mol/L Hepes2ml,0.2mol/L谷氨酰胺1ml，青、链霉素溶液(1000u/ml)1ml，灭活小牛血清20ml。
3 次黄嘌呤、胸腺嘧啶核苷(HT母液×100)次黄嘌呤1361mg，胸腺嘧核苷387mg，蒸馏水加至100ml。
在45～50℃水浴中溶解，过滤除菌，分装小试管，每支5ml，置-20℃中保存。
4 氨基喋呤(A母液×100)氨基喋呤176mg，蒸馏水90ml，1mol/L NaOH 0.5ml，加蒸馏水至100ml，再加0.5ml 1mol/L HCl中和，过滤除菌，分装小试管，每支5ml，置-20℃中保存。
5 HAT选择性培养基完全PRMI1640培养液100ml,100×HT母液1ml，100×A母液1ml。
用5%NaHCO3调整pH值至7.4左右。
6 HT培养液完全RPMI1640培养液100ml，100×HT母液1ml。
用5%NaHCO3调整pH值至7.4左右。
7 50%聚乙二醇(PEG)溶液将PEG(MW4000)放在试管内加盖，121.3℃高压蒸气灭菌20min。
使用前加入等量的pH值8.2无血清培养液，置56℃混合，直至完全溶解，移置37℃备用。
8 8-氮杂鸟嘌呤称取8-氮杂鸟嘌呤20mg，溶于4mol/L NaOH 10ml 或0.36%Na2CO3 10ml中，以蒸馏水稀释至1000ml，过滤备用。
9 台盼蓝溶液台盼蓝100mg，溶于PBS 100ml中即成。
10 0.34mol/L蔗糖溶液蔗糖5.8g，蒸馏水50ml，高压蒸气灭菌，分装。
(二) 方法(以空肠弯曲菌共同抗原的单抗制备为例)1. 动物免疫将提取的空肠弯曲菌共同抗原(CA)与等量的福氏完全佐剂乳化，以皮下多点及腹腔注射途径对8周龄左右的BALB/c小鼠(雌雄不限)进行基础免疫，间隔14天后，改为福氏不完全佐剂，追加免疫，14天后再免疫一次，于融合前3天，经尾静脉用水剂抗原加强免疫一次。
每次抗原用量为每只鼠25～50μg。
2. 细胞悬液的制备(1) 骨髓瘤细胞：在进行细胞融合前的48h，用含10%小牛血清1640培养液，将供融合用的骨髓瘤细胞(NS1或SP2/0)作增殖培养。
融合前24h 再以同样培养液将骨髓瘤细胞培养物换液1次，使细胞浓度于融合当天达到对数生长期的105细胞/ml，取数瓶骨髓瘤细胞，轻轻倒去瓶内原有培养液，加入无血清1640培养液少许，用毛细管吹打瓶壁数次，将细胞洗下(如用冷的1640培养液冲洗瓶壁细胞更容易洗下)。
将骨髓瘤细胞悬液一并收入离心瓶中，悬浮于1640培养液中，轻轻混匀，吸出少量培养液进行细胞计数，并用台盼蓝染色观察死活细胞率，成活细胞应高于90%。
细胞悬液以1 000 r/min离心10min，倾去上清液，再悬于无血清的1640培养液中供融合用。
(2) 免疫小鼠脾细胞：取上述加强免疫后3～4天的小鼠，挖去眼球放血，收集血液，离析血清，供检测抗体效价用。
然后拉颈处死，用75%酒精将小鼠浸泡消毒，立即放超净台内，用消毒剪刀剪开小鼠腹腔，取出脾脏。
用pH值7.4无血清1640培养液将脾脏冲洗，立即用镊子将脾脏放在消毒铜网上，置于玻璃培养皿内，然后倒入少量1640培养液，用5ml针筒芯子研磨脾脏使成浆状，将此吸入尖底刻度离心管内，于冰浴中静置5～10min，待大块脾组织下沉到底部，轻轻吸出上层脾细胞悬液，移入另一刻度离心管内，悬浮于30ml 1640培养液中。
轻轻混匀，吸取少量溶液，进行细胞计数及活力检查，活细胞率不应低于90%。
以1000 r/min离心10min，倒去上清，将底层脾细胞再悬浮于少量无血清1640培养液中。
取脾细胞的方法，除了在铜网上研磨外，还可用两个注射针头轻轻向一个方向将细胞从脾膜内梳刮下来，或在脾包膜上刺几个孔，然后用针头注入培养液，将细胞冲洗出来；或用剪刀反复将脾脏剪碎，以获得脾细胞。
(3) 小鼠腹腔巨噬细胞：取12周龄以上，最好是与骨髓瘤同系小鼠(其他小鼠也可)，先挖去一只眼球放血，待血滴不出为止。
放血的目的是避免取腹腔细胞时腹腔内出血，造成大量红细胞混入饲养细胞内。
若小鼠不死，则可拉颈处死，浸入75%酒精中消毒，随即放入超净台内，用消毒镊子和剪刀剪开小鼠腹部外层皮肤，剪时要小心，切勿将腹膜剪破，使腹腔内液体流失。
然后向上、下两侧方向拉开腹部皮肤，暴露腹膜。
用消毒注射器抽取0.34mol/L蔗糖溶液(或无血清1640培养液)4ml用镊子将腹膜提起，将溶液注入小鼠腹腔内。
一只手固定针筒，针头停留在腹腔内，轻轻按摩腹壁1～2min，目的是促使巨噬细胞游出。
然后用注射器抽回腹腔内液体，也可用毛细吸管将液体吸出，注入到预先置于冰浴中的尖刻度离心管内，置冰浴的目的主要是可以避免或减少玻璃管壁对巨噬细胞的吸附作用。
若用塑料离心管则可减少细胞吸附。
细胞悬液以1 000 r/min离心10min，倒去上清液，加入含20%小牛血清1640培养液中。
通常每只小鼠可获得3～5×106个腹腔巨噬细胞。
把沉淀细胞悬浮于20ml培养液中，混匀，分注于2块96孔(或4块40孔)培养板中，每孔0.1ml(约2滴)，培养板加盖后，放入37℃含5%～10%CO2培养箱中培养。
24h后，可以放在倒置显微镜下观察。
生长良好的饲养层，巨噬细胞或小淋巴细胞的胞体饱满，折光性强，部分或大部分细胞变成棱形。
腹腔细胞培养物保持在良好的潮湿温箱内，至少可在7天内保持活力。
饲养层细胞经24h培养后，若细胞形态变小，无光泽，视野中不见棱形细胞，则不能供融合细胞的培养用。
其原因可能是细胞培养板处理不当，或培养基中含有毒性物质，或培养条件不适(pH值、湿度、CO2等)所造成的。
加入巨噬细胞的作用，是由于杂交瘤细胞早期十分脆弱，细胞稀少时不易生长，加入一些巨噬细胞、胸腺细胞或脾细胞，满足了杂交瘤细胞对密度的依赖性，消除一些有毒或有抑制生长作用的细胞碎片，提供生长刺激因子等，促进杂交瘤细胞的生长。
饲养细胞中，除巨噬细胞外，胸腺细胞、脾细胞均具有较好的效果。
3. 细胞融合的步骤细胞融合过程在37℃水浴箱内进行，并要求严格的无菌操作。
(1) 混合细胞：将上述制备的脾细胞和瘤细胞按细胞数的2～10∶1混合于刻度离心管，经1 000r/min离心10min，倾尽上清液，用力振动试管，将细胞打散，使细胞沉淀块疏松成糊状。
(2) 加入PEG：将离心管直立于操作环境中，在90s内滴加完50%PEG 溶液0.5ml，边加边摇动，加完后，静置90s。
(3) 终止PEG的作用：用无血清1640培养液终止PEG的作用。
仍在边摇晃的情况下，在第一个30s内滴加1ml；在下一个30s滴加3ml，在最后90s内滴加16ml。
加入培养液后，不要多摇动，以免影响细胞融合率，最后补充培养液至30～40ml，在室温中静置5min。
(4) 离心洗涤：以1 000 r/min离心沉淀10min，弃去上清液。
加满无血清培养液，再离心10min，弃去上清液，以洗除残余的PEG。
单克隆抗体(McAb)制备技术(5) 加入培养孔内：把沉淀细胞用含20%小牛血清的HAT培养液50ml 混匀，分别加入到5块96孔培养板中，每孔01ml，每孔原有01ml饲养细胞，故现在每孔有0.2ml培养液。
将培养板置于37℃含5%～10%CO2培养箱中培养。
(6) 对照孔：第一行孔中为用15%小牛血清HAT液稀释的骨髓瘤细胞，细胞数约1×105/孔。
骨髓瘤细胞在2～3天可见明显退变，如果不退变则表明HAT失效，或者细胞已由HGPRT- 回复成HGPRT+。
第二行孔中为用15%小牛血清HAT液稀释的脾细胞，细胞数4×105/孔。
脾细胞在6～7天后也会见到退变现象，在上清液中有时可检测出抗体，这是脾细胞分泌出来的，随着换液，抗体浓度会愈来愈低，以至消失。
如果脾细胞继续旺盛增殖，而且抗体浓度不降低，有两种可能性：一种是在换液时混入杂交瘤细胞，另一种是脾细胞本身可能在小鼠体内转化成能长期培养的免疫母细胞，这种可能性是很小的，一旦遇到应抓住不放，将它克隆化。
可取少量细胞融合悬液，于显微镜下观察细胞融合情况。
可能出现几种情况：未融合的脾细胞；未融合的骨髓瘤细胞；脾细胞与脾细胞的融合体；瘤细胞与瘤细胞的融合体；脾细胞与骨髓瘤细胞的融合体，通过显微镜下观察，可粗略地了解融合的情况及融合过程中细胞的破损率。
4.融合后混合细胞的培养(1) 换液：在培养过程中，通常按半量换液法(即吸去每个孔1/2体积的培养液，再加入1/2体积新鲜的HAT培养液)换液，每次从每孔中吸出0.1ml培养液，加上0.1ml新鲜的HAT培养液。
第5、8及11天换以20%小牛血清HAT液，第14、18、22、25天换以20%小牛血清HT液。
这要根据实际情况来决定，如果发现培养液变黄，应及时换液，特别是后期细胞克隆较大的，一般隔日换液一次。
换液时，应首先换对照孔，以免将杂交瘤细胞及抗体带入对照孔中。
严格说，吸出上清液时，每孔只许用一个吸头，这样才不致于把一个孔中的细胞及抗体带入另一孔中，也可避免污染扩散。
(2) 观察：每天都应观察，一是看是否有污染，二是看细胞生长状态。
一般经过3～5天培养，单个的杂交瘤细胞开始长成几个或十几个细胞的集落，大多数在8～10天时形成，个别至两周左右才能见到。
5.抗体阳性孔的检测当杂单克隆抗体(McAb)制备技术交瘤细胞的大小达到孔底面积的1/10时，就可检测上清液中的抗体，筛选出分泌抗体的杂交瘤细胞，并尽早进行克隆化。
不分泌抗体的杂交瘤细胞比分泌抗体的杂交瘤细胞生长得快，由于培养液中的营养有限，分泌抗体的杂交瘤细胞有被挤掉的危险，因此要早检测、早克隆。
第一次检测抗体一般在第二次换液的两天后，即融合后的第10天进行。
过早检测，由于杂交瘤细胞太小，分泌抗体少，易出现假阴性；也可能由于免疫脾细胞分泌的抗体仍存在，出现假阳性反应。