单克隆抗体制备注意事项

单克隆抗体(McAb)制备技术

1975年Khler和Milstein首次利用杂交瘤技术生产单克隆抗体(monoclonal antibody,McAb)获得成功，开创了免疫学和分子生物学研究的新纪元，被人们誉为“免疫学中的一场革命”，该项技术具有巨大生命力和发展前景，目前已被成功地用于分子生物学、免疫学、细菌学、病毒学、生物化学、遗传学、药物学等许多领域的研究。下面以抗空肠弯曲菌共同抗原McAb的制备为例，介绍McAb的制备技术。

一、材料和方法

(一) 材料

1 PRMI1640培养液 PRMI1640培养基粉104g，双蒸馏水1000ml，抽滤或高压

蒸气灭菌，每瓶80ml分装。

2 完全PRMI1640培养液 PRMI1640培养液80ml,1mol/L Hepes

2ml,0.2mol/L谷

氨酰胺1ml，青、链霉素溶液(1000u/ml)1ml，灭活小牛血清20ml。

3 次黄嘌呤、胸腺嘧啶核苷(HT母液×100)次黄嘌呤1361mg，胸腺嘧核苷387mg，蒸馏水加至100ml。在45～50℃水浴中溶解，过滤除菌，分装小试管，每支5ml，置-20℃中保存。

4 氨基喋呤(A母液×100)氨基喋呤176mg，蒸馏水90ml，1mol/L NaOH 0.5ml，加蒸馏水至100ml，再加0.5ml 1mol/L HCl中和，过滤除菌，分装小试管，每支5ml，置-20℃中保存。

5 HAT选择性培养基完全PRMI1640培养液100ml,100×HT母液1ml，100×A母液1ml。用5%NaHCO3调整pH值至7.4左右。

6 HT培养液完全RPMI1640培养液100ml，100×HT母液1ml。用5%NaHCO3调整pH值至7.4左右。

7 50%聚乙二醇(PEG)溶液将PEG(MW4000)放在试管内加盖，121.3℃高压蒸气灭菌20min。使用前加入等量的pH值8.2无血清培养液，置56℃混合，直至完全溶解，移置37℃备用。

8 8-氮杂鸟嘌呤称取8-氮杂鸟嘌呤20mg，溶于4mol/L NaOH 10ml 或0.36%Na2CO3 10ml中，以蒸馏水稀释至1000ml，过滤备用。

9 台盼蓝溶液台盼蓝100mg，溶于PBS 100ml中即成。

10 0.34mol/L蔗糖溶液蔗糖5.8g，蒸馏水50ml，高压蒸气灭菌，分装。

(二) 方法(以空肠弯曲菌共同抗原的单抗制备为例)

1. 动物免疫将提取的空肠弯曲菌共同抗原(CA)与等量的福氏完全佐

剂乳化，以皮下多点及腹腔注射途径对8周龄左右的BALB/c小鼠(雌雄不限)进行基础免疫，间隔14天后，改为福氏不完全佐剂，追加免疫，14天后再免疫一次，于融合前3天，经尾静脉用水剂抗原加强免疫一次。每次抗原用量为每只鼠25～50μg。

2. 细胞悬液的制备

(1) 骨髓瘤细胞：在进行细胞融合前的48h，用含10%小牛血清1640培养液，将供融合用的骨髓瘤细胞(NS1或SP2/0)作增殖培养。融合前24h 再以同样培养液将骨髓瘤细胞培养物换液1次，使细胞浓度于融合当天达到对数生长期的105细胞/ml，取数瓶骨髓瘤细胞，轻轻倒去瓶内原有培养液，加入无血清1640培养液少许，用毛细管吹打瓶壁数次，将细胞洗下(如用冷的1640培养液冲洗瓶壁细胞更容易洗下)。将骨髓瘤细胞悬液一并收入离心瓶中，悬浮于1640培养液中，轻轻混匀，吸出少量培养液进行细胞计数，并用台盼蓝染色观察死活细胞率，成活细胞应高于90%。细胞悬液以1 000 r/min离心10min，倾去上清液，再悬于无血清的1640培养液中供融合用。

(2) 免疫小鼠脾细胞：取上述加强免疫后3～4天的小鼠，挖去眼球放血，收集血液，离析血清，供检测抗体效价用。然后拉颈处死，用75%酒精将小鼠浸泡消毒，立即放超净台内，用消毒剪刀剪开小鼠腹腔，取出脾脏。用pH值7.4无血清1640培养液将脾脏冲洗，立即用镊子将脾脏放在消毒铜网上，置于玻璃培养皿内，然后倒入少量1640培养液，用5ml针筒芯子研磨脾脏使成浆状，将此吸入尖底刻度离心管内，于冰浴中静置5～10min，待大块脾组织下沉到底部，轻轻吸出上层脾细胞悬液，移入另一刻度离心管内，悬浮于30ml 1640培养液中。轻轻混匀，吸取少量溶液，进行细胞计数及活力检查，活细胞率不应低于90%。以1000 r/min离心10min，倒去上清，将底层脾细胞再悬浮于少量无血清1640培养液中。

取脾细胞的方法，除了在铜网上研磨外，还可用两个注射针头轻轻向一个方向将细胞从脾膜内梳刮下来，或在脾包膜上刺几个孔，然后用针头注入培养液，将细胞冲洗出来；或用剪刀反复将脾脏剪碎，以获得脾细胞。

(3) 小鼠腹腔巨噬细胞：取12周龄以上，最好是与骨髓瘤同系小鼠(其他小鼠

也可)，先挖去一只眼球放血，待血滴不出为止。放血的目的是避免取腹腔细胞时腹腔内出血，造成大量红细胞混入饲养细胞内。若小鼠不死，则可拉颈处死，浸入75%酒精中消毒，随即放入超净台内，用消毒镊子和剪刀剪开小鼠腹部外层皮肤，剪时要小心，切勿将腹膜剪破，使腹腔内液体流失。然后向上、下两侧方向拉开腹部皮肤，暴露腹膜。用消毒注射器抽取

0.34mol/L蔗糖溶液(或无血清1640培养液)4ml用镊子将腹膜提起，将溶液注入小鼠腹腔内。一只手固定针筒，针头停留在腹腔内，轻轻按摩腹壁1～2min，目的是促使巨噬细胞游出。然后用注射器抽回腹腔内液体，也可用毛细吸管将液体吸出，注入到预先置于冰浴中的尖刻度离心管内，置冰浴的目的主要是可以避免或减少玻璃管壁对巨噬细胞的吸附作用。若用塑料离心管则可减少细胞吸附。细胞悬液以1 000 r/min离心10min，倒去上清液，加入含20%小牛血清1640培养液中。通常每只小鼠可获得3～5×106个腹腔巨噬细胞。把沉淀细胞悬浮于20ml培养液中，混匀，分注于2块96孔(或4块40孔)培养板中，每孔0.1ml(约2滴)，培养板加盖后，放入37℃含5%～10%CO2培养箱中培养。24h后，可以放在倒置显微镜下观察。生长良好的饲养层，巨噬细胞或小淋巴细胞的胞体饱满，折光性强，部分或大部分细胞变成棱形。腹腔细胞培养物保持在良好的潮湿温箱内，至少可在7天内保持活力。

饲养层细胞经24h培养后，若细胞形态变小，无光泽，视野中不见棱形细胞，则不能供融合细胞的培养用。其原因可能是细胞培养板处理不当，或培养基中含有毒性物质，或培养条件不适(pH值、湿度、CO2等)所造成的。

加入巨噬细胞的作用，是由于杂交瘤细胞早期十分脆弱，细胞稀少时不易生长，加入一些巨噬细胞、胸腺细胞或脾细胞，满足了杂交瘤细胞对密度的依赖性，消除一些有毒或有抑制生长作用的细胞碎片，提供生长刺激因子等，促进杂交瘤细胞的生长。饲养细胞中，除巨噬细胞外，胸腺细胞、脾细胞均具有较好的效果。

3. 细胞融合的步骤细胞融合过程在37℃水浴箱内进行，并要求严格的无菌操作。 (1) 混合细胞：将上述制备的脾细胞和瘤细胞按细胞数的2～10∶1混合于刻度离心管，经1 000r/min离心10min，倾尽上清液，用力振动试管，将细胞打散，使细胞沉淀块疏松成糊状。

(2) 加入PEG：将离心管直立于操作环境中，在90s内滴加完50%PEG 溶液0.5ml，边加边摇动，加完后，静置90s。

(3) 终止PEG的作用：用无血清1640培养液终止PEG的作用。仍在边摇晃的情况下，在第一个30s内滴加1ml；在下一个30s滴加3ml，在最后90s内滴加16ml。加入培养液后，不要多摇动，以免影响细胞融合率，最后补充培养液至30～40ml，在室温中静置5min。

(4) 离心洗涤：以1 000 r/min离心沉淀10min，弃去上清液。加满无血清培养液，再离心10min，弃去上清液，以洗除残余的PEG。单克隆抗体(McAb)制备技术

(5) 加入培养孔内：把沉淀细胞用含20%小牛血清的HAT培养液50ml 混匀，分别加入到5块96孔培养板中，每孔01ml，每孔原有01ml