「实验笔记」流式细胞术实验过程中的操作要点

「实验笔记」流式细胞术实验过程中的操作要点

流式细胞术可以同时分析单个细胞的多个参数。目前广泛应用于细胞表面和细胞内分子表达特征的分析，界定不同种类的细胞群，测定分离出的亚类纯度，分析细胞的大小和总量等方面，在流式流式细胞术实验过程中，以下操作要点一定要注意，避免影响实验结果。

1、上机前处理

小心荧光淬灭

操作时必须严格按照孵育时间，如果抗体孵育时间过长，荧光是会逐渐淬灭的。那如果不得不推迟实验怎么办?可以把试管放在冰里面，这样会稍稍延长淬灭的时间。

注意染色顺序

在进行多荧光染色的时候，相同的细胞会因为染色顺序不同而导致荧光强度的差异。解决办法为：预实验。做一系列的不同染色顺序的样本，通过对染色前和染色后的各种样本进行比较分析，判断染色顺序对细胞造成的影响。

选好染色方案

染色方案不合理也可能会导致荧光染色信号太弱。解决的方案：预实验。在正式开始实验之前，通过预实验，设计出一个完美的染色方案。(考虑试剂种类，试剂质量，试剂用量，孵育时间，洗涤次数，染料浓度，染色时间及染色温度等其他因素。)

做好阴性对照及同型对照试验

细胞阴性对照可以显示细胞基准的荧光水平。

同型对照则是为了查看抗体非特异性结合的水平。选择同型对照需要注意采用相同物种、相同亚类、相同染料、相同浓度，否则，检测的时候会出现乱七八糟的同型对照结果。

选择合适的抗体

通用原则是：为表达最弱的抗原选择染色指数最高的荧光素。根据使用的流式细胞仪性能、激光器、滤光片种类来选择。对于多色实验，需选择发射光谱重叠小的染料。

2、参数设定

数据的获取必须是在仪器性能的校准均合格的基础上进行。仪器散射光和荧光信号的光电倍增管电压、增益、颜色补偿等参数的设定会直接影响结果。

电压

电压的调节需根据阴性对照管来调节。

阈值

可以以任意参数及多个参数的组合作为阈值;大多数样本都可以设定FSC/SSC;阈值以下的信号不存储;可以根据阴性对照管来调节。

目的是将不需要的杂质信号，噪音信号，无用的细胞信号等扣除，使收集到的都是有用信号。

补偿

流式细胞分析中经常要用到2种以上的荧光标记抗体进行染色，而目前所使用的多种荧光染料发射谱间有一定重叠。荧光补偿则可以从探测器种除去匹配荧光以外的任何荧光信号。

补偿方式：任意两个通道之间都可以调节。

补偿的调节：根据单染对照管来调节。