黄连内生真菌分离培养条件筛选
培养真菌所需要的条件
培养真菌所需要的条件
1.湿度：真菌生长所需的湿度通常在70-90%之间，可以通过保持适当的空气湿度和提供足够的水分来实现。
2. 温度：真菌生长的最适温度因物种而异，但通常在20-30摄氏度之间。
需要注意的是，温度过高或过低都会影响真菌的生长。
3. 光照：大多数真菌对光照并不敏感，一些物种甚至需要避光。
因此，在培养真菌时通常需要在暗处进行。
4. 营养物质：真菌需要碳源、氮源、矿物质和维生素等营养物质来生长。
这些营养物质可以通过添加特定的培养基来提供。
5. 氧气：真菌需要充足的氧气来进行呼吸和代谢。
因此，在培养真菌时需要提供足够的通气口和空气流通。
6. pH值：真菌生长的最适pH值因物种而异，但通常在5.5-8.0之间。
因此，在培养真菌时需要调整培养基的pH值。
7. 洁净度：真菌容易受到细菌和其他微生物的污染，因此在培养真菌时需要保持周围环境的洁净。
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黄连的分析实验报告
实验名称：黄连分析实验一、实验目的1. 了解黄连的化学成分和药理作用。
2. 掌握黄连提取、分离、鉴定和含量测定的方法。
3. 提高实验操作技能，培养严谨的科学态度。
二、实验原理黄连为毛茛科植物黄连（Coptis chinensis Franch.）、三角叶黄连（Coptis deltoidea C. Y. Cheng et Hsiao）或云连（Coptis teeta Wall.）的干燥根茎。
黄连具有清热燥湿、泻火解毒的功效，用于湿热泻痢、黄疸、高热神昏、心火亢盛、痈肿疮毒等症。
本实验主要采用以下方法对黄连进行分析：1. 提取：采用溶剂萃取法从黄连中提取有效成分。
2. 分离：采用薄层色谱法（TLC）对提取液进行分离。
3. 鉴定：通过比移值（Rf）和对照品进行鉴定。
4. 含量测定：采用紫外-可见分光光度法测定黄连中有效成分的含量。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：黄连粉末、乙醇、正己烷、氯仿、甲醇、硅胶薄层板、对照品（盐酸小檗碱）、蒸馏水等。
2. 仪器：分析天平、超声清洗器、电热恒温水浴锅、旋转蒸发仪、薄层色谱仪、紫外-可见分光光度计等。
四、实验步骤1. 提取：称取一定量的黄连粉末，加入适量乙醇，超声提取30分钟，过滤，滤液蒸干，残渣用甲醇溶解，定容至一定体积。
2. 薄层色谱（TLC）分离：取适量上述溶液，点于硅胶薄层板上，用氯仿-甲醇（8:2）为展开剂，展开，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，加热显色。
3. 鉴定：将薄层板与对照品薄层板进行比对，观察Rf值。
4. 含量测定：（1）标准曲线绘制：精密称取盐酸小檗碱对照品适量，加甲醇溶解，制成一定浓度的对照品溶液。
分别吸取不同体积的对照品溶液，加入一定量的显色剂，在510nm波长下测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度（μg/mL）为横坐标，绘制标准曲线。
（2）样品测定：精密吸取上述提取液，按照标准曲线绘制方法进行测定，计算黄连中有效成分的含量。
五、实验结果与分析1. 提取：通过超声提取法，从黄连中成功提取出有效成分。
黄连抗菌实验报告
一、实验目的本研究旨在探讨黄连的抗菌作用，并通过实验验证其对常见细菌的抑菌效果。
通过对黄连提取物的最低抑菌浓度（MIC）进行测定，为黄连在临床应用中的抗菌活性提供科学依据。
二、实验材料1. 实验菌株：大肠杆菌（Escherichia coli）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）等。
2. 黄连提取物：采用70%乙醇提取黄连粉末，浓度为100mg/mL。
3. 实验试剂：MHB肉汤、MHB琼脂、无菌生理盐水、无菌棉签、无菌滤纸等。
4. 仪器设备：恒温培养箱、生物安全柜、比浊仪、微量移液器、无菌试管等。
三、实验方法1. 菌株培养：将实验菌株分别接种于MHB肉汤中，37℃恒温培养24小时，备用。
2. 黄连提取物制备：将黄连提取物用无菌生理盐水稀释成不同浓度梯度（如：1mg/mL、2mg/mL、4mg/mL、8mg/mL、16mg/mL等）。
3. 抑菌实验：取无菌试管，分别加入不同浓度的黄连提取物和MHB肉汤，混合均匀。
将培养好的实验菌株用无菌棉签均匀涂布于MHB琼脂平板上，然后将含有黄连提取物的试管倒置在平板上，37℃恒温培养24小时。
4. MIC测定：根据平板上抑菌圈的大小，确定黄连提取物对实验菌株的最低抑菌浓度（MIC）。
四、实验结果1. 黄连提取物对实验菌株的抑菌效果：黄连提取物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌等实验菌株均表现出一定的抑菌效果，且随着浓度的增加，抑菌效果逐渐增强。
2. 黄连提取物的最低抑菌浓度（MIC）：黄连提取物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的MIC分别为4mg/mL、8mg/mL、16mg/mL、32mg/mL、64mg/mL。
18株植物内生真菌的分离纯化及鉴定
桃金娘科番樱桃属
月橘
Murraya paniculata
芸香科九里香属
半夏
Pinellia ternata
天南星科半夏属
青木
Aucuba japonica 桃叶珊瑚科桃叶珊瑚属
舟山新木姜子 Neolitsea sericea
樟科新木姜子属
水蜡树
Ligustrum obtusifolium
木犀科女贞属
number of isolation and screening to obtain valuable endophytic fungi，it can provide more sources for novel
natural products.In this study，12 kinds of plants were randomly picked.18 strains of endophytic fungi were isolated
山茶花
Camellia japonica
山茶科山茶属
主要功效及用途 清热降火、消肿解毒、活血化瘀 化湿清热、祛风通络，治痢疾、腰痛 药材、调味料，健胃、活血、散寒
叶片肥厚，主要用于观赏 有催吐功效，主要治疗痢疾 盆栽，果肉多汁可食，制作优质软糖 祛风除湿、行气活血、散瘀止痛 用于痰多咳喘，眩晕，呕吐反胃 园林装饰及盆栽，保护肝功能 平喘，抗心律失常，抗真菌
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
收稿日期： 2015－02－12 作者简介： 鲁群（ 1987－ ） ，女，博士，讲师，研究方向： 天然产物化学与食品功能因子，E－ mail： luqun@ 。 基金项目： 中国国家留学基金委资助。
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表 1 采集植物信息 Table 1 Information of plants
黄连化学成分的分离与鉴定
黄连化学成分的分离与鉴定黄连是一种中药，在中医学中被广泛应用于治疗各种疾病。
黄连的主要功效包括清热解毒、燥湿止泻、消炎止痛等。
黄连中含有丰富的化学成分，其中包括黄连素、蒽醌类、生物碱、黄酮类、苯丙酮类、黄酮类、黄酮苷类、挥发油等多种成分。
这些化学成分对黄连的药理作用起到了重要的作用。
本文将介绍黄连中主要的化学成分的分离与鉴定方法。
一、黄连素的分离与鉴定黄连素是黄连中的主要成分之一，具有很好的药理作用。
黄连素的提取方法可以采用超声波辅助提取法。
将黄连粉末与甲醇混合，置于超声波浴中进行提取，得到甲醇提取物。
然后将甲醇提取物过滤，去除杂质，再用旋转蒸发仪将溶液浓缩至一定程度。
最后，用硅胶柱层析法对甲醇提取物进行分离纯化，得到黄连素。
黄连素的鉴定方法可以采用高效液相色谱法（HPLC）。
将黄连素样品与标准品进行比较，通过检测样品中黄连素的峰面积和保留时间，确定黄连素的含量和纯度。
此外，还可以采用红外光谱法（FTIR）和质谱法（MS）进行黄连素的鉴定。
二、蒽醌类的分离与鉴定蒽醌类是黄连中的另一类重要成分，具有抗炎、抗菌、抗肿瘤等作用。
蒽醌类的提取方法可以采用超声波辅助提取法或微波辅助提取法。
将黄连粉末与乙醇混合，置于超声波浴或微波炉中进行提取，得到乙醇提取物。
然后将乙醇提取物过滤，去除杂质，再用旋转蒸发仪将溶液浓缩至一定程度。
最后，用硅胶柱层析法对乙醇提取物进行分离纯化，得到蒽醌类。
蒽醌类的鉴定方法可以采用高效液相色谱法（HPLC）。
将蒽醌类样品与标准品进行比较，通过检测样品中蒽醌类的峰面积和保留时间，确定蒽醌类的含量和纯度。
此外，还可以采用红外光谱法（FTIR）和质谱法（MS）进行蒽醌类的鉴定。
三、生物碱的分离与鉴定生物碱是黄连中的一类重要成分，具有镇痛、抗炎、抗菌等作用。
生物碱的提取方法可以采用乙酸乙酯-正丁醇-水三相分配法。
将黄连粉末与乙酸乙酯混合，加入正丁醇和水，进行三相分配，得到生物碱的乙酸乙酯层。
分离植物内生真菌操作流程
分离植物内生真菌操作流程1.材料准备：植物样本、剪刀、镊子、70%乙醇、3%次氯酸钠（本实验用4%84）、酒精灯、计时器、平板、锥形瓶，无菌水，离心管（带盖，灭菌）、打开无菌操作台灭菌30min。
（1）植物样本的采集：选取生长状态良好，不要有病斑或者枯枝烂叶，每种植物采取三株标本，要带有叶子、叶柄和枝条及其他部位，将样本名字写在小纸条上放在装标本的袋子里，采下来的标本与写有名字的纸条一同拍照，样本上有脏东西时，请用纸轻轻擦掉，若不清楚植物名字，请将整棵植物拍照留用于鉴定，并做好相关记录。
（2）制作PDA固体培养基，在无菌操作台中倒平板，每瓶250ml的培养基大概倒15个板，待其凝固后用于接种。
2.清洗：认真用清水将标本洗净，洗去标本表面的灰尘，去除枯叶，备用。
3.取样：（1）在叶片的左上、右上、左下，右下和正中五个部位进行取样，剪取5mm*5mm的叶片，如果是叶柄或枝干，则剪取5~10mm，若是比较粗的枝干或圆圆的果实之类的，总之比较大的，则将它切开，再剪取样本，样本不要剪的太大或太小。
（2）每种植物的叶子，叶柄，枝干等其他部位，每种部位接种两块板，大板每个要接种五个样本即左上、右上、左下，右下和正中，小板每个接种四个样本即左上、右上、左下，右下，计算好所要剪的样本数，尽量多剪几个，以免后面的表面灭菌中冲洗时被冲掉。
（3）若植物标本有剩余，且是没有洗过的，重新装好，放到冰箱里，备用，洗过的扔掉。
（4）每种植物标本所剪的样本放在一个50ml的离心管中，放在试管架上，并且每个离心管上要标好所对应的植物标本。
4.表面灭菌：在无菌操作台中进行（1）先向各离心管内倒入适量（10~20ml）70%乙醇，拧紧盖子，用计时器开始计时1min,每10秒钟晃动离心管几次，使其充分灭菌。
（2）1min后，拧松盖子，将乙醇倒入事先准备的锥形瓶中，注意不要将管中样本倒出，倒出的样本不要再放入其中，也不要用手碰到样本，样本不可以接触到除了离心管以外的东西。
植物内生菌的筛选及其抗性测定
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3.1.2、植株生理指标测量：将菌株的 SNB 发酵液拌土，每克土接种量约为 108cfu〃g-1，采取花盆育苗，第 1 片真叶 展平后进行移栽，30d 后重复浇灌发酵菌 液。60d 后开始取样，测定植株的地上部 株高以及植物的鲜重和干重等，分析待测 菌对盆栽青稞的促生效果。
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3.1.3、叶绿素含量测定：取 0.1g 新鲜青稞 绿色叶片，在无菌研钵中剪碎，加入少量 石英沙及 0.5mL 丙酮进行研磨，后再加 10mL 80%丙酮继续研磨。过滤提取液用 80%丙酮 25mL 定容。CK：80%丙酮溶液， 分别在 645、652、663 和 470nm 时的光 密度，计算叶绿素 a、b 和胡萝卜素的浓度 （mg〃L-1）以及叶绿体色素含量。
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1.2、复筛拮抗菌
具体步骤：对初筛后的优良内生菌，用打孔器打成 4mm 菌饼，将 3 块接种于 150ml 的液体培养基内，28℃， 180r/min 培养 60h，后于冷冻离心机上 8000r/min 离心 20min，上清液既为待测发酵液。将上述处理后的内生菌 发酵液 3ml 与 20ml 的培养基充分摇匀混合制平板，待培 养基冷却后在平板中央接种直径为 4mm 各植物致病菌菌 块，以加灭菌水的 PDA 培养基为对照。试验设 3次重复， 28℃暗培养 3d，观察测量并记录菌落直径。记录结果并 计算抑制率。
黄连中生物碱的提取分离及检识
黄连中生物碱的提取分离及检识标准化管理处编码[BBX968T-XBB8968-NNJ668-MM9N]黄连中生物碱的提取分离及检识（杨翊涵中药学一班 1302010138）【摘要】黄连为多年生草本植物,是我国传统中药,在我国中西部地区分布广泛,具有清热燥湿,泻火解毒等功效,其根、茎味极苦,苦味源于所含的多种生物碱。
本文总结整理了黄连中小檗碱提取分离实验过程的步骤方法，注意事项，并且整理了黄连中生物碱的有效成分、存在形式，生物碱的溶解性规律，以及实验过程中各种提取液，添加试剂的目的、原理与效果。
【关键词】黄连生物碱小檗碱提取分离检识1.1黄连有效成分黄连为毛茛科黄连属植物黄连（coptis chinensis Eraneh）、三角叶黄连（coptis deltoidca C．Ycheng et Hsiao）或云连（coptiteetoidesC.Y.cheng）的干燥根茎。
黄连具有清热燥湿、清心除烦，泻火解毒的功效。
黄连的有效成分主要是生物碱，已分离出的主要生物碱有小檗碱（berberine）、掌叶防己碱（palmatine）、黄连碱（jatrorrhizine）等。
其中小檗碱含量最高，可达10%左右，是以盐酸盐的状态存在于黄连中。
小檗碱有很强的抗菌作用，已广泛地应用于临床，掌叶防己碱也作药用，其抗菌性能和小檗碱相似。
1.2小檗碱小檗碱为黄色针状结晶，mp为145℃，游离的小檗碱能缓缓溶于水（1：20）及乙醇中（1：100），易溶于热水及热醇，难溶于乙醚，石油醚、苯、三氯甲烷等有机溶剂，其盐在水中溶解度很小，尤其是盐酸盐。
盐酸盐为l：500，枸橼酸盐1：125，酸性硫酸盐1：100，硫酸盐l：30，但在热水中都比较容易溶解。
2.1实验原理生物碱是植物中含氮的碱性有机化合物,大都有明显的生理活性,是许多中草药中的有效成分。
它们是人类对植物研究得最早最多的一类有效成分,现已分离出有六千余种。
这些生物碱在植物体内一般均与有机酸或无机酸结合成盐而存在,只有弱碱性生物碱往往呈游离状态,还有一些是与糖结合成苷而存在。
黄连及其复方提取工艺条件的优选
黄连及其复方提取工艺条件的优选刘春海，刘西京，杨永华【关键词】黄连；,,盐酸小檗碱；,,提取摘要：目的探讨黄连及其复方的提取工艺条件。
方式以盐酸小檗碱提取率为指标对黄连醇提与水提、单独提取与复方提取的不同条件进行比较，并以正交实验优选其提取工艺。
结果黄连的最正确提取工艺为别离加10，10，8倍量水，煎煮3次，煎煮时刻别离为，， h。
结论实验结果为黄连及其复方制剂的工艺研究提供了实验依据。
关键词：黄连；盐酸小檗碱；提取To Optimize the Extract Method of Rhizoma Coptidis and the CompoundAbstract：ObjectiveTo optimize the extract method of Rhizoma coptidis and the alcohol extraction with water extraction, single extraction with compound extraction. The orthogonal design was used to select the optimum extraction optimum extraction condition was as follows: adding ten folds of water and decocting respectively and then adding eight foldsof water and decocting 1h offered basis on research for preparation technology of Rhizoma coptidis.Key words：Rhizoma Coptidis； Berberine； Extraction黄连为经常使用中药，具有清热燥湿、泻火解毒的功效［1］。
黄连复方为我院一临床体会方，由黄连、赤芍等中药组成，功能益气健脾、清热湿。
植物内生真菌的分离筛选及其生防机制的研究-abc
（1）提高宿主植物对生物胁迫的抗性
内生真菌能产生多种生物碱和真菌毒素如黑麦草碱、 麦角碱、吲哚双萜生物碱等，这些次生代谢物因对食草 动物和昆虫等具有毒性或能降低宿主植物的适口性，从 而能提高植物对多种昆虫和食草动物的抗性。 此外，内生真菌有多种防病机制，如内生真菌与病 原菌的拮抗作用（产生活性物质）、内生真菌的重寄生 作用、营养竞争和非专一性的寄主防卫机制的诱导等。
植物内生真菌的分离筛选及 其生防机制的研究
The Research of Isolation and Bio-control Mechanism of Endophytic Fungi
杨 婷 G13A 强晓晶 G13C 黄麟淇 G13B 李 鹤 G13D
内容
研究背景
内生真菌的生物学作用
研究计划内容 致谢
菌的牧草中毒后造成了畜牧业的重大损失，内生 真菌的研究才得以开展起来。最近几十年，植物 内生真菌的研究才被逐渐重视起来。
研究背景
内生真菌的多样性
内生真菌几乎存在于所有目前已研究过的各种陆生 及水生植物中，种类繁多，分布广泛。 目前全世界至少已在 80 个属 290 多种禾本科植物 中发现有内生真菌。内生真菌在植物组织中普遍存在， 并具有丰富的物种多样性，是自然界生物多样性的重要 组成部分。 植物内生真菌类群的分布受地域、树龄、空气湿度、 季节变化、植株高度、气候条件等各种环境因素的影响。 相关研究表明，自然界中内生真菌总数可能超过100万种。
非培养方法：
通过分子生物学方法，对植物样品总DNA进行提取，PCR扩增和 SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism 单链构象 多态性 )等方法分析，解析非培养植物内生真菌的群落结构。
植物内生真菌分离培养的研究方法
王利娟等： 植物内生真菌分离培养的研究方法
: 8
水冲洗表面残留的消毒剂。家庭用的 ! " # $ %漂 白剂用水稀释至& ’! ( ) ’ 就是最常用的表面消
［ ］ & 毒剂 ， 由于商业次氯酸盐溶液浓度、 可用有效
有时将表面活性剂 （如 ; ） 和消毒剂结合 < 2 2 . = > ) 使用， 消毒后将组织在无菌水或 8 ) ’! 9 : ’ 的乙 醇中浸泡(? 6 .以除去残留的消毒剂。其他的消 毒剂在内生菌研究中并不常用， 包括硝酸银、 氯化 汞 （升汞） 、 福尔马林 （甲醛水溶液） 、 乙醇或丙烯氧 化物。由于升汞的毒性残留以及对自然环境的破 坏作用， 现在国外很少使用， 而是使用一些具有相
高等植物是复杂多样的， 它为各种各样的微 生物提供生存环境。这些微生物中主要是真菌， 有的生活在叶和嫩枝等的表面 （称为表生菌） ， 有 的生活在叶内部组织中 （称为叶内生菌） ， 有的则 生活在树皮中 （称为树皮内生菌） ， 还有的生活在 木材中 （如木质部内生菌和木材腐生菌） 。健康植 物内部组织的内生菌引起越来越多科学家的兴 趣， 从目前己经研究过的植物来看， 可以推断内生 真菌在植物体内是普遍存在的。通过对内生真菌 和宿主专一性分析， 平均每种宿主有! * 种专性 内生真菌， 按地球上有 " 内生真 * 万种植物计算， 菌总数可能超过 # $ $
［ ］ ’ 根菌和假菌根菌） 应属于内生菌 。目前， 关于内
等植物很可能是隐匿着未知真菌的宝库。本文主 要从! 个方面对内生真菌的研究方法进行了简要 综述。
> 植物内生真菌的定义
要弄清内生真菌的定义， 首先要明白内生菌
生菌的概念范畴仍有很大的争议， R = A @ 2 7 2提出的 ［ ］ ’ 内生菌概念被广泛接受 。 植物内生菌包括内生细菌、 内生放线菌和内 生真 菌 。 然而， 过 去’ $ 6中 ， = 7 F G < A =和= 7 F G 3 J K
真菌菌种的分离与鉴定
真菌菌种的分离与鉴定真菌是一类非常重要的生物，在自然界中扮演着重要的角色。
然而，由于真菌生长繁殖的速度较慢，对真菌菌种的分离与鉴定也相对复杂，因此在相关领域中的应用和研究被限制。
本文将着重讨论真菌菌种的分离和鉴定方法，以及其在相关领域中的应用。
一、真菌菌种的分离方法真菌菌种的分离一般有四种方法：直接接种法、涂布法、破碎法和过滤法。
其中，直接接种法是最为常见的方法。
这种方法能够使菌丝在一定时间内表现出纯种特性，同时也避免了在繁殖过程中受到外来菌的污染。
涂布法和破碎法通常用于难以分离的真菌，如念珠菌等。
涂布法将真菌接种在含有透明质酸等黏合物质的平板上，以便于菌落的生长。
破碎法则是将真菌菌落打碎并喷撒在培养基上，利用菌扩、有机营养物和渗透压低的条件下，整个真菌组织中的细胞可以快速生长。
过滤法也是真菌分离的一种有效方法。
过滤法将培养基过滤后，将过滤后的液体放置在培养基上，利用其在液体中相对自由的扩散和分散特性而实现分离过程。
二、真菌菌种的鉴定方法真菌菌种的鉴定一般依据其生理和形态的特征来进行。
生理特征主要包括菌株的代谢和营养需求，形态特征则包含真菌的形状、颜色以及胞壁、细胞核等细胞结构。
尽管生理和形态特征是非常有效的真菌鉴定方法，但它们也存在着一定的局限性。
比如，在某些情况下，形态特征相同的真菌可能属于不同的物种，另外，动物实验的使用限制了真菌鉴定的范围。
为此，近年来，分子生物学方法已成为真菌鉴定领域的重要方法之一。
PCR技术和DNA序列比较是目前最常用的真菌分子鉴定技术。
PCR技术利用特定酶和引物对真菌DNA的特定序列进行放大处理，从而获得足够数量的DNA序列进行分析。
这种技术可以通过检测特定的真菌基因，例如16S和ITS，实现真菌菌种的快速筛选和定位。
DNA序列比较则通过比较不同真菌之间的DNA序列差异，从而帮助确定真菌的物种。
三、真菌在相关领域的应用真菌在食品、制药、环境等领域中有着广泛的应用。
在食品行业中，鉴定发酵型真菌的种类以及制备出有害真菌的解毒剂非常重要，可以有效保障食品安全。
苏都黄连内生放线菌的分离、鉴定及抗菌活性研究
活性 的 内生 放线 菌 ， 并 为开 发苏 都黄 连 的蒙药价 值奠 定基 础．
１ 材 料 与 方 法
１ ． １ 材 料
苏都黄 连采 集 自呼伦 贝尔 红花尔 基．
１ ． １ ． １ 供 试 菌株 水 稻纹枯 病 菌 （ Ｒｈ ｉ ｚ ｏ ｃ ｔ ｏ ｎ ｉ ａ ｓ ｏ ｌ ａ ｎ ｉ ） 、 黄瓜 枯萎 病 菌 （ Ｆ ｕ ｓ ａ ｒ ｉ ｕ ｍ ｏ ｘ ｙ ｓ ｐ ｏ ｒ ｕ ｍ） 、 黄 瓜炭 疽 病 菌（ Ｃ ｏ ｌ ｌ ｅ ｔ ｏ ｔ ｒ ｉ ｃ ｈ ｕ ｍ ｏ ｒ ｂ ｉ ｃ ｕ ｌ ａ ｒ ｅ ） 、 大 豆菌 核病 菌 （ Ｓ ｃ ｌ ｅ ｒ ｏ ｔ ｉ ｎ ｉ ａ ｓ ｃ ｌ ｅ ｒ ｏ ｔ ｉ ｏ ｒ ｕ ｍ） 、 大 豆疫 霉病 菌 （ Ｐ ｈ ｙ ｔ ｏ ｐ ｈ ｔ ｈ ｏ ｒ “
的一 些植 物 内生放线 菌 ， 在农 作物致 病真 菌活性 测试 中表 现 了 良好 的拮抗 活 性 ， 对 控制 植物病 害具 有重 要借
鉴 意义ｌ ６ ］ ． 内生放 线 菌在环 保 污染和 化工行 业 中 ， 类代 谢产 物丰 富 、 应用前 景广 阔的微生 物资源 ， 为 丰 富 放 线 菌 新 物 种 及 发 掘 新 型 天 然 产 物 提 供 了 优 势 资源 ． 苏都 黄连 是作 为一种 野生 植物 ， 是我 国 内蒙古 省呼伦 贝尔地 区鄂温 克族 民 问治疗 感 染 性疾 病 的 常用 植 物． 据《 中国草 药典 》 记载 苏都 黄连 ， 多年 生草本 植物 ， 全 草 入药 ， 味 苦性 寒 ， 具 有 清热 解 毒 、 消肿 、 镇静 、 止咳、 燥脓 、 祛湿 、 利 尿等功 效． 苏都 黄连资 源 丰富 ， 遍 布全 区 山坡 、 树林 边 缘 、 隐蔽 密 林及 灌 木丛 中． 属 于 呼伦 贝尔
内生真菌HLY3中小檗碱的分离鉴定
内生真菌HLY3中小檗碱的分离鉴定选用PDA培养基对黄连内生真菌进行分离，运用薄层色谱法和高效液相色谱法检测到菌株HLY3可产小檗碱，菌丝中质量分数为9.313 μg·g-1，形态学观察结合5.8S rDNAITS序列分析鉴定内生真菌HLY3为交链孢属Alternaria sp.，采用薄层制备分离到小檗碱单体，质谱和核磁鉴定的结果表明小檗碱样品图谱与文献报道基本一致，确证分离到的生物碱为小檗碱，为小檗碱的开发利用提供了新的资源。
标签：黄连；内生真菌；小檗碱；鉴定黄连属毛茛科黄连属多年生草本植物，主要分布在四川、贵州、湖南、湖北、陕西等地的山谷凉湿荫蔽密林中，由于黄连中主要含有小檗碱，具有泻火燥湿、清热解毒之功效，在临床上应用广泛、需求量大，近几年出现了掠夺性采挖，导致野黄连数量逐年降低，少数种类濒临灭绝[1]。
除人工种植黄连补充药源的不足外，探索小檗碱的新来源将是有益的尝试。
研究表明，部分植物内生真菌具有与宿主产生相同活性物质的潜能[24]，因此，马庆等[5]从三角叶黄连中筛选出了具有抑菌活性的内生真菌，厉秀秀等[6]从黄连中分离出了产小檗碱的内生真菌，发现内生真菌发酵液中小檗碱的质量分数为0.664 mg·L-1。
本研究在厉秀秀等的试验基础上，分离黄连内生真菌中的小檗碱，并用波谱技术进行鉴定。
1 材料与方法1.1 仪器与试剂GNP9080型恒温培养箱；美国Waters高效液相色谱仪，Water 2489紫外检测器；MoticBA 210生物显微镜；BioRad PTC150 PCR扩增仪；Bruker A V ANCE III 型核磁共振仪；ABSisex API 2000型质谱仪；分析纯溶剂，成都市科龙化工试剂厂；色谱纯溶剂，天津科密欧化学试剂有限公司。
药材黄连于2014年8月采自重庆市开县岩水乡倪家村农田，经西北农林科技大学生命科学学院李玉平副教授鉴定为Coptis chinensis Franch。
几种药用植物内生真菌的分离鉴定及菌丝培养特性研究
几种药用植物内生真菌的分离鉴定及菌丝培养特性研究植物内生菌是一类生活在植物体中的寄生菌,由于其生活环境的特殊性,植物内生菌与宿主植物协同进化,在演化过程中二者形成了一种共生关系。
近年来的研究表明,植物内生菌不仅具有杀虫、抗菌、抗肿瘤、抗病毒、抗氧化等活性,还能够产生促植物生长的物质,如植物生长素、细胞激动素以及赤霉素等能够直接促进植物的生长。
这使得植物内生菌成为人们寻找新型拮抗菌、抗肿瘤药物的重要资源。
本研究主要是以药用植物为分离材料,分离并筛选具有抗菌活性的植物内生菌并测定其拮抗效果,对活性菌株进行形态及分子生物学鉴定,以及对白屈菜内生真菌BY-1的生长条件进行优化。
论文主要得到的实验结果如下：①采用组织块表面消毒方法,从白屈菜、土三七、毛茛等7种药用植物中分离出了27株可在体外培养的植物内生真菌。
②对分离得到的内生真菌进行平板初筛和拮抗性复筛,结果显示14株内生真菌对杨树叶枯病原菌有不同程度的拮抗效果。
其中白屈菜内生真菌BY-1、土三七内生真菌TJ-2和毛莨内生真菌MY-1对杨树叶枯病原菌的抑制效果非常显著,菌丝生长抑制率可达50%。
除此之外,白屈菜内生真菌BY-1、土三七内生真菌TJ-2和毛莨内生真菌MY-1的孢子悬浮液和发酵液对杨树叶枯病原菌也有较好的的抑制作用。
③通过形态培养,显微观察和18S rDNA序列测定结果表明,TJ-2与Fusarium sp同源性为在99%以上,参考形态学及显微特征,将土三七内生真菌TJ-2鉴定为镰孢霉属(Fusarium), Fusarium sp的一个菌株。
MY-1MJ-1、LJ-3与Bionectria ochroleuca同源性最高,为其不同菌株,同源性均在99%以上,因而将毛莨内生真菌MY-1、MJ-1,连钱草内生真菌LJ-3鉴定为生赤壳属(Bionectria), Bionectria ochroleuca的不同菌株。
唐松草内生真菌SJ-2和白屈菜内生真菌BY-1为子囊菌门(Ascomycota)、子囊菌纲(Ascomycetes)、肉座菌目(Hypocreales)、赤壳科(Hypomycesaureo-nitens)、生赤壳属(Bionectria),Bionectria sp的不同菌株。
内生菌的分离.
新途径，具有极大的应用价值和开发潜力。
二、实验原理
本实验采用组织块法和组织悬液稀释 法分离内生菌，通过改良的培养基筛选内 生真菌，其中部分内生真菌能够产生与宿 主相同或相似的药用活性成分。 内生菌系统地分布于植物体根、茎、叶、 花、果实和种子等器官、组织的细胞或细
胞间隙。内生真菌（endophytic fungi）菌
4 . 内生放线菌
植物内生放线菌有根部结瘤的弗兰克 氏菌（Frankia），一个放线菌新属 （Actinosynemma）。玉米根叶中分离出放 线菌主要为小双孢菌、链霉菌和链孢囊菌。 链霉菌最多(n=482)，链轮丝菌(n=2), 诺卡 氏菌(n=4),小单孢菌(n=1) 链孢囊(n=1)。
4 . 内生菌放线菌的分离
选择性培养基主要是以淀粉为碳源，酪蛋白为氮源，加以
制霉菌素、放线菌酮等抗真菌化合物以促进放线菌的生长，
但是多数研究是为了了解内生放线菌的群落生态组成因此
只选用一种或几种分离培养基，干热等用于提高土壤中放
线菌分离数量，预处理方法也可以用于植物组织。
内生放线菌的分离 弗兰克氏放线菌的离体培养非常困难，主要原因在于： （1）一般离体培养需要2～3 周或更长时间 （2）土壤中含有快生型的微生物如细菌腐生放线菌或真菌
菌水涂抹平板做对照。3－7天后，可见断面边缘长出菌丝。若相应对照无污染，则可挑取前端菌丝转入分离培养基。采用此方法，不断对分离得到的菌株进
行纯化，纯化好后保存在斜面中。
分离细菌及放线菌：将无菌处理的泽漆茎、叶、花、根样品各1.5g，每样品加10ml 无菌水碾碎静置15min 后,各取80μl涂在牛肉蛋白胨培养基、高氏一号培养
实验七 内生菌的分离、鉴定
一 、实验的目
【免费下载】实验三黄连中盐酸小檗碱的提取分离与鉴定
【免费下载】实验三黄连中盐酸小檗碱的提取分离与鉴定实验三黄连中盐酸小檗碱的提取分离与鉴定小檗碱又称黄连素，是在高等植物中分布比较广泛的、有明显生理活性的化学成分。
主要存在于黄连、黄柏、三颗针等中草药中。
小檗碱具有显著的抗微生物、抗原虫的作用，临床用其盐酸盐（即盐酸黄连素）治疗细菌性感染如痢疾、急性肠胃炎、呼吸道感染等症。
黄连为毛茛科黄连属植物黄连（Coptis chinensis Franch 。
），三角叶黄连（C 。
deltoidea C 。
Y 。
Cheng et Hsiao ）或云连（C 。
teetoides C 。
Y 。
Cheng ）的根茎，含有小檗碱(1)、巴马汀(2)、黄连碱(3)、甲基黄连碱(4)、药根碱(5)等生物碱，其中以小檗碱含量最高，可达10%左右，小檗碱以盐酸盐的形式存在于黄连中。
目前制药工业提取小檗碱主要以三颗针为原料。
三颗针来源于小檗科小檗属（Berberis ）多种植物，其根皮含生物碱约2%，主要含小檗碱、小檗胺、药根碱、巴马汀等生物碱。
N +OH ￡-R 1OOR 4OR 3R 2O R 5R 1 R 2 R 3 R 4 R 5 CH 3 CH 3 H CH 3 CH 3 CH 3 CH 3 H H CH 3 H CH 3 CH 3 CH 3 H CH 212345CH 2CH 2CH 2CH 2小檗碱(Berberine)属异喹啉类生物碱，自水和乙醇中结晶出来的小檗碱为黄色长针状结晶，含5个结晶水，在100℃干燥时即失去结晶水，转为棕黄色，加热至110℃时，其颜色加深变暗色。
Mp.145℃至160℃即分解。
N H H 3N O CH 3O CH 3O O H O N H H 3CO C H 3D?éT°·游离小檗碱能缓缓溶于水，在热水及热乙醇中易溶，而在冷乙醇中溶解度为1：100，但难溶于苯、氯仿、丙酮等溶剂。
醇式和醛式小檗碱则具有一般生物碱的通性，难溶于水，易溶于有机溶剂。
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黄连内生真菌分离培养条件筛选摘要：本试验采用压贴法通过对黄连根、茎、叶在不同次氯酸钠浓度及不同表面消毒时间的PDA培养基上的培养，选出黄连内生真菌的适宜培养条件；在获得适宜培养条件后重新培养所有部位，待其长菌后挑选菌落边缘菌丝再培养，如此反复，直到获得纯培养物为止。
通过培养筛选在主根、须根、叶柄、叶片四个部位共获得了60多种菌株，并对分离出的菌株进行保种，为后续的菌株鉴定、菌株抗菌活性的测定做准备。
关键词：黄连，内生真菌，分离条件，培养条件Endophyticfungi of Coptis separation and culture conditions screeningAbstract: The test select the suitable cultivation condition of endophytic fungi ,using pressure stick method cultivate roots, stems and leaves on PDA medium at different concentrations of sodium hypochlorite and different surface sterilization time.Recultivate all parts after acquising suitable cultivation,then select ege colonies and recultivate when they grow fungi,then circulate the procedure,until get pure culture.By cultivating and selecting the roots,fibrous roots,petiole and leaves, more than 60 kinds of fungi are found ,and isolated strains are breed,which is preparation for subsequent strains of identification, the determination of strains antimicrobial activity. Keywords:Coptis, Endophytic fungi, Separation conditions, Culture conditions黄连（Coptis chinensis Franch）是我国名贵中药材之一，含有大量的异喹啉类生物碱[1]（小蘖碱、黄连碱、甲基黄连碱、小蘖红碱、药根碱、阿魏酸等）。
尤其是小蘖碱对人体病原细菌和皮肤真菌[2]具有广谱的抗菌活性，在医药中被广泛应用；同样，小蘖碱对许多植物病原真菌和细菌也有显著的抑制作用。
Hirano, H.等用硫酸小蘖碱处理大麦种子减轻了大麦条纹花叶病毒病（BBMV）的发生[3]。
黄连的药理研究主要以小蘖碱和黄连解毒汤为重点，主要包括抗微生物作用（抗菌、抗病毒）[4]、镇静作用、止泻作用、健胃作用[5]、对心脏心率[6]和心律作用等[7]。
黄连及复方临床应用常用于治疗痢疾、急性肠胃炎、慢性腹泻、呼吸道感染、白喉、百日咳、结核性胞膜炎、萎缩性鼻炎、流行性结膜炎、化脓性中耳炎、口疮、牙周炎、萎缩性胃炎、胃炎、胃及十二指肠溃疡、慢性胆囊炎等，近年来还研究发现黄莲具有较强的抗癌和降血糖功效。
黄连药效作用广泛，历来为医家常用药材，而无节制的开放，野生资源已经枯竭，黄连栽培条件苛刻，生长周期长，难以满足医药生产的需要[8]。
因此迫切需要寻找开发新的资源。
大量的研究发现[9, 10]，内生真菌能够产生与宿主植物相同或相似的次生代谢产物，是新化合物、新药物的潜在资源。
开发和利用植物内生真菌在保护植物物种资源、探索新的产物和新的活性以及提高活性成分的生产效率等方面都具有重要的价值。
从目前已经研究过的植物来看，未发现没有分离到内生真菌的，因此可以推断出内生真菌在植物内是普遍存在的。
内生真菌-植物共生体[11]能产生多种次生代谢产物，用来抵御自然界的虫害，吸引有益微生物和传粉者，竞争阳光和营养等。
内生真菌在植物体与外界环境的交流中发挥着重要的作用，为了增加对病原微生物的抵抗，他们产生新的抗菌素[12]，这些抗菌素具有环保，高效的特征，是新抗菌素的主要来源，也是生物控制的一个重要手段。
将有益的内生真菌接种于药用植物无菌苗的体内，能够缩短组织培养周期，对植株的生长发育和生理代谢进行综合调节，促进宿主药用植物活性成分的合成和积累，提高有效成分的含量。
此外，还可以将有益的内生真菌进行合理的优化组合，获得相应的“内生真菌集群”[13]。
目前，国内外未见对黄连内生真菌研究的报道，故笔者预研究我国黄连主产区——XX 石柱的黄连的内生真菌分离培养条件及菌株保存，为寻找含有与黄连相似或相同化合物的菌株打下基础。
1 材料与方法1.1试验材料新鲜无可见病斑的石柱黄连（C. chinensis Franch）的主根、须根、叶柄、叶片。
1.2试验试剂青霉素；硫酸链霉素；75%乙醇；次氯酸钠溶液（9%、4.5%、2.25%）（浓度以有效氯含量计）；1.3 培养基的配置PDA培养基：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂；不同浓度PDA双抗培养基：以马铃薯20%、葡萄糖2%为基础，分别稀释为12.5%、25%、50%、75%、100%后，再加入琼脂2%，灭菌后稍加冷却，然后加入120ug/mL青霉素和100ug/mL硫黄霉素。
1.4仪器设备托盘天平、烧杯、量筒、剪刀、培养皿、注射器、酒精灯、镊子电热蒸馏水器：WS2-226-77 HS･Z11-5型，长安科学仪器厂电子万用炉：220V･AC 1000W XX泰斯特仪器XX电热恒温鼓风干燥箱：DHG-9108A型，XX精宏试验设备XX立式自动电热压力蒸汽灭菌器：LDZX-40SAI型，XX申安医疗器械厂超净工作台：SW-CJ-2F，苏净集团安泰公司制造电热恒温培养箱：DNP-9082，XX三发科学仪器XX光照培养箱：MGC-250，XX一恒公司1.4试验方法1.4.1表面灭菌方法筛选自来水将整株黄连彻底冲洗干净晾干后，分别取下主根、须根、叶柄、叶片，切割成较大的块，再按下面的方法对试验组及对照组进行处理：CK1：无菌操作的全过程中将5皿打开盖子的PDA的培养皿放于超净工作台。
在试验组处理完后以相同方式培养。
CK2：取适量最后一次漂洗液涂布于PDA培养基中，涂布2皿CK3：取材料压入PDA培养基中，待0.5h后取出材料，重复10次。
主根：在75%乙醇中处理40 s，然后放入9%、4.5%、2.25%三种浓度的次氯酸钠溶液中分别处理2 min、4 min、6 min、8 min、10 min；叶柄：在75%乙醇中处理30 s，然后放入9%、4.5%、2.25%三种浓度的次氯酸钠溶液中分别处理2 min、4 min、6 min、8 min、10 min；叶片：在75%乙醇中处理20 s，然后放入9%、4.5%、2.25%三种浓度的次氯酸钠溶液中分别处理1 min、3 min、5 min；须根：在75%乙醇中处理10s，然后放入9%、4.5%、2.25%三种浓度的次氯酸钠溶液中分别处理0.5 min、1 min、3 min；将经过以上消毒处理的材料材料接种于PDA培养基中，重复10次。
置于25℃中培养，未接种材料的皿培养7天后观察是否有菌长出。
接种材料的皿观察菌长出的时间，生长速度、长出菌量。
1.4.2分离培养条件筛选将黄连的主根、须根、叶柄、叶片以前面筛选出的表面消毒时间处理后，接种于不同浓度PDA培养基中，分别于15℃、25℃的培养条件下倒置培养。
各材料接种20皿，每变量放置2皿。
观察生长出真菌的时间、生长出的数量、生长速度。
1.4.3内生真菌的分离纯化培养7天后取各个菌落边缘的菌块接种于PDA培养基上，培养4天后再次取菌落边缘菌丝接种，如此反复多次，直到获得纯培养物为止。
1.4.4保种用水浴保种的方法对纯化所得的菌株进行保种。
用灭菌的大头针挑取纯化的菌落的一部分，放入1.5mL的无菌EP管中，加入无菌水至淹没菌种，密封保存。
2结果与分析2.1表面消毒条件筛选2.1.1主根表面消毒的筛选表1 主根在次氯酸钠各浓度不同时间表面消毒后长菌率Table 1The percentage of growing fungi on root at different times of the surface concentration in sodiumhypochlorite disinfecting次氯酸钠浓度（%）次氯酸钠时间（min）第4日长菌率（%）第7日长菌率（%）第10日长菌率（%）对照是否长菌9 6 17 50 83 - 8 0 0 0 - 10 0 0 0 -4.5 2 0 100 100 - 4 0 20 90 - 6 0 33 83 - 8 40 80 80 - 10 0 17 17 -2.25 2 20 100 100 + 4 0 60 100 + 6 17 33 67 + 8 33 67 83 + 10 33 100 100 +注：“-”表示未长菌，“+”表示长菌，下同。
通过表1数据可以发现在次氯酸钠浓度为2.25%时，对照组有菌长出，说明浓度过低；在浓度为9%时，对照组未长菌，但试验组几乎无菌长出，表明浓度过高；在浓度为4.45时，比较发现4min、6min的消毒时间为最佳时间，故选择次氯酸钠浓度为4.5%和消毒时间4min作为最佳筛选条件，既达到消毒水平也最节约时间。
2.1.2须根表面消毒的筛选表2 须根在次氯酸钠各浓度不同时间表面消毒后长菌率Table 2 The percentage of growing fungi on fibrous root at different times of the surface concentration insodium hypochlorite disinfecting次氯酸钠浓度（%）次氯酸钠时间（min）第4日长菌率（%）第7日长菌率（%）第10日长菌率（%）对照是否长菌9 0.5 13 25 50 -1 13 25 50 - 3 13 25 25 -4.5 0.5 50 75 100 -1 38 75 88 - 3 0 0 13 -2.25 0.5 38 75 88 +1 38 75 63 - 3 38 88 63 +对表2数据分析发现：在次氯酸钠浓度为2.25%时，对照组不仅有真菌长出还有细菌长出，说明浓度太低；在浓度为9%时，对照组未长菌，但试验组的长菌率只有50%，偏小不适合；在浓度为4.5%时，0.5min、1min的消毒时间较好，考虑试验过程的方便性，选择消毒时间1min为最佳时间，故须根的表面消毒筛选条件为：在4.5%的次氯酸钠中1min。