淫羊藿提取物的雌激素样作用研究

淫羊藿提取物的雌激素样作用研究(作者：___________ 单位：__________ 邮编：___________ )

作者：于燕，颜虹，胡森科，张敬华

【摘要】目的评价淫羊藿提取物的雌激素样作用。方法采用小鼠子宫增重实验、雌激素受体阳性细胞系(MCF17)细胞增殖及拮抗实验，评价淫羊藿及淫羊藿苷的雌激素样作用及其可能机制。结果与阴性对照组比较，淫羊藿及淫羊藿苷能使子宫系数由0.097 士0.008明显增加至0.156 士0.018及0.152 士0.016，且用药前、后动物体重

由(18.9 士 1.3)g 分别增至(19.8 士 1.3)g 及(20.03 士 1.3)g，增幅明显

高于阴性对照组(P0.05);淫羊藿苷可使血清雌激素E2由(132.22 士

11.45)ng/L 增高至(147.73 士12.43)ng/L , FSH水平由(50.15 士3.36) 卩g/L降低至(44.47 士2.46)卩g/L(P0.05)，但淫羊藿组雌激素E2水平无明显改变；在24、48、72h，淫羊藿及淫羊藿苷对MCF、7细胞的增殖均有明显的促进作用(P0.05)，分别由0.238 士0.043、0.387 士0.051、0.563 士0.083 增至0.362 士0.045、0.521 士0.046、0.648 士0.043 及0.324 士0.043、0.465 士0.034、0.622 士0.079 ; 72h 力口入ICI 后，细胞增殖明显受到抑制，细胞增值率分别降至99.461% 94.434%。结论淫羊藿及淫羊藿苷具有雌激素样作用，且其促细胞增殖作

用可能是通过雌激素受体(ER)介导产生的。

【关键词】淫羊藿提取物雌激素样作用

ABSTRACTQbjective To investigate the estrogen 拟like effects of Epimedium extractive. Methods By using the uterus growth test in mice and test of MCF：7 proliferation and adding estroge n receptor an tag onist Icarii n, we evaluated the estroge nic effects of Epimedium and Icarii n and the possible mecha ni sm. Results Epimedium and Icarii n in creased significantly the uterus coefficient in mice from 0.097 士0.008

to 0.156 士0.018 and 0.152 士0.016, respectively; the weight in creased sig ni fica ntly from (18.9 士1.3)g to (19.8 士1.3)g and (20.03 士1.3)g (P0.05). Icarii n in creased sig nifica ntly the serum level of E2 from (132.22 士11.45)ng/L to (147.73 士12.43)ng/L and decreased FSH level from (50.15 士3.36)卩g/L to (44.47 士2.46)卩

g/L (P0.05), but there was no significant differe nee in Epimedium group. There was obviously enhan ced proliferation in MCF 拟7 in 24, 48 and 72h (P0.05), from 0.238 士0.043, 0.387 士0.051 and 0.563 士0.083 to 0.362 士0.045, 0.521 士0.046 and 0.648 士0.043 as well as 0.324 士0.043, 0.465 士0.034 and 0.622 士0.079, respectively. However, the cell proliferatio n was in hibited sig ni

fica ntly by Icari in added in 72h, the proliferation ratio decreased to

99.461% and 94.434%,

respectively. Con clusi on Epimedium and Icari in have estrogen 拟like effects and all of their effects are realized through the estroge n receptor.

KEY WORDS: Epimedium; extractive; estroge n 拟like effect

淫羊藿作为传统补肾壮阳药，具有显著的生物学活性［1］。体内药理实验研究显示，淫羊藿提取物具有性激素样作用，能使雌性小鼠子宫增重［2］，但其雌激素活性成分及作用机制尚不清晰。本实验选用淫羊藿苷含量较高的陕西产淫羊藿［3］，提取并纯化淫羊藿苷［4］，分别通过体内、外实验评价淫羊藿苷的雌激素样作用，为更年期妇女

保健及雌激素依赖性肿瘤（如乳腺癌、子宫内膜癌等）患者的临床用药提供指导。

1材料与方法

1.1淫羊藿苷的提取及纯化［4］

淫羊藿纯化、浓缩后，总干燥物中淫羊藿苷含量为62.3%。淫羊藿药材为免煎剂，购自西安交通大学医学院第一附属医院中药房，生药含量300mg/mL

1.2动物、分组及给药

昆明种小鼠80只，雌性，出生后21d（断乳鼠），体重9~ 12g，

购自西安交通大学医学实验动物中心，二级动物室饲养。阳性药物为

雌二醇注射液（E2），2mg/mL北京益民药业有限公司生产，用植物油

配制成35卩g/mL的悬浊液。实验动物按体重随机分为4组：阴性对

照组、阳性对照组、淫羊藿组以及淫羊藿苷组，每组20只。实验动物适应性饲养6d后，阴性对照组给予等体积植物油；阳性对照组按

0.35mg/(kg ? d)给予E2;淫羊藿组按3g/(kg ? d)给予淫羊藿；淫羊藿苷组按3.5mg/(kg -d)给予淫羊藿苷。早、晚各灌胃1次，连续4d。各组动物于最后1次给药后第2天，取10只称重，脱臼处死，心脏取血，分离血清，ELISA法测定雌二醇(E2)、黄体生成素(LH)、卵泡刺激素(FSH)水平；分离子宫并称重，计算子宫系数(即：子宫湿重/ 体重X 100%＞另10只眼眶后静脉丛取血，4C存放过夜，2000r/min 离心10min，小心分离血清，56C 30min灭活补体，0.22卩m微孔滤膜过滤，-20 C贮存，供细胞培养用。

1.3细胞培养试剂及仪器

DMEM高糖)、无酚红DMEM高糖)、活性炭拟葡聚糖苷处理的胎牛血清(CDT1FBS)为Hyclone公司产品；小牛血清(中国医学科学院生物工程研究所)；E2、MTT DMSO(Sigm公司)；ICI 182, 780(Tocris 公司)。雌激素敏感性人乳腺癌MCF17细胞购自中科院细胞生物研究所细胞库。CO2培养箱(BD);酶联免疫检测仪(EPSON LX800);倒置显微镜(Olympus)。

1.4细胞培养

人乳腺癌细胞系MCF：7于含100mL/L小牛血清的DME高糖溶液

中培养，培养条件为37C、50mL/L CO2相对饱和湿度。实验开始前4d 将细胞用PBS洗涤2次后，改为在无酚红DMEM含50mL/L CDT)；FBS)中培养，以耗尽细胞内储存的雌激素。

1.5 MTT细胞增殖实验

MCF7细胞经无酚红DMEM含50mL/L CDTIFBS）培养4d后，选

取对数生长期细胞，用2.5g/L胰蛋白酶消化，PBS（pH 7.4）洗2次，加入无血清DMEM以每孔2X103个的浓度接种于96孔板内。培养24h 待细胞贴壁后，换为含100mL/L试验血清的DMEM培养液继续培养，每种血清设8个复孔。分别于24、48、72h时，加入MTT（5g/L，每孔15卩L）继续孵育4h，弃去培养液，每孔加入DMSO 15Q L，震荡5?10min，使结晶物完全溶解。以DMS调零，用酶联免疫检测仪在570nm 下测定各孔吸光度（A）值，计算平均A值和增殖率（proliferation rate

，PR）。PR=（实验组A 值/ 阴性对照组A 值）X

100%

1.6 ICI细胞增殖拮抗实验

取经无酚红DMEM含50mL/L CDT；FBS）培养4d后的MCF、7细胞，以每孔2X 103个接种于96孔板。培养24h待细胞贴壁后，换为含100mL/L试验血清的DMEMI养液继续培养，各孔分别加入ICI（终浓度：1X10-8mol/L），每种受试物设8个复孔。于72h加入MTT（5g/L，每孔15卩L），孵育4h后吸去培养液，以DMS睹解，在570nm下测

定各孔A值，计算平均A值和增殖率。

1.7数据分析

采用SPSSI1.0统计软件包建立数据文件并进行数据处理。计量

资料均数比较，经方差齐性检验后，采用单因素方差分析（on e拟

way

ANOVA）组间多重比较采用LSD检验。P0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1淫羊藿及淫羊藿苷对性未成熟小鼠体重及子宫湿重的影响

淫羊藿及淫羊藿苷组小鼠体重增幅明显高于阴性对照组，且均能明显增加子宫重量，但增幅与E2对照组比较相对较小（表1）。表1淫羊藿及淫羊藿苷对小鼠体重和子宫湿重的影响（略）

2.2淫羊藿及淫羊藿苷对性未成熟小鼠血清E2、LH FSH水平的影响

与阴性对照组比较，淫羊藿苷可明显提高血清雌激素水平，降低FSH水平，但淫羊藿组仅表现为FSH水平降低（表2）。

2.3淫羊藿及淫羊藿苷对MCFZ田胞增殖及增殖拮抗的影响

在24、48、72h，淫羊藿、淫羊藿苷对MCF7细胞增殖均有明显的促进作用，但与E2组比较细胞增殖作用明显较弱。加入ICI后，对细胞增殖作用均受到抑制，与阴性对照组相比无显著性差异（表3）。表2淫羊藿及淫羊藿苷对小鼠血清E2、LH和FSH的影响（略）表3 MTT 法检测淫羊藿及淫羊藿苷对MCF；7细胞增殖及增殖拮抗的影响（略）

3讨论

淫羊藿是一种传统的补益中药，具有补肾阳、强筋骨、祛风湿等多种功效。淫羊藿苷是其主要单体成分，对于改善心血管系统功能、调节内分泌、增强免疫、抗肿瘤等均表现出生理活性[1]。整体

药理实验表明，淫羊藿及淫羊藿提取物可能具有雌激素样作用[5]，

提示淫羊藿苷可能是发挥药理活性的主要物质。

本研究应用体内实验一一小鼠子宫增重法检测受试物的雌激素样作用⑹。由于子宫含有大量的雌激素受体（ERs），雌激素或具有雌激素活性的化合物通过与该受体结合，可诱发细胞内反应，使子

宫的雌激素诱导蛋白（IPs）含量增加，而表现为子宫组织增生。为了减少内源性雌激素的分泌对实验结果产生的影响，本实验选用的是初

断乳、性未成熟的雌性小鼠，以子宫湿重与体重之比作为评价雌激素活性的指标。实验结果显示，淫羊藿及淫羊藿苷均能明显诱导子宫增重，与文献报道淫羊藿或淫羊藿提取物具有雌激素样作用一致[7]；

且淫羊藿及淫羊藿苷的子宫增重作用与E2比较相对较弱，提示植物雌激素的作用相对缓和。该结果为绝经期妇女因卵巢功能减退、体内雌激素水平低下而采取植物雌性激素替代疗法提供了安全性保证。

资料显示植物雌激素可改变体内E2、FSH LH水平，发挥雌激素样作用。本实验结果显示，淫羊藿苷可提高小鼠血清雌激素水平，其机制可能是由于其所含的活性成分提高了LH水平，但其具体途径尚不清