基因文库中目的基因的筛选
DNA文库的构建和目的基因的筛选
第八章 DNA文库的构建和目的基因的筛选第一节 概述基因工程主要是通过人工的方法分离、改造、扩增并表达生物的特定基因，从而深入开展核酸遗传研究或者获取有价值的基因产物。
通常将那些已被或者准备要被分离、改造、扩增或表达的特定基因或DNA片段，称为目的基因。
因目的基因片段需插入载体，导入宿主细胞内复制，所以对宿主细胞DNA而言，又称它为外源性基因。
目的基因主要是编码蛋白质(酶)的结构基因，诸如抗逆性相关基因、生物药和保健品相关基因、毒物降解相关基因以及工业用酶相关基因等。
随着生物长期的进化，生物界积累了大量对人类有用的基因。
它是大自然恩赐于人类的宝贵资源，等待人们去开发利用。
目的基因用途很广，主要有以下几个方面：①研究该基因的全貌与内涵，如详细分析其结构、功能及调控。
②与正常基因对比，寻找异常基因的异常点，进而探索疾病发生的分子生物学机理及治疗对策。
③研究生物种系进化与相关同源性。
④应用某种基因大量表达，生产所需要的蛋白质或多肽（如胰岛素、干扰素等药物）。
⑤在农、林、牧、副、渔业中，改造某些目的基因，以改良品种，促进经济发展。
⑥建立基因疗法院，选用某种正常基因,引入患者体内，对某些先天性遗传疾病进行治疗。
根据研究对象的研究目的不同，目的基因可来自原核细胞或真核细胞。
原核生物基因组较简单，较易获得目的基因。
哺乳动物真核细胞基因组庞大复杂，可根据不同的要求选择适宜方法，从中获得目的基因。
要从数以万计的核苷酸序列中挑选出非常小的所感兴趣的目的基因，是基因工程中的第一个难题。
欲想获得某个目的基因，必须对其有所了解，然后根据目的基因的性质制定分离的方案。
目的基因的制备是基因工程研究和应用的关键内容之一。
根据实验需要，待分离的目的基因可能是一个完整的有功能的基因，除了编码区，还包含转录启动区和终止区序列，或者是一个完全的操纵子或基因簇，也可能是只具有编码序列的基因区，甚至是只含启动子或终止子等部件的DNA片段。
第十一章 DNA文库的构建和目的基因的筛选.pp t
总RNA中富集mRNA是构建cDNA的一个重 要步骤。通过降低rRNA和tRNA含量，可大大 提高筛选到目的基因的可能性。
二、第一链cDNA的合成 由mRNA到cDNA的过程称为反转录，由反转录 酶催化。
常用的反转录酶有2种：AMV（来自禽成髓细
的各种信息（如表达丰度、蛋白性内切酶或机械力量切割成一定长 度范围的DNA片段，再与合适的载体在体外重 组并转化相应的宿主细胞体外反转录成cDNA，与适当的载体连接后 转化受体菌，则每个细菌含有一段cDNA，并 能繁殖扩增，这样包含着细胞全部mRNA信息 的自Moloey鼠白血 病病毒）。两者都是依赖于RNA的DNA聚合酶， 有5’→3’DNA聚合酶活性。（目前常用的反转 录酶多是通过点突变去掉RNase H活性的MoMLV）
反转录酶合成DNA时需要引物引导。常用的 引物主要有oligo（dT）引物和随机引物。 ① oligo（dT）引物一般包含15-30个脱氧胸 腺嘧啶核苷和一段带有稀有酶切位点的寡 核苷酸片段； ② 随机引物一般包含6-10个盖基因组的倍数。
1975年Clar（1-p）/ln均插入片段的 长度和： 1）采用部分酶切或随机切割的方法来打断染 色体DNA，以保的插入片段大小所得到的平 均值。
插入效率表示有插入片段的克隆在所检测的
克隆中所占的比例，也是通过电泳检测的。
基因组覆盖倍数的估算方法有2种：
①用公式计算，基因组覆盖倍数=平均插入片 段长度×克隆数/基因组DNA的长度（一般是 约数）； ②结合基因组针筛选到的阳性克隆 的总个数除以使用的总探针数。
三、第二链cDNA的合成 cDNA第二链的合成就是将上一步形成的 mRNA-cDNA杂合双链变成互补双链cDNA的过 程。 cDNA合成的方法： ①自身引导合成法； ②臵换合成法； ③引导合成法； ④引物-衔接头合成法。
目的基因的分离方法
目的基因的分离方法摘要：介绍了基因工程中分离所需目的基因的主要策略和最新进展。
总结了基因分离中的各种方法，主要有：直接酶切分离法，化学合成法，序列克隆法，功能克隆法，作图克隆法，表型差异克隆法，计算机辅助分离法等，并对其特点和适用范围进行了简单评述。
关键词：目的基因分离方法基因的分离方法都是根据基因的基本特性创建的，包括基因核苷酸顺序的特异性、基因在染色体上的位置特异性、基因编码的mRNA的特性和基因的差异表达等。
每种方法运用这些特性的一种或者多种，产生了各种各样的分离方法。
这些方法又相互之间组合，从而产生了可以在不同条件下有效分离目的基因的分离策略。
1 直接提取纯化此法只适用于分离多拷贝基因，而不适用于单拷贝基因。
并且所得到的目的基因纯度较低。
但是操作简单，对设备的依赖性很低，即使在很简陋的实验室里也能完成操作。
2 在体外用化学合成或酶促合成的方法取得目的基因通过对表达产物的分析和测序，可以预测目的基因的核苷酸序列，然后按照DNA碱基序列顺序，先合成DNA短片段，再通过DNA连接酶作用，将这些短片段依次连接成一个完整的基因。
人工合成基因的最大优点是能够根据需要合成突变基因，而且，所合成的是单基因，无其它有害基因，比较完整；缺点是只适用于较短的基因，操作比较难，费用也比较大。
目前这种方法主要用于PCR引物的合成，一些突变基因的合成等。
3 序列克隆——根据已知基因的序列克隆基因3．1 PCR扩增克隆当已知目的基因的序列时，通常采用PCR的方法来克隆基因。
基本原理和方法是：利用已知目的基因的序列，设计并合成一对寡核苷酸引物，提取所要从中分离基因的染色体DNA(RNA需要在逆转录酶的作用下合成cDNA的第1条链)，然后通过PCR反应来扩增特定的DNA片段。
扩增的片段经过纯化后，连接到合适的载体上，用酶切分析和序列分析测定所得到的重组子，并与已知基因的序列进行比较，来进行鉴定。
鉴定之后的DNA可以用于基因的表达。
基因工程中筛选目的基因的方法
基因工程中筛选目的基因的方法1. 核酸杂交筛选法！就像在茫茫人海中找到那个与你契合的灵魂伴侣一样，通过核酸杂交这个神奇的手段，能精准地找到我们想要的目的基因呢！比如我们想找一个特定的基因来治疗疾病，就可以用这个方法去把它揪出来。
2. 基因文库筛选法呀！这就好比是一个超级大的基因宝库，你可以在里面尽情地寻找你需要的宝藏——目的基因。
想象一下，在无数的基因中找到那个关键的它，多刺激呀！比如在寻找提高农作物产量的基因时，就可以利用这个方法嘞。
3. PCR 筛选法呢，哇塞，这可厉害了！简直就像拿着一个超级放大镜，一下子就能把目的基因给找出来。
比如说我们在研究一种新型病毒时，利用PCR 就能快速找到相关的目的基因啦。
4. 免疫筛选法，嘿嘿，就像是身体的免疫系统能精准识别敌人一样，通过免疫反应来找到特定的目的基因哟！例如要找一个用于生产抗体药物的基因，免疫筛选法就派上大用场啦。
5. 酶切筛选法呀，这就像是一个精准的剪刀，能把不符合要求的基因剪掉，留下我们想要的目的基因呢！打个比方，在改造某个生物特性时，就可以用这个方法来筛选基因啦。
6. 噬菌体展示筛选法，这可太有意思啦！就如同在一个热闹的基因集市上，让目的基因自己展示出来，然后我们轻松地把它挑出来。
比如要筛选出能特异性结合某种物质的基因，这不就正好可以用这个方法嘛。
7. 酵母双杂交筛选法，哇哦，这就像一个巧妙的牵线搭桥，能找到相互作用的目的基因呢！像探索蛋白质之间的关系时就能用它来找关键基因啦。
8. 基因芯片筛选法，好厉害的感觉哟！如同有一张超级基因地图，一下子就能锁定目的基因的位置。
好比在大规模基因分析中，这个方法就超有用的啦！总之，这些方法就像是一把把钥匙，能帮我们打开基因奥秘的大门，真的超级神奇啊！。
第十一章 DNA文库的构建和目的基因的筛选
(3) 引导合成法
Okayama-Berg方法
（4）引物-衔接头合成法
4、双链 cDNA连接到质粒或噬菌体载体并导入 大肠杆菌中繁殖的分子克隆
1.同聚100dA/dT, 20dG/dC) • 同聚尾结合的质粒： cDNA杂合分子转化 E.coli的效率随宿主不 同而不同。
该法聪明地利用了反转录过程中用接头锚定的方法， 与传统法相比，全长cDNA的比例得到大幅提高
2. G
1. 抑制性扣除杂交 suppression subtractive hybridization, SSH
含目的基因的cDNA：供体 tester 不含目的基因的cDNA：驱动 driver
• RsaI消化tester和driver • 将tester一分为二，分别加上接头1和接头2R • 第一轮杂交中，用过量的driver cDNA分别与带两种 接头的tester cDNA杂交 • 第二轮杂交中，将第一轮杂交的两个体系混合，再 加入过量的driver cDNA • 补平第二轮杂交产物的末端，进行两轮PCR扩增 • 巢式引物进行第二轮PCR扩增，富集差异表达基因 • T/A克length cDN因： • cDNA第二链合成工程中聚合酶的外切酶活性； • mRNA降解； • 反转录酶合成特性，从转录复合体上anism at 5' end of RNA • 指导合成高分子量蛋白质的能力 无细胞翻译体系（源于网织红细胞） 哺乳动物总mRNA可编码 10～100kDa蛋白
小鼠基因筛选实验报告(3篇)
第1篇一、实验背景基因是生物体内控制遗传信息传递的基本单位，基因突变是生物进化的重要驱动力。
为了研究特定基因的功能，我们采用小鼠作为模型生物，通过基因筛选实验，旨在鉴定和验证与特定表型相关的基因。
二、实验目的1. 构建小鼠基因文库。
2. 通过分子生物学技术筛选与特定表型相关的基因。
3. 验证筛选得到的基因的功能。
三、实验材料1. 实验动物：C57BL/6小鼠。
2. 工具酶：限制性内切酶、DNA连接酶、Taq DNA聚合酶等。
3. 试剂：PCR引物、DNA标记物、DNA探针、克隆载体等。
4. 仪器：PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、显微镜等。
四、实验方法1. 构建小鼠基因文库（1）提取小鼠基因组DNA。
（2）使用限制性内切酶切割基因组DNA，获得特定长度的DNA片段。
（3）将切割后的DNA片段连接到克隆载体上，构建小鼠基因文库。
2. 基因筛选（1）根据已知表型，设计特异性引物，用于PCR扩增目的基因。
（2）对小鼠基因文库进行PCR扩增，筛选出与特定表型相关的基因片段。
（3）将筛选得到的基因片段进行测序，确定其序列。
3. 基因功能验证（1）将筛选得到的基因片段克隆到表达载体中，构建重组表达载体。
（2）将重组表达载体转化大肠杆菌，获得表达目的蛋白的菌株。
（3）通过免疫印迹、免疫荧光等技术检测目的蛋白的表达和活性。
五、实验结果1. 成功构建了小鼠基因文库，文库容量达到预期目标。
2. 通过PCR扩增，成功筛选出与特定表型相关的基因片段。
3. 对筛选得到的基因片段进行测序，确定其序列。
4. 通过基因功能验证，成功表达了目的蛋白，并验证了其功能。
六、实验讨论1. 基因筛选实验中，PCR扩增和DNA测序是关键步骤，需要严格控制实验条件，确保结果的准确性。
2. 在基因功能验证过程中，需要选择合适的表达系统和检测方法，以确保目的蛋白的正确表达和活性。
3. 本研究筛选得到的基因可能与特定表型相关，但其具体功能还需进一步研究。
目的基因序列克隆的筛选与鉴定
目的基因序列克隆的筛选与鉴定目的序列与载体DNA正确连接的效率、重组导入细胞的效率都不是百分之百的，因而最后生长繁殖出来的细胞并不同都带有目的序列。
一般一个载体只携带某一段外源DNA，一个细胞只接受一个重组DNA分子。
最后培养出来的细胞群中只有一部分、甚至只有很小一部分是含有目的序列的重组体（recombinant）。
将目的重组体筛选出来就等于获得了目的序列的克隆，所以筛选(dcreening)是基因克隆的重要步骤。
在构建载体，选择宿主细胞、设计分子克隆方案时都必须仔细考虑筛选的问题。
以下就常用技术的基本原理加以介绍。
一、根据重组载体的标志作筛选最常见的载体携带的标志是抗药性标志，如抗氨芐青霉素（anpr）、抗四环素(terr)、抗卡那霉素(kanr)、G418等。
当培养基中含有抗生素时，只有携带相应抗药性基因载体的细胞才能生存繁殖，这就把凡未能接受载体DNA的细胞全部筛除掉了。
如果外源目的序列是插入在载体的抗药性基因中间使这抗药性基因失活，这个抗药性标志就会消失。
例如质粒pBR322含有anpr、和terr两个抗药基因，若将目的序列插入terr基因序列中，转化大肠杆菌，让细菌放在含氨芐青霉素或四环素培养基中，凡未接受质粒DNA的细胞都不能生长；凡在含氨芐青霉素和四环素中都能生长的细菌是含有质粒pBR322的，但其pBR322未插入目的序列，凡在氨芐青霉素中能生长、而在四环素中不能生长的细菌就很可能是含有目的序列的重组质粒。
载体含有lacZ’的蓝白筛选法，近年更被广泛应用。
例如将目的序列插入前面述及的质粒pUC19的多克隆位点，转化大肠杆菌，放入含氨芐青霉素、IPTG、X-gal的培养基中培养，凡能生长并呈白色的菌落，其细菌中就很可能含有插入目的序列的重组质粒，这样就很容易获得目的序列的克隆。
根据重组载体的标志来筛选，可以筛选去大量的非目的重组体，但还只是粗筛，例如细菌可能发生变异而引起抗药性的改变，却并不代表目的序列的插入，所以需要做进一步细致的筛选。
基因工程中目的基因的检测pcr法
基因工程中目的基因的检测pcr法基因工程中目的基因的检测PCR法在现代生物技术领域，基因工程扮演着至关重要的角色。
它涉及到对生物体的基因进行精确的修改和调控，以实现特定的科学或商业目标。
在基因工程的过程中，检测目的基因的存在和表达是至关重要的一步。
聚合酶链反应（PCR）作为一种高效、灵敏的基因检测技术，已被广泛应用于这一领域。
PCR技术的基本原理是利用DNA聚合酶在特定条件下，对目标DNA 序列进行指数级扩增。
这一过程涉及到几个关键步骤：变性、退火和延伸。
通过高温将双链DNA变性为单链，然后通过降温使引物与目标序列特异性结合，在适宜的温度下，DNA聚合酶沿着模板链合成新的DNA链。
通过这一系列的循环，目标DNA序列得以在短时间内大量复制，从而便于检测和分析。
在基因工程中，PCR技术被用于多种目的。
它可以用于验证目的基因是否已成功导入宿主细胞。
通过设计特异性的引物，可以扩增出导入的基因片段，并通过凝胶电泳等方法进行检测。
PCR还可以用于检测目的基因的表达水平。
通过逆转录PCR（RTPCR）技术，可以将RNA转录为cDNA，然后通过PCR扩增，从而间接检测基因的表达量。
为了确保PCR检测的准确性和可靠性，必须严格控制实验条件。
引物的设计至关重要。
引物需要与目标序列完全匹配，并且具有适当的长度和GC含量，以确保高效性和特异性。
实验中的温度控制、试剂浓度和循环次数等参数也需要精确调控。
任何微小的偏差都可能导致结果的误判。
在应用PCR技术进行基因检测时，还需要考虑到可能存在的假阳性或假阴性结果。
假阳性通常是由于交叉污染或非特异性扩增引起的，而假阴性可能是由于模板量不足或扩增条件不适宜导致的。
因此，在实验设计中，应采取适当的对照和重复实验，以验证结果的可靠性。
随着PCR技术的不断发展，出现了许多基于PCR的衍生技术，如定量PCR（qPCR）、多重PCR和高通量PCR等。
这些技术不仅提高了检测的灵敏度和特异性，还实现了对多个基因的同时检测，大大提高了实验效率。
目的基因的4种获取方法
目的基因的4种获取方法目的基因的4种获取方法目的基因是指科学家们在研究某种生物学现象时，所需要的特定基因。
获取目的基因是进行分子生物学研究和基因工程实验的前提条件之一。
本文将介绍四种常见的获取目的基因的方法。
一、PCR扩增法PCR扩增法是一种常见且简便的获取目的基因方法。
其原理是利用DNA聚合酶在模板DNA上进行反复扩增，从而获得大量目标序列。
PCR扩增法适用于已知序列或有已知序列片段可供引物设计的情况下。
具体步骤如下：1. 设计引物：根据目标序列设计出适当长度、互补性良好、不含二级结构和非特异性引物。
2. 提取模板DNA：从样品中提取出含有目标序列DNA片段的模板。
3. PCR反应：将引物与模板DNA加入PCR反应体系，通过多轮温度循环反复扩增出目标序列。
4. 纯化PCR产物：通过凝胶电泳等手段纯化出PCR产物。
二、限制性内切酶消化法限制性内切酶消化法是一种利用限制性内切酶切割DNA，从而获得目标序列的方法。
其原理是在DNA双链中寻找特定的核苷酸序列，并将其切割成特定长度的DNA片段。
具体步骤如下：1. 设计引物：根据目标序列设计出适当长度、互补性良好、不含二级结构和非特异性引物。
2. 提取模板DNA：从样品中提取出含有目标序列DNA片段的模板。
3. 选择限制性内切酶：根据目标序列中存在的限制性内切酶位点，选择合适的限制性内切酶。
4. 消化反应：将模板DNA与选择好的限制性内切酶加入反应体系，进行消化反应。
5. 纯化产物：通过凝胶电泳等手段纯化出所需长度的DNA片段。
三、基因克隆法基因克隆法是一种将外源基因插入到载体中并进行繁殖复制的方法。
其原理是通过PCR扩增或限制性内切酶消化等手段获取目标基因，并将其插入到载体中，再通过细胞培养等手段进行繁殖复制。
具体步骤如下：1. 设计引物：根据目标序列设计出适当长度、互补性良好、不含二级结构和非特异性引物。
2. 提取模板DNA：从样品中提取出含有目标序列DNA片段的模板。
筛选含有目的基因的受体细胞的方法
基因工程中重组DNA的两次筛选张辉运江西省遂川中学基因工程的第二步构建基因表达的载体，即把用同一种限制酶处理的目的基因与运载体混合，再加入DNA连接酶，使DNA片段相同的黏性末端能够连接起来，因为这些DNA 片段有相同的黏性末端，所以在DNA连接酶的作用下，必然形成一个封闭式的环状DNA。
这些环状DNA有的是由一个DNA片段形成的，共有两种，即目的基因环状物和运载体环状物；有的是由两个DNA片段形成的，共有三种，即目的基因—载体连接物、载体—载体连接物、目的基因—目的基因连接物。
如何从如此多的环状物中找出具有目的基因的重组质粒呢？我们通过下面例题进行分析。
【例】图1是将人的生长激素基因导入细菌B细胞内制造“工程菌”的示意图。
已知细菌B细胞内不含质粒A，也不含质粒A上的基因。
判断下列说法正确的是（）A．将重组质粒导入细菌B常用的方法是显微注射法B．将完成导入过程后的细菌涂布在含有氨苄青霉素的培养基上，能生长的只是导入了重组质粒的细菌C．将完成导入过程后的细菌涂布在含有四环素的培养基上，能生长的就是导入了质粒A 的细菌D．目的基因成功表达的标志是受体细胞能在含有氨苄青霉素的培养基上生长。
【解析】筛选含目的基因的受体细胞，首先要选择质粒。
如图2所示本题中所选用的质粒A，同时具有青霉素抗性基因和四环素抗性基因，在操作中将目的基因插入到了四环素抗性基因中，这样将导致四环素基因不能表达。
在进行导入操作中，质粒自连的环状DNA和重组质粒都可以导入受体细胞，而目的基因自连环状DNA则不能导入，因此在导入操作后，混合物中有3种细胞：即多数没有导入任何质粒的受体细胞（普通细胞）、导入普通质粒（不含目的基因）的细胞和导入重组质粒的受体细胞（获得目的基因）。
第一次筛选：将含有三细胞的混合物接种在含青霉素的选择培养基中培养，由于普通细胞不含有抗性基因，能够将导入普通质粒和重组质粒的受体细胞选出。
第二次筛选：采用影印接种法，即用一小块灭菌的丝绒固定在直径较平板略小的圆形木块上，构成印章（接种工具，图3A所示）；然后把前述经过第一次筛选长出菌落的母板倒置在丝绒的印章上，轻轻印一下（图3B）；再把此印章在另一个含四环素的选择培养基（图3D）的平板上印一下。
获得目的基因的方法
常用的方法有P1
就是从酶，DNA进行部分酶解，得到DNA限制性片段②选用适当的限制性内切酶酶解λ噬菌体载体DNA。③经适当处理，将基因组DNA限制性片段与λ噬菌体载体进行体外重组。④利用体外包装系统将重组体包装成完整的颗粒。⑤以重组噬菌体颗粒侵染大肠杆菌，形成大量噬菌斑，从来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断；可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研究和检测鉴定。过去几天几星期才能做到的事情，用PCR几小时便可完成。PCR技术是生物医学领域中的一项革命性创举和里程碑
3.
最常用的方法是“鸟枪法”，又叫“散Байду номын сангаас射击法”。
这种方法有如用猎枪发射的散弹打鸟，无论哪一颗弹粒击中目标，都能把鸟打下来。鸟枪法的具体做法是：用限制酶（即限制性内切酶）将供体细胞中的DNA切成许多片段，将这些片段分别载入运载体，然后通过运载体分别转入不同的受体细胞，让供体细胞所提供的DNA（外源DNA）的所有片段分别在受体细胞中大量复制（在遗传学中叫做扩增），从中找出含有目的基因的细胞，再用一定的方法吧带有目的基因的DNA片段分离出来。如许多抗虫，抗病毒的基因都可以用上述方法获得。
用“鸟枪法”获取目的基因的优点是操作简便，缺点是工作量大，具有一定的盲目性。
二、人工合成
1
主要针对是序列已知的基因，通过DNA自动合成仪，通过固相亚磷酸酰胺法合成，可以按照已知序列将核苷酸一个一个连接上去成为核苷酸序列，一般适于分子较小而不易获得的基因。对于大的基因一般是先用化学合成法合成引物，再利用引物获得目的基因录而成的cD是，在真核生物基因组中合有大量的间隔序列或内含子，但在大肠杆菌等原核生物中没有类似序列的存在，所以大肠杆菌不能从真核生物基因的初级转录本中去除间隔序列，即不能表达真核生物DNA。而在真核生物成熟mRNA中已不存在间隔序列（已在拼接过程中被去除），所以可以以真核生物成熟mRNA为模板，逆转录而成的cDNA可被大法。
筛选标记和目的基因
1.2 β- 半乳糖苷酶基因（β-galactosidase ） β-半乳糖苷酶 是大肠杆菌乳糖操纵子中 lacZ 基因的产物，在遗
传学、 细胞生物学和分子生物学研究中广泛应用于监测和校正转染
效率 . β-半乳糖苷酶能催化包括乳糖在内的各种半乳糖苷的水解. 大 肠杆菌β-半乳糖苷酶比较稳定，易于检测且无需放射性元素，相对 浓度低至 1 amol 都可以被检测出。
1.新霉素磷酸转移酶 II(NPT II)(npt II)
nptⅡ基因最初是从大肠杆菌
转座子 Tn5 中分离得到的， 即氨基糖苷磷酸转移酶 Ⅱ 基因， 它编
码的氨基糖苷磷酸转移酶使抗生素被磷酸化而失活。因此 nptⅡ基 因作为筛选标记基因可以使转化细胞对抗生素如卡那霉素、 G418、 巴龙霉素、 新霉素等产生抗性， 进而达到筛选的效果。目前， 该 基因仍是植物基因工程中运用很广泛的选择标记基因。 2.潮霉素磷酸转移酶(HPT)(hpt) 从大肠杆菌中分离出来的 hpt 基因
筛选标记基因遗传转化得到的转基因植株能够种植在重金属污染的
土壤中。
9.氨基糖苷腺苷酰转移酶基因(aadA)
双子叶植物叶绿体转化多采
用 aadA 基因， 用壮观霉素(spectinomycin)进行筛选， 获得同质叶
绿体转化细胞的筛选周期不同受体材料差异很大， 分化植株的前期
筛选一般 2 ～8 个月， 甜菜叶绿体转化筛选8 个月后才分化植株 。 棉花叶绿体转基因从枪击受体胚性愈伤到获得同质叶绿体转基因植 株则长达 18 个月 。单子叶禾本科植物对壮观霉素具有天然抗性， 因此， 水稻叶绿体转化时 aadA 基因的筛选采用链霉素， 链霉素的
调控。 报告基因的基本单元包括启动子和报告基因两个部分。其中报告基 因编码易检测蛋白或酶，而启动子则调控序列表达。
课件2：3.2.1 目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建
因 文
单链互补DNA
库 （
DNA聚合酶催化
如
双链cDNA片段
cDNA
与载体连接
文
导入受体菌中储存
库
）
体内全部DNA
限制酶
许多DNA片段
与运载体连接导入受体菌群体 基因组某种生物某个时期的mRNA
反转录
cDNA
与运载体连接导入受体菌群体 部分基因（cDNA）PCR技术
DNA复制
碱基互补配对
四种脱氧核苷酸
模板、能量、酶
解旋方式 DNA在高温下变性解旋
不 场所 同 点酶
结果
体外复制 耐高温的DNA聚合酶
大量的DNA片段
解旋酶催化
细胞内（主要在细胞核内） 解旋酶、DNA聚合酶 形成整个DNA分子
第
二
基关于因公表司达载体的构建
步
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使DNA聚合酶能够从引物3′端开始连接脱氧核苷酸
3 扩增方式： 以指数方式扩增，即__2_n_（n为扩增循环的次数）
4 扩增过程：
4 扩增过程：
PCR扩增的计算：
（1）若开始只有一个DNA提供模板，则循环n次后获得的 子代DNA数目为 2n 个。 （2）若开始有N0个DNA提供模板，则循环n次后获得的子 代DNA数目为 N0∙2n个。
〘思考〙用DNA连接酶处理后会出现几种产物？
如何避免质粒的自我环化和目的基因反向连接的问题？
质粒
目的基因
将同一种限制酶切割获得的目的基因和质粒混合后加DNA连接酶会出现的
连接方式有：
目的基因自连
自连
目的基因
质粒自连 目的基因与质粒连接
质粒
目的基因的筛选和鉴定方法有几种
目的基因的筛选和鉴定方法有几种目前，对于目的基因的筛选和鉴定方法有多种。
这些方法涵盖了从基因库中高通量筛选到基因序列分析的多个方面。
下面将介绍一些常用的筛选和鉴定目的基因的方法。
1. 克隆与基因文库筛选克隆与基因文库筛选是一种最常见的方法，适用于突变体或陌生基因的鉴定。
该方法基于将多个基因或突变体克隆到载体上，并通过对每个克隆体的筛选和鉴定来确定目的基因。
常见的技术包括限制性片段长度多态性(RFLP)分析、序列比对和Southern印迹等。
2. PCR扩增和测序PCR扩增和测序是一种高效的方法，适用于特定基因的筛选和鉴定。
通过设计引物来扩增目的基因的特定区域，并通过测序分析来确认目的基因的存在和序列。
PCR扩增和测序方法广泛应用于基因突变分析、基因表达差异鉴定等方面。
3. 蛋白质互作筛选蛋白质互作筛选是一种重要的方法，适用于鉴定与目的基因相互作用的蛋白质。
常见的蛋白质互作筛选方法包括酵母双杂交、GST pull-down和共沉淀等。
这些方法通过使用目的基因表达的融合蛋白或亚细胞定位标记来筛选与目的基因相互作用的蛋白质。
4. 表达差异分析表达差异分析是一种用于鉴定目的基因表达差异的方法，广泛应用于基因调控研究和疾病相关基因的鉴定。
常见的表达差异分析方法包括差异表达基因分析、差异外显子使用分析、差异剪切事件分析等。
这些方法通过比较不同组织、时间点或处理条件下基因的表达差异来鉴定目的基因。
5. 功能验证和鉴定功能验证和鉴定方法用于评估目的基因的功能和作用机制。
常见的方法包括转基因动物模型构建、RNA干扰和基因敲除等。
这些方法通过改变目的基因的表达或功能来确定其对生物体的影响，并进一步研究其作用机制。
总结起来，目的基因的筛选和鉴定方法包括克隆与基因文库筛选、PCR扩增和测序、蛋白质互作筛选、表达差异分析以及功能验证和鉴定等多种方法。
这些方法在基因研究的不同方面发挥着重要作用，并为我们深入了解基因的功能和表达调控提供了有效的手段。
目的基因的检测与鉴定的方法
目的基因的检测与鉴定的方法
目的基因的检测与鉴定的方法主要有以下几种：
1. 分子水平的检测：
利用PCR等技术检测转基因生物的DNA中是否插入了目的基因。
利用PCR等技术检测转基因生物的DNA中的目的基因是否转录出了mRNA。
检测目的基因是否翻译出了蛋白质，进行抗原—抗体杂交。
2. 生物学水平鉴定：对个体生物学水平的鉴定，如对转基因生物进行抗性接种实验，检测其是否具有抗性及抗性程度。
这些方法可以确保目的基因成功导入受体细胞并稳定存在。
请注意，这些检测与鉴定方法需要结合具体的实验条件和要求进行选择和应用。
获得大量目的基因的方法有哪些
获得大量目的基因的方法有哪些
获得大量目的基因的方法有以下几种：
1. PCR扩增：利用特定引物对目的基因进行扩增，从而获得大量目的基因。
这种方法需要已知目的基因序列信息作为PCR引物的设计依据。
2. 基因克隆：将目的基因插入载体（如质粒或噬菌体），然后通过细菌转化等方法在大量细胞中复制目的基因。
3. 多聚酶链式反应（multiplex PCR）：通过引物的多元化设计，在一次PCR反应中同时扩增多个目的基因。
4. 筛选基因库：对具有某种特定基因组或基因片段的大量细胞进行筛选，从中得到大量目的基因。
5. 基因合成：利用化学合成的方法，按照目的基因的序列信息合成完整的目的基因。
6. 基因放大：通过使用细胞系或者动物模型等方法，人工放大目的基因以获得大量目的基因。
需要注意的是，以上方法适用于不同的研究目的和实验条件，选择合适的方法需
要考虑实验要求、操作难度、成本等因素。
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基因文库中目的基因的筛选
克隆基因的方法有很多，根据研究基础的不同，可以使用以下的方法克隆目的基因：
1. PCR或RT-PCR法
2. 从基因文库中分离基因
3. 从cDNA文库中分离基因
4. 转座子标签法
5. 图位克隆法
6. 差减杂交法、扣除杂交、差异显示法
7. 人工合成法
本章中主要介绍从基因文库中筛选目的基因的几种方法。
获的目的克隆的方法有两种
1）目的基因的直接选择
2）从基因文库中筛选
称为鸟枪射击法，建立一个包含所有基因或大部分基因的克隆，从中筛选目的克隆。
一、直接选择
直接选择的基因比较少，如抗生素抗性基因。
如克隆一个kan抗性基因，在R6-5质粒上含有四种抗性基因：kan, 氯霉素、链霉素、硫胺类药物，kan抗性基因存在于13个EcoRI片段中的一段中。
将R6-5的片段插入pBR322的EcoRI位点中，连接混合物中将含有13个不同片段的大量重组拷贝，其中部分是kan抗性的。
只有含kan的克隆才能在含有kan的培养基上正常生长。
1.1 标记援救可以扩大直接选择的范围
利用E. coli的突变系可扩展该项技术。
例如要从E. coli中克隆trpA基因，编码色氨酸合成
酶，一个突变系不能合成色氨酸，只有加入色氨酸后才能存活。
因此E. coli的突变体可以用来克隆trpA基因。
首先从一个正常个体中提取总DNA，然后酶切，连接产生大量重组DNA分子，其中一个将携带完整的trpA基因。
连接混合物用来转化缺陷型E. coli细胞，大部分转化子是缺陷型的，携带trpA的重组子将是野生型的，可以在基本培养基上生长。
1.2 标记援救的范围和限制
存在两个限制因素：
1）必须存在着目的基因的突变品系
2）需要一种只有野生型能够生长的培养基。
一般而言，标记援救适用于微生物的合成酶，可以在基本培养上选择。