遗传毒性试验
遗传毒性评价Ames试验方法的比较分析
•672 •第 44 卷第 3 期2021 年3 月《袷Drug Evaluation Research Vol. 44 No. 3 March 2021遗传毒性评价Ames试验方法的比较分析高梅“2,曹冲、王功霞\马会\英永”1.山东省药学科学院山东省化学药物重点实验室，山东济南2501012.山东师范大学生命科学学院山东省动物抗性生物学重点实验室，山东济南250014摘要：A m e s试验是一项体外致突变性试验，被广泛用于药物、食品、化学品和农药的遗传毒性检测，以评价受试物致突 变的可能性。
药物、食品、化学品和农药的指导原则和国家标准中A m e s试验方法不尽相同，就这几者A m e s试验方法的主 要异同点进行比较分析，以期能熟练掌握A m e s试验实施要点，更加规范实施检测工作，不断提高试验质量。
关键词：A m e s试验；药物；食品；化学品；农药中图分类号：R962.2 文献标志码：A文章编号：1674-6376 (2021) 03-0672-05D O I：10.7501/j.issn. 1674-6376.2021.03.031Comparison and analysis of Ames test for genotoxicity evaluationGAO Mei12,CAO Chong1,WANG Gongxia1,MA Hui1,YING Yong11. S h a n d o n g A c a d e m y of Pharmaceutical Sciences, S h a n d o n g Provincial K e y Laboratory of C h e m i c a l Drug, Jinan 250101, China2. S h a n d o n g N o r m a l University, College of Life Sciences, S h a n d o n g Provincial K e y Laboratory of A n i m a l Resistance Biology,Jinan 250014, ChinaA b str a c t:A m e s test is a mutagenicity test in vitro, w h i c h i s widely used in the detection of genotoxicity of drugs, food, chemicals and pesticides to evaluate the possibility of mutagenicity of test substance. T h e guiding principles an d national standards of A m e s test on drugs, food, chemicals and pesticidesand are different. In this paper, the m a i n similarities and differences w ere c o m p a r e d and analyzed in order to master the key points of A m e s test implementation, so w e can i m p l ement the testing w o r k standardly and improve the test quality constantly.K ey w o r d s:A m e s test; drugs; food; chemicals; pesticides细菌回复突变试验又称Am es试验，是一项检 测基因突变的体外致突变性试验，以评价受试物致 突变的可能性。
遗传毒性试验-动物中心
致突变试验：根据受试物的化学结构、理化性质及对遗传物质作用终点（基因突变和染色体畸变）的不同。
要求新药必须做下列三项试验。
（１）微生物回复突变试验菌株：组氨酸缺陷型鼠伤寒沙门氏菌（Ｓｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）四株（ＴＡ９７、ＴＡ９８、ＴＡ１００、ＴＡ１０２），亦可采用大肠杆菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）ＷＰ２若干株（大肠杆菌试验）。
剂量：决定受试物最高剂量的标准是细菌毒性和溶解度。
一般最大剂量可达５ｍｇ／皿。
受试物至少应有五种不同剂量否则应说明选定剂量的理由。
代谢活化：应用诱导剂处理后的哺乳动物肝脏微粒体酶（Ｓ９）进行体外代谢活化试验，即在加Ｓ９混合物和不加Ｓ９混合物平行的条件下测试。
对照组：用溶媒作阴性对照，用已知突变原作阳性对照。
结果判定：受试物的回复突变菌落数的增加与剂量相关并有统计学意义，或至少某一测试点呈现可重复的并有统计学意义的阳性反应时记为阳性。
（２）哺乳动物培养细胞染色体畸变试验细胞：哺乳动物原代或传代培养细胞。
剂量：至少应用三种不同剂量，高剂量以５０％细胞生长抑制浓度为基准，否则应说明选定剂量的理由。
标本制作时间：药物与细胞接触后应有适当时间最好包括整个细胞周期，通常在药物处理后２４和４８小时制作染色体标本。
代谢活化：应用适当的代谢活化法。
对照组：用溶媒作阴性对照，已知突变原作阳性对照。
镜检：每种浓度至少观察１００个中期分裂相细胞的染色体结构的异常及多倍体的出现率。
结果判定：受试物诱发的染色体畸变的出现率较阴性对照有统计学意义的增加，并有剂量反应关系时记为阳性，同时标明异常细胞出现的频度和种类。
（３）体内试验一般选用微核试验，但作用于生殖系统的药物进行显性致死试验等。
ａ．啮齿类动物微核试验动物：一般用小鼠，每组１０只性成熟动物（雌雄各半）或至少６只性成熟雄性动物。
给药剂量及途径：至少采用三种剂量，最高剂量从１／２ＬＤ５０为基准，腹腔和／或口服一次给药，必要时可连续给药。
否则应说明选定剂量的理由。
农药登记的各类毒性试验要求(下)
化 学品或环境 因素造成遗传 毒性 的机 制主要有 ：
Ｄ Ｎ Ａ损伤 、Ｄ Ｎ Ａ修 复与 突变 、整 倍体 和非 整倍体 的形 Ｒ ｅ ｐ ａ ｉ ｒ ／ Ｕ ｎ ｓ ｃ ｈ ｅ ｄ ｕ ｌ ｅ ｄ Ｄ Ｎ Ａ Ｓ ｙ ｎ ｔ ｈ ｅ ｓ ｉ ｓ ｉ ｎ Ｍ ａ ｍ ｍ ａ ｌ Ｊ ａ ｎ
，
遗传信息改变
基 因 突 变 方 向
错义突变 无义突变 正 向 突 变 回 复 突 变
从而 出现染色体 结构异 常，成 为染色 体改变 。整数倍体改变可 以有二倍体 、三倍体或 体畸变或染色体 结构畸变 。 四倍体 。
０ Ｉ 衷化市埸Ｉ ｏ＠０农 化 行 业 资 深 媒 体 １ ８ ／ ７ ２ ６
ｌ 埸 Ｉ 农 化
木本刊特 稿 木
农药登记 的各 类毒性 试验要求 （ 下）
３ ．遗传毒性试验 （ ｇ ｅ ｎ ｏ ｔ ｏ ｘ ｉ ｃ ｉ ｔ ｙ ｔ ｅ ｓ ｔ ）
般 采 用组 合 材料 方 式，如 利用 病 毒、细 菌 、真菌 、
培 养 的哺 乳 动物 细胞 、植物 、 昆虫和 哺 乳动 物等 。
成等 。 Ｃ ｅ ｌ ｌ ｓ ｉ ｎ ｖ ｉ ｔ ｒ ｏ ） ， 小 鼠斑 点试 验 （ Ｍ ｏ ｕ ｓ ｅ Ｓ ｐ ｏ ｔ
遗传 毒性造成 的后果有 多种 。体细胞 突变的后果 Ｔ ｅ ｓ ｔ ）， 小 鼠可 遗 传 易 位 试 验 （ Ｍ ｏ ｕ ｓ ｅ Ｈ ｅ ｒ ｉ ｔ ａ ｂ ｌ ｅ
农药 的遗传 毒性 目的就是 阐明农 药对人及生物体遗传 乳动物 细 胞姐 妹染 色 单体 互换 体外 试 验 （ Ｉ ｎ ｖ ｉ ｔ ｒ ｏ 物质潜在 的危 害作用 ， 建立预警机制 ， 采取干预措施 ，
确保人类健康 和生物 安全及生态平衡 。
保健食品安全性毒理学评价试验的四个阶段和内容
保健食品安全性毒理学评价试验的四个阶段和内容发布日期：2021-04-03浏览次数:1605字号：[大中小]毒理试验的四个阶段和内容1第一阶段：急性毒性试验口服急性毒性：LD50，联合急性毒性，一次性最大耐受性受量试验。
二阶段II：遗传毒性试验，30天喂养试验，传统畸试验遗传毒性试验的组合应考虑原核和真核细胞的结合原理，体内试验和体外试验。
来自Ames试验或V79/HGPRT基因突变试验、骨髓细胞微核试验或哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验、4.1.2.3或4.1.2.4试验别各选一项。
2.1基因突变试验：首选鼠伤寒沙门氏菌/哺乳动物微粒体酶试验（Ames试验），其次是V79/HGPRT基因突变试验，必要时可另选其它试验。
2.2骨髓细胞微核试验或哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验。
2.3tk基因突变试验。
2.4小鼠精子畸形分析或睾丸染色体畸变分析。
2.5其它备选遗传毒性试验：显性致死试验、果蝇伴性别隐性致死试验，非程序DNA合成试验。
2.630天喂养试验。
2.7传统致畸试验。
三第三阶段：亚慢性毒性试验-90天喂养试验和繁殖试验殖试验、代谢试验四第四阶段：慢性毒性试验（包括致癌试验）1、药物的毒性试验分为两类，其一特殊毒性试验，包含致癌、致残、致突变，号称三致试验；作此试验的单位必须是国家指定并认可的；一般单位即使做了也不被国家认可！通常一类创新药必须做的。
无论一个药物的药效如何好，只要含有三致试验的特殊毒性（动物若干代繁殖后，查看），该药物将不会允许上市的。
2、其二，一般毒性试验，通常用老鼠或兔子去做，主要是测定半数致死量；若某个药物的半数致死量是有效使用剂量的2倍以上，通常认为是临床使用安全的，若半数致死量比有效剂量略大一点，那就谁也不敢使用了，万一略微超一点量就会导致患者死亡！。
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2. 图像分析：溴化乙啶染色-荧光显微镜荧光激发-ccd成像-专用分析软件分析-数据统计分析结果十个样品以下：500元；10个样品以上，每增加一个样品，加收20元彗星试验的应用1遗传毒性试验彗星试验是一系列评定新药和其它化学物平安性的标准试验。
被广泛用于体外实验；组织和白细胞可以被分解为单细胞悬液，提供了实验材料。
通常我们用形式简单的彗星试验来检测DNA断裂，增高的敏感性以及作用机制的附加信息由于用内切酶来测定特定类型的损害而增加。
同样也可在细胞培养系统评价遗传毒性，可单纯用这一系统或者与可为化学物代谢为活性形式提供酶类的肝微粒体‘S9’片段的结合来检测。
另一方面是其化学保护作用的研究：例如彗星试验特别适合于植物化学物保护细胞免受遗传毒性刺激的研究。
2生态学监测适宜的生物可以和彗星试验联合，作为有遗传毒物污染环境的生物传感器。
药物遗传毒性研究技术指导原则
附件四药物遗传毒性研究技术指导原则药物遗传毒性研究技术指导原则一、概述遗传毒性研究（Genotoxicity Study）是药物非临床安全性评价的重要内容，它与其他毒理学研究尤其是致癌性研究、生殖毒性研究有着密切的联系，是药物进入临床试验及上市的重要环节。
拟用于人体的药物，应根据受试物拟用适应症和作用特点等因素考虑进行遗传毒性试验。
遗传毒性试验是指用于检测通过不同机制直接或间接诱导遗传学损伤的受试物的体外和体内试验，这些试验能检出DNA损伤及其损伤的固定。
以基因突变、较大范围染色体损伤、重组和染色体数目改变形式出现的DNA损伤的固定，一般被认为是可遗传效应的基础，并且是恶性肿瘤发展过程的环节之一（这种遗传学改变仅在复杂的恶性肿瘤发展变化过程中起了部分作用）。
在检测此类损伤的试验中呈阳性的化合物为潜在致癌剂和/或致突变剂，即可能诱导癌和/或遗传性疾病。
由于在人体中已建立了某些化合物的暴露和致癌性之间的关系，而对于遗传性疾病尚难以证明有类似的关系，故遗传毒性试验主要用于致癌性预测。
但是，因为已经确定生殖细胞突变与人类疾病有关，所以对可能引起可遗传效应的化合物与可能引起癌症的化合物应引起同样的关注；此外，这些试验的结果可能还有助于解释致癌性的机制和试验结果。
因此，在药物开发的过程中，遗传毒性试验的目的是通过一系列试验来预测受试物是否有遗传毒性，在降低临床试验受试者和药品上市后使用人群的用药风险方面发挥重要作用。
本指导原则重点阐述遗传毒性试验体内外试验的基本原则，并介绍标准试验组合方案，以及对试验结果的综合分析及评价。
本指导原则适用于中药、天然药物和化学药物的遗传毒性试验研究。
二、基本原则（一）实验管理药物的遗传毒性试验属于安全性评价研究，根据《中华人民共和国药品管理法》的规定，必须执行《药物非临床研究质量管理规范》。
（二）具体问题具体分析遗传毒性试验的设计，应该在对受试物认知的基础上，遵循“具体问题具体分析”的原则。
ICH关于遗传毒性体外、体内试验的建议--ICHS2(R1)人用药物遗传毒性试验和结果分析指导原则介绍(二)
发布日期20080729栏目化药药物评价>>综合评价ICH关于遗传毒性体外、体内试验的建议--ICHS2（R1）人用药物遗传毒性标题试验和结果分析指导原则介绍（二）作者黄芳华部门正文内容审评二部黄芳华前文已介绍了ICH关于遗传毒性标准试验组合的要求，以下介绍ICHS2（R1）Guidance on Genotoxicity Testing and Data Interpretation forPharmaceuticals Intended for Human Use（人用药物遗传毒性试验和结果分析指导原则）中关于体外、体内试验的建议。
一、对体外试验的建议1、试验重复和分析实验结果的重现性是涉及新方法或意外发现的研究的基本组成部分。
但是，用标准的、已广泛应用的遗传毒性试验进行常规试验时往往不需要完全重复。
这些试验都经过很好的充分验证且有有效的内部控制，对明确的阳性或阴性结果试验通常不需要重复。
理想状态是可明确宣称试验结果是明确的阳性或明确的阴性。
但是，试验结果有时达不到阳性或阴性称谓的预先设定的标准，因此被定为“可疑”。
统计学方法的应用有助于数据分析；但是，充足的生物学分析是至关重要的。
可疑试验的重复可致(i) 一个明确的阳性结果，因此作为整体阳性结果；(ii) 一个阴性结果，所以结果不需要重复和总体结果为阴性；或(iii)另一个可疑的结果，最后结论仍维持可疑。
2、对细菌突变试验的推荐方案OECE指导原则（1997）和IWGT报告(Gatehouse et al, 1994) 给出了对方案的建议。
2.1 高剂量水平的选择最高剂量水平当不受溶解度或细胞毒性限制时，推荐最高浓度为5000µg/皿。
溶解度的限制对于细菌培养，如果沉淀不干扰评分应对沉淀量进行评分，毒性不限制，最高剂量不超过5000µg/皿。
有证据表明在用细菌遗传毒性试验检测某些受试物时，在不溶解的浓度范围内也能检测出剂量相关性的遗传毒性。
农药登记毒理学试验方法
农药登记毒理学试验方法农药是一种用于保护农作物、畜牧、林业以及家庭中害虫、草药和微生物的化学物质。
由于农药的使用会产生潜在的环境和人类健康风险，因此，对于农药的授权需要进行严格的评估和审批过程。
其中，毒理学试验方法是评估农药对生物毒性的主要工具之一。
毒理学试验方法是基于生物学理论和毒性机制的，可分为急性毒性和慢性毒性试验。
急性毒性试验通过直接暴露测试对象（如实验室动物和细胞）来评估化合物在短时间内对生物的影响。
慢性毒性试验则更关注长期使用农药对人类和环境的影响，因此需要更长的试验时间。
以下是几种常用的毒理学试验方法：1.急性毒性试验急性毒性试验一般应用于生物体内某些口服、吸入或皮肤接触的化学物质，试验结果可以产生毒性分类标准和确定最大容忍剂量（MDT），从而确认农药使用的安全性。
目前国际通行的急性毒性试验是斯图尔特法。
斯图尔特法是使用实验动物体内的Lethal Dose（LD）作为毒性的指标，其安全系数根据不同物种和试验组进行调整。
2.染色体畸变试验染色体畸变试验通过评估农药对动植物细胞核DNA的影响来评估农药的致突变效应。
这些效应包括染色体片段、染色体断裂、染色体畸变等。
该试验是在实验室中使用动植物细胞的分裂期进行的。
3.遗传毒性试验遗传毒性试验通过评估农药对DNA的影响来评估其致突变效应。
与染色体畸变试验不同，遗传毒性试验可以检测出突变后DNA序列的改变。
此次试验一定会使用实验动物进行。
4.慢性毒性试验慢性毒性试验的设计是为了持久性接触或摄入导致的毒性。
gavage试验和繁殖试验是用于进行此类试验的一种环节。
长期饮用毒性实验是毒理学试验中使用的最常见的方法之一。
它的主要目的是评估长时间使用农药对生物的健康影响。
这种试验可以进行几个月甚至几年的长期暴露。
总体而言，农药的毒理学试验方法是在安全性评估中不可避免的一环。
通过这些试验，我们可以更好地理解和掌握该物质的潜在危险。
然而，毒理学试验环节需要仔细设计，以使试验结果有实用意义，同时避免动物的不必要痛苦和伤害。
遗传毒性试验专题负责人
80、2007.12.20王建华血液与造血系统药理
81、2007.12.17-18药品注册变革与产品开发策略研讨班
杜冠华：药品注册变革
杜冠华：我国新药研发现状述评
杜冠华：神经血管单元与抗脑缺血新药研发
马百平：中药创新药的研发策略及实践
张天宝：遗传毒理学在药物毒性研究中的若干进展
51、2007.08.16李连达中药安全性与合理用药
52、2007.08.30刘姝总结报告的撰写规范
53、2007.08.30王建华复方苯磺酸左旋氨氯地平瑞舒伐他汀钙课题报告
54、2007.08.31刘姝总结报告书的撰写与格式要求
55、2007.09.04刘兆平项目协调与进展
2、PT141遗传毒性试验（ames试验、动物微核试验、染色体畸变试验）
3、大豆异黄酮提取物遗传毒性实验（ames试验、动物微核试验、染色体畸变试验）
4、金丝桃苷遗传毒性试验（ames试验、动物微核试验、染色体畸变试验）
5、左旋奥硝唑磷酸二钠遗传毒性试验（ames试验、动物微核试验、染色体畸变试验）
82、2008.01.08刘兆平课题绩效奖励办法
83、2008.01.18刘兆平管理制度
84、2008.03.15张海艇GLP仪器管理
85、2008.04.05刘兆平GLP管理的一些体会
刘兆平GLP建设经验与存在问题
刘兆平GLP实验室规范管理与实施运行
刘兆平GLP机构建设实践与思考
刘兆平对GLP中FM的理解
12、2006.08.21刘兆平：口服改注射毒评价原则
13、2006.08.21刘兆平：药理毒理技术审评思路
14、2006.08.23刘兆平：一般毒理评价原则
ames试验的原理和应用
Ames试验的原理和应用原理Ames试验是一种常用的遗传毒性测试方法，用于评估化学物质的致突变活性，即其对基因突变的潜在影响。
首次由Bruce Ames等人在20世纪70年代开发，作为一种快速、简便和经济的方法，Ames试验在毒理学领域得到广泛应用。
Ames试验基于细菌的基因突变现象，采用Salmonella菌株作为试验对象。
其中使用的菌株往往具有某种突变，使其无法合成氨基酸的能力。
通过将试验物与突变基因菌株接触，若试验物具有致突变活性，将导致原本无法合成氨基酸的细菌恢复其自我养活的能力。
通过观察细菌的生长，可以评估试验物对基因突变的潜在危害性。
应用Ames试验被广泛用于检测化学物质的致突变活性，可以有效地帮助人们判断其对生物体的潜在毒性。
以下是Ames试验的常见应用场景：1.药物研发：在药物研发过程中，Ames试验被用来评估候选药物是否具有突变性，从而帮助研发人员选择最安全的药物候选物。
2.食品添加剂评估：在食品工业中，Ames试验可以用来评估添加剂对人体基因的潜在突变危害，以确保食品的安全性。
3.化学品安全评估：Ames试验也被广泛用于化学品的安全评估，特别是对于接触频繁的职业环境中使用的化学品。
4.环境监测：Ames试验可以用来评估环境中的化学物质对生物体的潜在突变危害，帮助监测环境质量和提高环境保护意识。
5.遗传学研究：Ames试验作为一种快速、简便的遗传毒性测试方法，被广泛应用于基因突变研究领域，以增进对基因变异机制的理解。
Ames试验的优点和局限性优点•快速：Ames试验可以在较短的时间内得出初步的结果，节约了研究时间和成本。
•简便：Ames试验的操作相对简单，无需复杂的设备和高级实验技术。
•经济：Ames试验所需的材料和试剂成本低，适用于大规模筛选。
局限性•仅适用于细菌：Ames试验基于细菌突变，不能直接对多细胞生物进行评估，因此需要进一步的研究来验证其结果。
•无法考虑代谢产物：Ames试验无法考虑化学物质在生物体内的代谢过程和产物，可能会导致一些评估结果的偏差。
毒理学评价实验的主要内容
毒理学评价实验的主要内容毒理学评价实验是评估物质对生物体可能产生的不良影响的重要手段。
以下是毒理学评价实验的主要内容：1.受试物的形态学观察在毒理学评价实验中，首先需要对受试物进行形态学观察，以了解其外观、颜色、气味、结晶等物理性质。
此外，还需观察受试物的稳定性、溶解度等化学性质，以便更好地了解其可能对生物体产生的影响。
2.急性毒性试验急性毒性试验是评估受试物在短期大量接触后对生物体产生的影响。
通过测定受试物对生物体产生毒性效应的剂量和时间关系，为后续的毒性试验提供参考。
3.遗传毒性试验遗传毒性试验是评估受试物对生物体遗传物质的影响。
通过检测受试物对生物体基因突变、染色体畸变等的影响，评估其潜在的致癌性。
4.发育毒性试验发育毒性试验是评估受试物对胎儿或婴儿生长发育的影响。
通过观察受试物对妊娠期妇女、胎儿及婴儿生长发育的影响，评估其安全性。
5.慢性毒性试验慢性毒性试验是评估受试物在长期接触后对生物体的影响。
通过观察受试物对生物体脏器功能、生理生化指标等的影响，评估其长期使用的安全性。
6.致癌性试验致癌性试验是评估受试物是否具有致癌性的实验。
通过观察受试物对生物体肿瘤发生的影响，评估其致癌风险。
7.免疫毒性试验免疫毒性试验是评估受试物对生物体免疫系统的影响。
通过检测免疫器官、细胞数量、功能等指标，评估受试物对免疫系统的损害程度。
8.生殖毒性试验生殖毒性试验是评估受试物对雄性或雌性生殖系统的影响。
通过观察受试物对性成熟、繁殖能力等的影响，评估其对生殖系统的损害程度。
综上所述，毒理学评价实验的主要内容包括受试物的形态学观察、急性毒性试验、遗传毒性试验、发育毒性试验、慢性毒性试验、致癌性试验、免疫毒性试验以及生殖毒性试验等方面。
通过对这些方面的综合评估，可以全面了解受试物对生物体的影响，为产品的安全性评价提供科学依据。
药物遗传毒性研究技术指导原则
药物遗传毒性研究技术指导原则药物遗传毒性研究技术指导原则一、概述遗传毒性研究（GenotoxicityStudy）是药物非临床安全性评价的重要内容，与其他研究尤其是致癌性、生殖毒性等研究有着密切的联系，是药物进入临床试验及上市的重要环节。
拟用于人体的药物，应根据受试物拟用适应症和作用特点等因素考虑进行遗传毒性试验。
遗传毒性试验是指用于检测通过不同机制直接或间接诱导遗传学损伤的受试物的体外和体内试验，这些试验能检测出DNA损伤及其损伤的固定。
以基因突变、较大范围染色体损伤或重组形式出现的DNA 损伤的固定，通常被认为是可遗传效应的基础，并且是恶性肿瘤多阶段发展过程的重要因素（恶性肿瘤发展变化是一个复杂的过程，遗传学改变可能仅在其中起部分作用）。
染色体数目的改变也与肿瘤发生有关，并可提示生殖细胞出现非整倍体的可能性。
在遗传毒性试验中呈阳性的化合物为潜在的人类致癌剂和/或致突变剂。
由于在人体中已建立了某些致突变/遗传毒性化合物的暴露与致癌性之间的相关性，而对于遗传性疾病尚难以证明有类似的相关性，因此遗传毒性试验主要用于致癌性预测。
但是，因为生殖细胞突变与人类疾病具有明确的相关性，所以也应同样重视化合物引起潜在可遗传性效应的风险。
此外，遗传毒性试验结果可能对致癌性试验的结果分析有重要作用。
因此，在药物开发的过程中，遗传毒性试验的目的是通过一系列试验来预测受试物是否有遗传毒性，在降低临床试验受试者和药品上市后使用人群的用药风险方面发挥重要作用。
本指导原则重点阐述遗传毒性试验的基本原则，介绍标准试验组合方案，阐述体内外试验的基本原则，以及对试验结果的分析评价与追加研究策略。
本指导原则适用于中药、天然药物和化学药物。
二、基本原则（一）实验管理药物遗传毒性试验必须执行《药物非临床研究质量管理规范》（GLP）。
（二）具体问题具体分析遗传毒性试验的设计，应该在对受试物认知的基础上，遵循“具体问题具体分析”的原则。
应根据受试物的结构特点、理化性质、已有的药理毒理研究信息等选择合理的试验方法，设计适宜的试验方案，并试验结果进行全面的分析与评价。
药物遗传毒性研究技术指导原则
附件四则编号:药物遗传毒性研究技术指导原则药物遗传毒性研究技术指导原则一、概述遗传毒性研究(Genｏtｏｘiｃiｔy Study)是药物非临床安全性评价的重要内容,它与其他毒理学研究尤其是致癌性研究、生殖毒性研究有着密切的联系，是药物进入临床试验及上市的重要环节。
拟用于人体的药物,应根据受试物拟用适应症和作用特点等因素考虑进行遗传毒性试验。
遗传毒性试验是指用于检测通过不同机制直接或间接诱导遗传学损伤的受试物的体外和体内试验,这些试验能检出DNＡ损伤及其损伤的固定。
以基因突变、较大范围染色体损伤、重组和染色体数目改变形式出现的DNA损伤的固定,一般被认为是可遗传效应的基础，并且是恶性肿瘤发展过程的环节之一(这种遗传学改变仅在复杂的恶性肿瘤发展变化过程中起了部分作用）。
在检测此类损伤的试验中呈阳性的化合物为潜在致癌剂和／或致突变剂,即可能诱导癌和/或遗传性疾病。
由于在人体中已建立了某些化合物的暴露和致癌性之间的关系,而对于遗传性疾病尚难以证明有类似的关系,故遗传毒性试验主要用于致癌性预测。
但是,因为已经确定生殖细胞突变与人类疾病有关,所以对可能引起可遗传效应的化合物与可能引起癌症的化合物应引起同样的关注；此外,这些试验的结果可能还有助于解释致癌性的机制和试验结果。
因此,在药物开发的过程中,遗传毒性试验的目的是通过一系列试验来预测受试物是否有遗传毒性，在降低临床试验受试者和药品上市后使用人群的用药风险方面发挥重要作用。
本指导原则重点阐述遗传毒性试验体内外试验的基本原则,并介绍标准试验组合方案，以及对试验结果的综合分析及评价。
本指导原则适用于中药、天然药物和化学药物的遗传毒性试验研究。
二、基本原则(一)实验管理药物的遗传毒性试验属于安全性评价研究，根据《中华人民共和国药品管理法》的规定,必须执行《药物非临床研究质量管理规范》。
(二)具体问题具体分析遗传毒性试验的设计,应该在对受试物认知的基础上,遵循“具体问题具体分析”的原则。
毒理学评价的四个阶段和内容
毒理学评价的四个阶段和内容通常包括以下：
1. 急性毒性试验（Acute Toxicity Testing）：
这是毒理学评价的第一阶段，主要目的是确定物质在短时间内（通常是一次或几次接触后）对生物体产生的有害效应。
内容包括：经口、皮肤接触和吸入途径的急性毒性试验，计算LD50（半数致死剂量），即导致一半实验动物死亡的剂量。
2. 遗传毒性试验（Genotoxicity Testing）：
这个阶段评估物质是否能够引起遗传物质（DNA）的损伤，这可能导致突变、癌症或其他遗传疾病。
内容包括：Ames试验（细菌回复突变试验）、染色体畸变试验和微核试验等。
3. 亚慢性毒性试验（Subchronic T oxicity Testing）：
在这个阶段，物质的毒性效应在较长时间内（几周到几个月）被研究。
内容包括：重复剂量毒性试验，观察动物的行为变化、体重变化、血液学参数、生化指标、器官重量和病理学改变等。
4. 慢性毒性试验和致癌性试验（Chronic T oxicity and Carcinogenicity Testing）：
这是最长的一个试验阶段，通常持续数月到数年，旨在评估物质长期暴露对生物体的影响，包括潜在的致癌性。
内容包括：生命周期研究，观察生长发育、生殖能力、寿命以及肿瘤发生率等。
在这些试验中，除了直接的毒性效应外，还会考虑物质的代谢途径、蓄积效
应、剂量-反应关系以及敏感群体（如孕妇、儿童和老人）的特殊反应。
这些信息对于全面评估物质的安全性和风险管理至关重要。
值得注意的是，具体的试验设计和要求可能会根据监管机构的指导原则和物质的特性进行调整。
ICH遗传毒性标准试验组合的最新要求--ICHS2(R1)人用药物遗传毒性试验和结果分析指导原则介绍(一)
发布日期20080729栏目化药药物评价>>综合评价ICH遗传毒性标准试验组合的最新要求--ICHS2（R1）人用药物遗传毒性试标题验和结果分析指导原则介绍（一）作者黄芳华部门正文内容审评二部黄芳华从2006年9月开始，ICH提出对遗传毒性指导原则进行修订改版，ICH 专家组对遗传毒性试验一系列问题进行了讨论修订，并起草了S2（R1）：Guidance on Genotoxicity Testing and Data Interpretation forPharmaceuticals Intended for Human Use（人用药物遗传毒性试验和结果分析指导原则）。
该指导原则于2008年3月6日达到ICH进程的第二阶段。
根据协调进程，该指导原则由ICH委员会向ICH三方的管理部门（欧盟、日本和美国）以征询国内外的意见。
该指导原则将替代ICH原来的遗传毒性研究的两个指导原则（S2A和S2B），这将对药物遗传毒性研究产生重大的影响。
及时了解国际遗传毒性技术要求的进展，对于国内遗传毒性的研究也有重大意义。
该指导原则对遗传毒性试验标准组合、体内外试验的要求及结果分析和评价方面提出了新的要求。
以下是ICHS2（R1）关于遗传毒性标准试验组合的要求。
一、基本原理药品注册要求对其潜在性遗传毒性进行全面评价。
大量回顾研究表明许多被细菌回复突变（Ames）试验检出是致突变剂的化合物是啮齿类动物致癌剂。
加上体外哺乳动物细胞试验可提高灵敏度和加宽遗传学物质的检测谱，但是同时也降低了预测的特异性，即提高了阳性结果发生率（而该结果与此啮齿类动物致癌性不相关）。
然而，组合方法仍是合理的，因为没有任何一个单一试验能检测所有与肿瘤发生相关的遗传毒性机制。
标准试验组合应具备的基本特征如下：i.用细菌回复突变试验评价致突变性。
该试验能检出相关的遗传学改变和大部分啮齿类动物和人类的遗传毒性致癌剂。
ii.遗传毒性还应采用与哺乳动物细胞体外和/或体内试验进行评价。
遗传毒性试验
04
实验步骤与操作
样品准备
样品类型
选择相关样品类型，如细胞、 细菌、病毒等，根据实验目的
和要求准备。
样品浓度
确定样品浓度，以适应细胞生 长和实验需求。
样品纯度
确保样品纯度，避免杂质干扰 实验结果。
细胞培养与处理
01
02
03
细胞来源
选择合适的细胞系或原代 细胞，确保细胞株的遗传 背景和性质清楚。
细胞培养条件
提供适宜的细胞培养条件 ，包括温度、湿度、气体 等。
细胞生长与传代
根据实验需求，对细胞进 行生长和传代。
细胞收获与制片
细胞收获
在适当的时机终止细胞生 长，并进行收获。
细胞制片
将收获的细胞制作成适合 观察和计数的制片。
制片染色
根据实验要求，对制片进 行染色或特殊处理。
结果观察与计数
观察指标
建议与改进
采用标准化的实验方法
为了保证实验结果的可靠性，建议采用国际上认可的标准 化的实验方法，如国际化学物质毒性评价委员会（CTA） 推荐的方法。
对实验结果进行统计…
对于实验结果，应该进行统计学分析，以确定结果是否具 有统计学显著性，并比较不同组之间的差异。
增加实验样本数量
为了提高实验结果的可靠性，可以增加实验样本数量，以 减少误差和偶然因素的影响。
2023
遗传毒性试验
目录
• 实验简介 • 实验种类与方法 • 实验原理 • 实验步骤与操作 • 实验结果解读 • 实验注意事项与建议
01
实验简介
定义与目的
定义
遗传毒性试验是一种生物学试验，用于检测化学物质、辐射 等对生物体遗传物质的损伤，评估其致癌风险。
遗传毒性试验
为确保试验结果的准确性和可靠性，应建立严格的质量控制体系，包括检测 标准、检测方法、检测频率等。
03
试验结果分析与解读数据分析方法Fra bibliotek描述性统计
对试验数据进行整理、分类、归纳 ，找出数据的集中趋势和离散程度 。
假设检验
根据预先设定的假设，对试验数据 进行检验，判断是否具有显著性差 异。
方差分析
试验原理与方法
试验原理
基于DNA是生物体遗传信息的主要载体，化学物质对DNA的损伤可导致基因 突变、染色体畸变等遗传效应。通过检测化学物质的遗传毒性，可预测其可 能的致癌、致畸、致突变等有害效应。
试验方法
目前常用的遗传毒性试验方法包括细菌回复突变试验、哺乳动物细胞基因突 变试验、染色体畸变分析等。这些方法可用于检测化学物质的直接遗传毒性 、间接遗传毒性以及致突变作用。
变情况。 • 数据统计与分析：对试验数据进行统计和分析，计算受试物引起遗传效应的阳性率、突变频率等指标。 • 结果解释与评价：根据试验结果，对受试物的遗传毒性进行评价，判断其可能产生的致癌、致畸、致突变
等有害效应。
02
试验样品准备与处理
样品收集与保存
样品收集
在收集样品时，应确保样品的代表性和一致性，同时记录样品的来源、采集时间 、采集部位等信息。
样品保存
为保证样品的稳定性和可追溯性，应建立样品的保存制度，包括保存条件、保存 时间、使用记录等。
样品预处理与制备
样品预处理
为满足试验要求，需对收集的样品进行预处理，如干燥、粉 碎、过滤等。
样品制备
根据试验方案要求，将预处理后的样品进行制备，如混合、 溶解、稀释等。
样品检测与质量控制
样品检测
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遗传毒性试验能检出DNA损伤及其损伤的固定。
根据检测的遗传学终点分为4种类型:1检测基因突变（比如：Ames试验）;2检测染色体畸变（比如：微核试验）;3检测染色体组畸变（比如：体外CHL细胞染色体畸变、精原细胞染色体畸变试验）;4检测DNA原始损伤（比如：单细胞凝胶电泳分析(singlecellgeleletrophoresis,SCGE)）。
以上检测结果为呈阳性（除外假阳性）的化合物，为潜在人类致癌剂和/或致突变的物质。
FDA于2006年制定了遗传毒性试验结果的综合分析法指导原则（Guidanceforindustyandreviewstaff:Recommendedapproachestointegrationofgenetict oxicologystudyresults）对遗传毒性试验的阳性结果评价和处理：ICHS2（R1）中的遗传毒性结果评价和追加试验策略。
目前已建立的遗传毒性短期检测法已超过200种。
1 现行组合试验方案，用一组试验配套进行试验。
200多种检测方法中,真正经过验证有合适灵敏度和特异度的大概不到10种。
目前多数国家规定,如体内诱变试验显示1个或以上试验呈阳性结果,则需要进行生殖细胞遗传毒性测试。
2 各类遗传毒性试验方法的研究进展2.1 检测基因突变2.1.1 Ames试验Ames试验是检测化学物质基因突变的常用方法。
常规的Ames试验选用四个测试菌株(TA97、TA98、TA100、TA102),最近有人提出增加TA1535测试菌株,该菌株特别适用于检测混合物的致突变性。
目前出现的新生菌株具有更高的敏感性和特异性,如YG7014、TG7108,缺乏编码O6-甲基鸟嘌呤DNA甲基化转移酶的ogtST基因,专用于对烷化剂引起的DNA损伤检测;引入乙酰转移酶基因的YG1024、YG1029菌株,对硝基芳烃和芳香胺的敏感性比原菌株高100倍以上[4]。
测试代谢活化系统一般采用由Aro-clor1254(PCBs)诱导大鼠肝微粒体酶的S9;国外也有用人肝S9的报道,试验证明其代谢活性明显高于鼠S9[5,6]。
为了克服S9制备上的困难和不稳定性,Josephy等将沙门氏菌的芳香胺N-乙酰转移酶基因和人类细胞色素P-450基因Cyp1A2引入细胞,构建了在无外源S9时也可检出芳香胺诱变性的Ames测试菌株如DJ4501A2[7]。
2.1.2 TK基因突变试验TK基因突变试验是一种哺乳动物体细胞基因正向突变试验,近年来其应用价值有明显的提高。
TK基因编码胸苷激酶,该酶催化胸苷的磷酸化反应,生成胸苷单磷酸(TMP)。
如果存在三氟苷(TFT)等嘧啶类似物,则产生异常的TMP,掺入DNA中导致细胞死亡。
如受检物能引起TK基因突变,胸苷激酶则不能合成,而在核苷类似物的存在下能够存活。
TK基因突变试验可检出包括点突变、大的缺失、重组、染色体异倍性和其他较大范围基因组改变在内的多种遗传改变。
试验采用的靶细胞系主要有小鼠淋巴瘤细胞L5178Y以及人类淋巴母细胞TK6和WTK1等。
其基因型均为tk+/-。
Honma(本间正充)和张立实(1999)指出原用染毒时间3～6h对于充分检出断裂剂和锤体来说这个时间太短,获阴性结果时应延长至24h。
据资料显示对于同一阳性受检物,WTK1细胞的突变频率远高于TK6细胞,认为与WTK1存在p53基因突变有关。
Do-brovolsky(1999)建立了tk+/-转基因小鼠,可用于体内试验。
2.1.3 转基因小鼠基因突变试验转基因小鼠基因突变试验可在整体状态下检测基因突变,比较不同组织(包括生殖腺)的突变率,确定靶器官,对诱发的遗传改变作精确分析等[8]。
1989年Gossen等报道了LacZ转基因小鼠突变测试系统。
近年来,国外已陆续发展了多种用于突变检测的转基因动物,其中3种已投入商品化生产,MutaTM小鼠、Big-BlueTM小鼠和Xenomouse小鼠,它们分别采用大肠杆菌乳糖操纵子的LacZ和/或Lacl作为诱变的靶基因。
陈建泉等人(1997)已经以穿梭质粒pESnx载体,以xy1E基因因为诱变靶基因建立了携带xy1E的转基因小鼠,并对转基因小鼠进行了繁殖建系。
并已实验证明xy1E转基因小鼠是一个研究体内基因突变的有效模型,它可望成为一种新的转基因小鼠突变检测系统[9]。
Heddle 等(2000)建立了1个种gptdelta转基因小鼠。
HiroyukiHayashi等(2003)将载有E.coligpt 基因和λ噬菌体的red/gam基因λEG10DNA整合到SD大鼠每个单倍体基因组q24～q31位点。
这种转基因大鼠对乙基亚硝基脲(ENU)和苯并芘(B[a]P)的肝脏毒性显示了很好的敏感性,它也有助于研究遗传毒性物质对小鼠和大鼠的种间差异[10]。
2.1.4 反向限制性酶切位点突变分析法(inverserestrictionsitemutation,iRSM)由英国威尔士大学分子遗传和毒理中心建立并完善的[11]。
iRSM适用于快速检测诱变剂所致体内外DNA的突变,但这些突变的特点是使某一酶切位点变为另一酶切位点。
该方法建立者Jenkins等首先将iRSM应用于化学诱变剂所致动物体内p53基因的突变检测,取得了良好的结果:小鼠分别口服N-乙基N-亚硝基脲(ENU)、2-乙酰氨基芴(2-AAF)和二甲基酰肼(DMH)3天后,以iRSM方法相应地检测小鼠脾、骨髓和肝组织p53基因第6内含子区域的Apa→Ava 位点反向突变。
结果表明ENU诱发肝组织p53基因突变的发生率为33%,2-AAF使肝组织突变的发生率为25%,这一阳性突变率反映出了不同诱变剂对相应组织的致突变强度,进一步验证了该方法的高灵敏度和准确性。
它具有灵敏度高、快速、操作简便、以及突变检测部位明确等优点,应当说是一种较具实用价值和生命力的突变检测手段。
但是,iRSM的不足之处是仅能检测诱发限制性酶切位点反向的DNA突变。
根据文献资料分析,化合物致突的发生具有一定的规律性,即结构类似的一组化合物常常引起一些特定序列较固定的碱基改变。
例如,烷化剂和芳香胺类虽易使一连串鸟嘌呤(G)3′端G发生突变[12,13],这可能与该部位电荷密集有关,多数活性氧生成物质的DNA致突作用也具有类似规律[14];CpG二核苷常常是DNA 加成物致突变作用部位[15],所以CpG突变的检测在化合物致突检测中具有重要意义,而CpG 突变常引发某些固定酶切位点的变化。
很显然,iRSM可较广泛地应用于遗传毒性化合物致突作用的检测。
2.2 检测染色体和染色体组畸变2.2.1 微核试验传统的体内微核试验仍然是检测化学物质染色体损伤的基本方法。
目前微核试验方法主要有以下改进:1体外微核试验常用细胞有中国仓鼠肺细胞(CHL)、中国仓鼠卵巢细胞(CHO)及中国仓鼠成纤维细胞(V79)等,近年开始有用L5178Y小鼠淋巴瘤细胞和人的类成淋巴细胞TK6。
也有用叙利亚仓鼠胚胎(SHE)细胞和BALB/c3T3细胞。
体外试验比体内试验易于操作和控制。
缺点是对直接作用的化合物有可能出现假阳性。
2周围血微核试验优点是可重复采样,自身对照,减少实验动物数。
李尊爱(1999)报道刚断乳不久的小鼠(4～6周龄)用于外周血网织红细胞微核试验比年龄更大的敏感些[16]。
3胞质分裂阻滞法微核试验(CB-MNT) 很好地排除了细胞分裂的影响。
该法中,双核细胞是只分裂了一次的细胞,其结果更加稳定敏感。
CB-MNT可观察到多种遗传学终点。
观察不同分裂期的细胞比例,计算核分裂指数能检测诱变物对细胞周期的影响。
还可检测切除修复,次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)位点变异,凋亡。
认为该试验可使计数值提高,达到传统方法的两倍或以上。
但也偶小于两倍的结果(李来玉,1996)。
最近Garriott和Phelps等推荐了关于体外双核细胞微核试验的几个参数条件:细胞松弛素B不影响试验结果;计数2000个双核细胞;长时间暴露没有必要;结果用趋势检验分析;根据相应的细胞毒性选择适当的浓度[17]。
2.2.2 染色体畸变试验染色体畸变试验是检测化学物质影响染色体数量和结构的基本方法。
在化学物质安全性评价中常选体外CHL细胞染色体畸变、精原细胞染色体畸变试验等检测化学物质对染色体的影响。
为了准确观察诱发的畸变频数,本试验收获细胞的时间应尽量提前至大多数细胞处于染毒后第1次有丝分裂时(Tucker,1996)。
对于染色估数目改变,原则上只适合超倍体的观察。
因为涂片时可能人为地把染色体推出细胞外(Tucker,1997),Danford曾建议在制备标本时减弱低渗处理能力,以免涨破细胞膜,从而能准确观察亚二倍体。
经研究,认为以0.094mo1/LKC1弱低渗液处理2min～3min是达此目的的最佳条件(楼铁柱,1997)。
2.2.3 荧光原位杂交(FISH)技术荧光原位杂交最早由Bauman(1980)建立,后由Lucas(1989)首先应用于染色体畸变分析。
其原理是按检测目标准备恰当的DNA序列作为探针,并用生物素标记,对载玻片上待测标本中的DNA杂交,最后通过杂交位点的荧光观察染色体结构或数目的改变。
应用特殊染色体和染色体某区域的荧光探针可在体内检测4种类型的细胞遗传学终点[18]。
1检测中期细胞染色体畸变。
2应用亚染色体区域的探针检测间期染色体断裂和非整倍体。
3应用中心粒探针和/或抗着丝点抗体检测微核的形成。
Schriever-Schwemmet等利用CREST间接免疫荧光法,以及小鼠次要和主要卫星DNA探针,在小鼠骨髓细胞证明了受试物引起微核的来源[19]。
4哺乳动物精子非整倍体检测。
徐德祥(1999)用双色FISH方法对丙烯腈接触男工精子性染色体数目畸变进行了检测,证明FISH技术用于检测精子染色体数目畸变实验结果稳定可靠。
2.3 检测DNA原始损伤2.3.1 单细胞凝胶电泳技术单细胞凝胶电泳分析(singlecellgeleletrophoresis,SCGE)是Ostling等(1984)首创的,以后经Singh等(1988)进一步完善而逐渐发展起来的一种快速检测单细胞DNA损伤的实验方法,因其细胞电泳形状颇似慧星,又称慧星试验(cometassay)。
Kizilian(1999)改进了一些试验条件,能明显将细胞调亡和细胞坏死的形象与“彗星”区分。
MarkS.Rundell等(2003)报道彗星试验测行的损伤主要是由致突变剂引起的[20]。
RichardD.Bowden等(2003)研究出了一种新的分析试验结果的彗星尾图谱,可以更加准确的分析彗星的长度及密度[21]。
SCGE是评价遗传毒性损害非常敏感的实验,可以检测到每1.657×10-37kg中0.1个DNA的断裂。