基因测序原理与应用

常见遗传病基因诊断板
PGD
体外授精胚胎植入前遗传学诊断（IVF-PGD）
常见单基因病PGD
Biblioteka Baidu
遗传性耳聋
呼吸肌萎缩MTM1
多发内分泌系统腺瘤 RET
地中海贫血 肥厚型心肌病TNNT2 噬血细胞综合症PRF1
基因测序的原理及应用
大纲
一、第一代测序技术的原理、发展和应用 三、下一代测序技术的诞生、发展和应用 三、第三代测序技术与展望
DNA发现与测序技术的发展主要时间表
第一代测序技术的诞生、发展和应用
一、第一代DNA测序原理 DNA sequencing
Walter Gilbert
Frederick Sanger
“下一代”测序又称高通量测序，能一次并行对几 十万到几百万条DNA分子进行序列测定。
• 主要有以下几种：罗氏P454焦磷酸测序、 Illumina (MiSeq， HiSeq)测序 、Life Tech（Ion torrent Proton）离子半导体测序、DNA 纳米球测 序等。
• 发展迅速，应用广泛：如何应用，要敢于想！想 到就能够做到！
测序反应
DNA测序仪检测
DNA测序仪检测
测序结果常用打 开软件： Chromas
测序结果一般包括两 个文件： 1）.abi 文件，即测 序峰图文件
2）.seq文件，即由 峰图文件导出的序列 文件
序列有缺失 杂合子
重复序列
下一代测序技术的诞生、发展和应用
下二代测序（NGS）
determining the exact sequence of bases that make up a gene.
Gilbert and Sanger share the 1980 Nobel Prize).
测序方法
• 化学裂解法 Maxam-Gilbert (chemical) sequencing
杜氏肌营养不良 DMD
多囊肾PKD1
肝豆状核变性病 ATP7B
脊肌萎缩症SMA 软骨发育不全FGFR3 血小板增多JAK2
腓骨肌萎缩CMT1A
表皮角质化过度 KRT1
先天性免疫缺陷 IL2RG
黏多醣症IDS
寻常型鱼鳞病FLG
单基因遗传病PGD方案策略
1、抽父母及患儿 血验证
方 案 策 略
2、囊胚活检 MALBAC扩增产
末端终止法原理
• 使用特异引物在DNA聚合酶作用下进行延伸反应、碱基 特异性的链终止，以及采用聚丙烯酰胺凝胶区分长度差 一个核苷酸的单链DAN等3种方法。当反应遇到双脱氧的 核糖核苷酸底物（ddNTP）时，掺入到新生的DNA链中， 但是该双脱氧的核糖核苷酸的掺入阻止了DNA链进一步 的延伸反应，形成了长短不同的DNA片段。通过电泳和 放射自显影读出DNA序列。
DNA复制过程
DNA聚合酶（DNA polymerase）是DNA复制 DNA的重要作用酶。DNA聚合酶 , 以DNA为复 制模板，从将DNA由5'端点开始复制到3'端的 酶。DNA聚合酶的主要活性是催化DNA的合成 （在具备模板、引物、dNTP等的情况下）及 其相辅的活性。
DNA 合成的底物
deoxynucleoside 5’-triphosphates
物
寻找SNP连锁位点
1、单基因病位点PCRNGS + Sanger
2、染色体筛查 (PGS)
3、连锁分析验证
无创胚胎染色体筛查（NICS）
• 近日，全球首例接受无创胚胎染色体筛查 （NICS）的试管婴儿于无锡诞生（201603012）。
• 1975 DNA sequencing developed: Walter Gilbert and Allan
Maxam of Harvard University and Fred Sanger of Cambridge
University simultaneously come up with two techniques for
而直接“读出”碱基顺序。
从平板到毛细管！
测序过程
1. 模板DNA制备 2. 测序反应 3. 测序反应后的纯化 4. 变性、毛细管电泳和检测 5. 数据分析
模板DNA的制备
1.用质粒抽提或胶纯化试剂盒得到的质粒或PCR产物模板 2. 将DNA模板储存在灭菌水里如ddH2O, 超纯水；注意不 要含有EDTA等抑制测序反应的物质 3. 通过紫外分光光度计测定模板浓度（〉0.1ug/ul)及 质量(OD260/OD280在1.6-1.8之间）
dNTP (dATP, dGTP, dCTP & TTP)
dATP
PPi (pyrophosphate) or diphosphate
3’-5’phosphodiester bond
DNA sequencing
dCTP
DNA polymerase,
Substrate
dNTP,
H
[ -32p]-dNTP,or
[ -35s]-dATP
ddNTP
ddCTP
H
Dideoxy Sequencing of DNA
dNTP
ddNTP
proceeding for DNA synthesis:
ddATP
H
1.手工测序（同位素）
– 读序长度: 约 300bp – 同位素32P, 35S标记 – 结果通过人工肉眼分析
2.DNA序列的自动测序
2.1基本原理
2.2 其独特性在于：
➢ 带4种不同荧光染料的双脱氧核糖核苷三磷酸(ddNTP) 作为链终止剂，而替代了手工测序的同位素标记。
➢ 采用聚丙烯酰胺区分长度仅差1个碱基的单链DNA。 ➢ 一个样品的4个测序可以在一个泳道内电泳，从而降低
了测序泳道间迁移率差异对精确性的影响。 ➢ 电泳之后，就可以通过全自动激光激发以及荧光检测
• 末端终止法 Sanger-Coulson (dideoxy or enzymatic) sequencing
• DNA序列测定技术，是在高分辨率变性聚丙烯酰胺凝 胶电泳技术的基础上建立起来的。变性聚丙烯酰胺 凝胶电泳能够分离长度达到300～500个碱基，而差 别仅1个碱基的单链寡聚核苷酸。
• 技术由三部分组成 1 产生不同长度的DNA片段,差别仅1个碱基。 2 在变性的聚丙烯酰胺凝胶上电泳。 3 测序胶的放射性自显影技术。