贝类细胞

贝类血细胞分类

贝类血细胞研究始于1934 年。在70 年代中期，贝类血细胞又重新引起了研究者的兴趣，原因之一，是一些经济贝类时常遭受一些寄生虫或病菌的侵袭引起疾病,而贝类的血细胞在防御疾病中扮演了极重要的角色,所以研究血细胞的形态、结构、功能,将帮助我们更好的了解它们的防御机制。随着对血细胞防御功能更深入的研究,研究者们急待解决的问题就是对血细胞的分类命名。早期对贝类血细胞的分类依据主要来源于细胞化学染色和电子显微镜观察，根据血细胞内细胞器的性质，细胞核的形态及其染色亲和性，血细胞中颗粒的有无，以及对血细胞的外部形态、运动特征、血细胞的发生来进行分类。但由于贝类的血细胞还存在着许多的中间类型，用传统方法进行简单的分类不能满足实际需要。流式细胞技术、单克隆抗体、免疫探针技术、密度梯度离心、酶细胞化学、外源凝集素标记法等均为贝类血细胞的分类提供了新的技术。

1 组织化学或细胞化学染色

组织化学或细胞化学染色（histochemical or cytochemicalstaining）是利用染色剂可同细胞的某种成分发生反应而着色的原理，对某种成分进行定性或定位研究的技术。利用这种方法对细胞的各种成分几乎都能显示，包括有无机物、醛、蛋白质、糖类、脂类、核酸、酶等。

2 光学显微镜技术和电子显微镜技术

光学显微镜是利用可见光照明，将微小物体形成放大影像的光学仪器。

电子显微镜是以电子束为照明源，通过电子流对样品的透射或反射及电磁透镜的多级放大后在荧光屏上成像的大型仪器。电子显微镜技术（electronmicroscopy)已成为研究机体微细结构的重要手段。常用的有透射电镜（transmission electron microscope，TEM）和扫描电子显微镜（scanning electronmicroscope,SEM）。与光镜相比电镜用电子束代替了可见光，用电磁透镜代替了光学透镜并使用荧光屏将肉眼不可见电子束成像。

透射电镜是以电子束透过样品经过聚焦与放大后所产生的物像，投射到荧光屏上或照相底片上进行观察。透射电镜的分辨率为0.1～0.2nm，放大倍数为几万～几十万倍。由于电子易散射或被物体吸收，故穿透力低，必须制备更薄的超薄切片（通常为5 0 ～100nm）。其制备过程与石蜡切片相似，但要求极严格。要在机体死亡后的数分钟钓取材，组织块要小(1立方毫米以内），常用戊二醛和饿酸进行双重固定树脂包埋,用特制的超薄切片机（ultramicrotome）切成超薄切扫描电镜是用极细的电子束在样品表面扫描，将产生的二次电子用特制的探测器收集，形成电信号运送到显像管，在荧光屏上显示物体。（细胞、组织）表面的立体构像，可摄制成照片。

3 流式细胞技术

近年来，国外学者采用流式细胞仪对贝类血细胞进行分类[7~9]，每秒钟可以分析多达几百个血细胞,同时还可以分析血细胞的大小和颗粒性。流式细胞仪在细胞分类及其功能的研究上是一种快速而准确的工具,它不但计数量大,使统计数据更为准确；并且可避免实验过程中人为或一些主观性因素造成的不确定性和一些假象。

4 单克隆抗体技术

单克隆抗体技术是以免疫反应中特异性的免疫功能为依据，反映了血细胞膜上抗原决定部位的组成，从而使血细胞分类能与其免疫功能联系在一起。Noel等[15]应用单克隆抗体技术,对贻贝血细胞的亚群从其抗原性特征进行了研究，通过免疫染色鉴定了2 1生命科学仪器2007 第5 卷/ 4 月刊研究报告4 种单抗。从免疫染色的结果来看，贻贝至少可以区分出三种不同类型的血细胞。

5 免疫探针技术

免疫探针技术能准确地确定血细胞的血像，而血细胞的血像又能综合的反映血细胞自身的生理状态、血细胞所处的环境状态，以及血细胞对病原敏感性的差异，是一种比较准确、客观的血细胞分类手段。

6 密度梯度离心

密度梯度离心（density gradient centrifugation）是用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过重力或离心力场的作用使

细胞分层、分离。这类分离又可分为速度沉降和等密度沉降平衡两种。密度梯度离心常用的介质为氯化铯，蔗糖和多聚蔗糖。分离活细胞的介质要求：1 ）能产生密度梯度，且密度高时，粘度不高；2 ）P H 中性或易调为中性；3 ）浓度大时渗透压不大；4 ）对细胞无毒。在对牡蛎血细胞分类研究中，Xue 等[19]通过密度梯度离心法将食用牡蛎(Ostrea edulis)血细胞分为颗粒细胞、大透明细胞和小透明细胞。

7 酶细胞化学技术

酶细胞化学技术(enzymecytochemistry)是将细胞内的酶与底物相互作用，再将酶反应的产物作为反应物质，在酶的作用部位进行捕捉，使其在显微镜下具有可见性。这种在酶作用下产生反应产物，经捕捉反应来间接证明酶定位的反应称为酶的细胞化学反应。电镜酶细胞化学技术是在光镜细胞化学的基础上发展起来的新的一门技术，主要通过酶的活性作用结果间接地证明酶的存在。一般先将酶原位固定在细胞内，再使它与特定的底物起反应，底物的分解物经过捕捉反应沉着于发生分解的原位上，最后使沉着物变为在电镜下可以看到的物质。在整个处理过程中必须保存酶的活性不受破坏。Russell-Pinto等[20]发现不同血细胞类型对绵羊细胞有不同反应,并用光镜、电镜及酶细胞化学法研究后,也将血细胞分为三个类型: Ⅰ型为大的伸展细胞,呈酯酶和酸性磷酸酶阳性,能吞噬绵羊红血球；Ⅱ型细胞球型,细胞器少,与绵羊红细胞形成E 花环；Ⅲ型细胞圆形, 胞质中充满含颗粒性物质的泡