分子克隆实验设计

The pTRE-p53 Cloning Project
Plasmid
Gain p53 cDNA fragment from pC53SN3( BamH I digestion ) and clone in each orientation into the BamH I site in pTRE. This gives the two constructs below.
TGCATGCAT 3’ 3’ ACGTACGTA 5’
引物
Fra Baidu bibliotek
模板
ACGTACGTA 5’
（3）DNA链的延伸
72oC
5’ ATCTTGAAC
DNA聚合酶按碱基配对原则在模板上延 伸DNA链。 模板
Taq
TGCATGCAT 3’ ACGTACGTA 5’
5’ ATCTTGAAC 3’ TAGAACTTG
Taq
模板
ACGTACGTA 5’
（5）1个循环的结果
（4）新一轮循环开始 变性—复性—延伸。
理论上25-30次循环就可以合成225-230条DNA。
引物（primer) ①位置 与待扩增的模板DNA区段的两3’端序列 互补（ 5‘端相同）的短DNA。
3’
3’
②引物的长度
理论计算：
19=2.751011。 4
• 2.生成出版质量的图片。发表时，对用到的 分子结构的图片质量要求较高，直接从 RasMol等软件中截取的图片质量不够精美。 推荐软件：Pov-Ray for Windows 3.1 参考软件：molmol 2.5.1,mole 1.1.8 3.序列递交。结果中有新的序列需要递交到 各大数据库中必须符合各数据库的要求。 除了下面推荐的软件外，也可以通过写好 一种格式后，用格式转换软件转换为其他 种类格式，以向不同的数据库递交序列。 推荐软件：Sequin 3.32
图1.2 pTRE-p53质粒克隆策略。 Fig.1.2 The pTRE-p53 plasmid cloning project.
• 11.三维结构显示。 用各种方法计算出来的各种三维结构的数 据只有在相关软件帮助的情况下，才能显 示出其本来面目，使得我们对这些分子的 结构有一个直观的体会。 推荐软件：RasMol 2.7.1 参考软件：ICMlite 1.0 Cn3D
手工计算：
Tm=（G+C)4 + (A+T)2 一般估计： 当引物中的（G+C）含量低于50%时， 复性温度低于55 oC。
实际复性温度选择低于Tm值5 oC。
适当提高复性温度可以提高引物与模板结 合的特异性，减少非特异产物的出现。
⑥引物的浓度
一般使用终浓度各0.5mol/L。
⑦简并引物
如果引物的序列是从基因产物蛋白质的 氨基酸序列反推出来的，就必须考虑密 码的简并性。
即2.751011 bp的基因组中有一次完全 与19个核苷酸的序列相同的机会（或 机会是约2×10-11）。
一般引物设计为长15—30bp。
③引物的碱基序列 3‘端必须与模板正确配对，5’端可以不配对。
primer
3’GCTAGCTACTTAAG5’ 5’ATGCAGAAACTGATCGATCGATCGAT3’
分子克隆实验设计
主讲人：舒坤贤 E-mail:kxshu@163.com shukx@cqupt.edu.cn 重庆邮电大学生物信息学院
Boyer-Cohen 实验
分子克隆实验常用软件介绍
一、资料收集整理阶段。 本阶段需要查找某个项目专题的文章,并 写出对该专题的综述,以便对自己所要做的课 题的现状有一个基本的了解。 推荐软件：Reference Manager 9.0（最好掌 握） 同类参考软件：Endnote 3.1.2
分析软件http://www.firstmarket.com/cutter）
等等。
• 3.引物设计。 引物设计一般包括用于检测和用于进一 步分子操作的引物。其中用于分子操作的 在原来序列上设计，加上接头和保护碱基。 但几乎所有软件都没有考虑接头和保护碱 基的设计。因此能否对假定的引物进行各 种属性的分析，参考各种结果，最后找到 合适的引物序列便成为选择软件的最关键。 推荐软件：Primer3（必须掌握）(在线设计 软件 http://frodo.wi.mit.edu/primer3/ ) 同类参考软件：Primer Premier 5.0, Vector NTI Suite 6.0,DNAClub,Oligo 5.0 …
• 12.翻译/ORF Finding 推荐软件：Gene Construction Kit 2.0 参考软件：Primer Premier 5.0，Vector NTI Suite 6.0
• 13.格式转换。 各种软件为了自己软件的需要有不同的格 式，对我们使用数据带来了困难。格式转 换软件可以将不同格式数据转换以方便使 用。 推荐软件：Seqverter 1.3 参考软件：Visual Sequence Editor 1.1， Genestudio
三、实验操作和数据分析阶段 本阶段由于各实验室的设备和方法的不同 差异太大，如若用到软件，请参考机器配 备之软件。但也有一些共同的要求和使用 的软件。 1.单向电泳条带定量分析。 推荐软件：BandScan 4.50 参考软件：band leader 3.0 2.据统计分析作图。可能在某些情况下需要 用到这类软件。由于专业的统计软件也很 多，比较出色。我们只推荐一个比较适合 生物的软件SigmaPlot 2000。
3）避免形成引物二聚体（dimer） 两个引物之间不能有两个以上的连续 碱基序列互补。 primer1 5’GGTCTGCCAGTCTAC3’
3’CAGGACTTAGTCACT5’ primer2 Sense primer Upstream primer Forward primer Primer1 vs vs vs vs Antisense primer Downstream primer Reverse primer Primer2
• 5.质粒作图。 这也是最常用的序列显示功能。我们要求 软件能对已知序列自动作图，对未知序列 但关键部位位置清楚的质粒也能作图。主 要是标示各种酶切位点、基因序列、特定 结构域序列。 推荐软件：Gene Construction Kit 2.0 参考软件：Winplas 2.6 ，pDRAW32 1.0.33等
二、序列分析、实验设计模拟阶段
1.综合性软件。 这类软件要求对本阶段上述的大部分 功能均具备，而且这类软件在一些专项分 析上仍有绝对优势。 推荐软件：DNASTAR 4.03 同类参考软件：Vector NTI Suite 6.0,Omiga 2.0、DNASIS 2.5,DNATools 5.1
PCR技术的原理
模板DNA变性
引物DNA复性
引物DNA延伸
（1）DNA模板变性
95oC
双链DNA在受热后，配对碱基的氢键断裂， DNA两条链分开成为单链。 5’ ATCTTGAAC 3’ TAGAACTTG 95oC
TGCATGCAT 3’ ACGTACGTA 5’
5’ ATCTTGAAC 3’ TAGAACTTG
• 8.RNA二级结构预测及分析。 似乎人们在二级结构预测方面没有什么明 确的模型。因此，对这类软件只能以参考 参考的心态来使用了，不能报任何希望。 推荐软件：RNAdraw 1.1b2 参考软件：RNAStructure 3.5
• 9.蛋白结构分析。 不要指望软件能给你带来一个有三维结构 的蛋白，所谓的分析只能给你一个蛋白某 些片段有形成什么结构的趋向。结果判定 还是要靠人本身。
• 3.序列拼装。这是多基因方面用得比较多的 程序，在单基因的研究中有时也会用到。 推荐软件：SeqMan 4.03 （Lasergene Suite） 参考软件：Vector NTI Suite 6.0
（四）、文章写作和结果发表 本阶段主要是对所获得的结果整理，并发 表在合适的地方。 1.文献引用。 推荐软件：EndNote 5.0 参考软件：Reference Manager 9.0
目前应用的蛋白质结构预测的算法
1. 2. 3. 同源预测(一级结构决定高级结构) 结构与结构相对比（DALI算法） 当前最先进的结构预测方法： 结构类识别（fold recognition） 先建立一个已知的结构类数据库（fold library)，将待测序列“穿过”该数据库构成的座 标，并根据事先确定的物理限制，逐个位置移动 （threading， sequence-structure alignment) ，并 一个函数（sequence-structure fitness alignment) 判断序列与结构类的符合程度，找出未知序列在 目标结构上的能量最优和构象最稳固的比对位置。 对计算机要求很高。
模板
TGCATGCAT 3’ ACGTACGTA 5’
模板（template）
（2）DNA模板与引物复性
引物（primer）:
40-65oC
人工合成的单链DNA小片断，碱基顺序分别 与所要扩增的模板DNA双链的3‘端互补。 模板
5’ ATCTTGAAC 引物
5’ ATCTTGAAC 3’ 3’ TAGAACTTG
template 5’端根据需要可设计成某个内切酶的切 点顺序、RNA聚合酶识别序列、突变位 点或生物素标记等，方便与以后操作。
④引物的碱基组成 1） 尽可能提高G+C含量，以提高引物与模 板的结合力 2） 避免连续相同碱基排列或内部回文序列.
5’GGCAGTCTGCCAGTCTAC3’
发卡结构 T CTGCCAGTCTAC3’ GACGG5’
• 10.克隆策略图谱。 几乎所有人都用手工或用绘图软件来画出 整个克隆过程，各种位点只能大概估计， 与核酸的序列之间的关系当然无从谈起。 现在终于有可以解决问题的软件登陆了。 推荐软件：Gene Construction Kit 2.0或 NoeClone（必须掌握其中的一个）
Gene Construction Kit 2.0 模拟电泳
需要合成多种序列的引物，彼此间只有 一个或几个碱基差异。这样的混合引物 称简并引物。
⑧套嵌引物（nested primers) 设计多组引物，结合位点依次位于前一组 引物之间。增加扩增产物的特异性。 1 3
4
引物设计现在多用专业软件
2
如Primer5.0等
4.序列比对。 序列比对包括部分完全相同序列查找和 序列相似性排列两类。与限制酶分析相似， 由于这类软件的算法没有多大变化，内核 大都是相同的，所以其结果输出和易用性 也成了更重要的标准。 推荐软件: BLAST 同类参考软件： GeneDoc 3.2，MagAlign 4.03（Lasergene Suite）, Vector NTI Suite 6.0等
6.结构域（motif）查找。 与限制酶的分析相似，这也是一个文本查 找的内容，关键在于以何种方式显示查询 结果。 推荐软件：Primer Premier 5.0 7.序列查找下载工具。 推荐软件：Vector NTI Suite 6.0； PubMed-Entrez Searching 参考软件：Network Entrez
2.制酶分析。 可能是最简单的功能了，用普通的文本 搜索也能找出相应的序列位点。正因如此， 我们希望软件在结果输出上有更完美的表 现。另外几乎所有的软件都没有考虑在酶 切位点前应该有保护碱基，所以该分析通 过，并不能在实验中总能通过。 推荐软件： Vector NTI Suite 6.0 同类参考 软件：DNAssist 1.0 ，Primer Premier 5.0，webcutter 2.0（在线
图1.4 重组质粒pTRE-p53的限制性酶切分析与预测的模式比较。 Fig.1.4 Predicted Gel Electrophoresis Patterns can be Used to Analyze Real Gels. Banding pattern in lane 3-8 math lane 2,3 and not lane 4,5 indicating antisense clones of pTER-p53. Lane 8-10 correspond to lane 4,5; Lane 1 to lane 1.