检测两种蛋白质之间相互作用

检测两种蛋白质之间相互作用的实验方法比较

1. 生化方法

●免疫共沉淀免疫共沉淀是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。改法的优点是蛋白处于天然状态，蛋白的相互作用可以在天然状态下进行，可以避免认为影响；可以分离得到天然状态下相互作用的蛋白复合体。缺点：免疫共沉淀同样不能保证沉淀的蛋白复合物时候为直接相互作用的两种蛋白。另外灵敏度不如亲和色谱高。

●Far-Western

又叫做亲和印记。将PAGE胶上分离好的凡百样品转移到硝酸纤维膜上，然后检测哪种蛋白能与标记了同位素的诱饵蛋白发生作用，最后显影。缺点是转膜前需要将蛋白复性。

2. 等离子表面共振技术（Surface plasmon resonance）该技术是将诱饵蛋白结合于葡聚糖表面，葡聚糖层固定于几十纳米厚的技术膜表面。当有蛋白质混合物经过时，如果有蛋白质同“诱饵”蛋白发生相互作用，那么两者的结合将使金属膜表面的折射率上升，从而导致共振角度的改变。而共振角度的改变与该处的蛋白质浓度成线性关系，由此可以检测蛋白质之间的相互作用。该技术不需要标记物和染料，安全灵敏快速，还可定量分析。缺点：需要专门的等离子表面共振检测仪器。

3. 双杂交技术原理基于真核细胞转录因子的结构特殊性，这些转录因子通常需要两个或以上相互独立的结构域组成。分别使结合域和

激活域同诱饵蛋白和猎物蛋白形成融合蛋白，在真核细胞中表达，如果两种蛋白可以发生相互作用，则可使结合域和激活域在空间上充分接近，从而激活报告基因。缺点：自身有转录功能的蛋白会造成假阳性。融合蛋白会影响蛋白的真实结构和功能。不利于核外蛋白研究，会导致假隐性。

5. 荧光共振能量转移技术指两个荧光法色基团在足够近（<100埃）时，它们之间可发生能量转移的现象。荧光共振能量转移技术可以研究分子内部对某些刺激发生的构象变化，也能研究分子间的相互作用。它可以在活体中检测，非常灵敏，分辩率高，能够检测大分子的构象变化，能够定性定量的检测相互作用的强度。缺点此项技术要求发色基团的距离小于100埃。另外设备昂贵，还需要融合GFP给蛋白标记。

此外还有交联技术（cross－linKing），蛋白质探针技术，噬菌体展示技术（Phage display）以及生物信息学的方法来检测蛋白质之间相互作用。

1，酵母双杂交 1-5

酵母双杂交系统是将待研究的两种蛋白质的基因分别克隆到酵母

体，从表达产物分析两种蛋白质相互作用的系统

酵母双杂交的原理是，把报告基因HIS3 和l a c Z 整合到酵母细胞基因组中，并受转录因子

GAL4 的调控表达。一旦 GAL4 蛋白结合到HIS3 和l a c Z 调控序列相应的位点，则启动报告基

因的表达。通过检测报告基因的表达判断阳性或阴性。实际应用中，把 GAL4 基因分成两个部

分： DNA 结合区（ gal4 DNA binding domain, GBD）和激活区(gal4 activating domain, GAD）。分

别把 GBD 和 GAD 构建到两个不同的载体上，并能表达相应的两个融合蛋白（ GBD-X 和

GAD-Y）。然后把 GBD-X 和 GAD-Y 两种载体共转染到带有报告基因的酵母细胞中。当 GBD-X

融合蛋白中 X 蛋白与 GAD-Y 融合蛋白中 Y 蛋白发生相互作用时（或结合在一起时），就使得

原本分开的 GBD 和 GAD 蛋白靠近并具有完整的 GAL4 蛋白的功能，从而能够激活报告基因的

表达。

（ 1）筛选相互作用的蛋白

酵母双杂交技术能用于对 cDNA 文库的筛选。把你要研究的蛋白亚克隆到 GBD 载体上，

作为“诱饵”蛋白。把文库蛋白基因亚克隆到 GAD 载体上。然后就可以在文库中寻找那些能够与“诱饵”蛋白可以相互作用的蛋

白。也许你能够筛选到多株阳性克隆。虽然酵母双杂交技术具有广泛的应用价值，但正如任何其它技术一样，酵母双杂交技术也有一定的局限性。酵母双杂交技术最大的弱点就是假阳性出现率。所以筛选到的阳性克隆需要进一步的鉴定和功能数据支持。（2）确定参与结合作用的结构域或 motif

当你确定了两个蛋白质分子之间有相互作用后，利用酵母双杂交技术可以精细研究蛋白质分子中那些结构起结合调节作用。你可以先把一个蛋白进行随机缺失，制备一系列缺失体，然后来检测这些缺失体与另一个蛋白质结合力的大小，直到发现在蛋白质两两分子间起决定作用的氨基酸序列（称为结构域或 motif）。如果一个蛋白分子中具有已知的结构域或 motif，也一样进行缺失，看是否这些已知的结构域或 motif 参与结合调节作用。有的情况下蛋白质相互作用可能与蛋白质的磷酸化状态有关。这时就需要对可能的磷酸化位点进行点突变，检测这些磷酸化位点是否参与调节蛋白质的结合作用。

2，GST沉淀实验（GST-pull down实验）（细胞外蛋白质相互作用） 5-11

上面提到，用酵母双杂交方法筛选到的蛋白需要作进一步的鉴定。鉴定方法之一就是 GST沉淀实验。 GST 沉淀实验主要是用来证明蛋白质胞外的相互作用。蛋白质在胞外的相互作用排除了酵母细胞内复杂体系的干扰，，比较直接地检验蛋白质分子之间存在的物理的相互作用。同酵母双杂交实验一样，运用此法也可以证明

相互作用的蛋白分子中是否有参与调节作用的结构域或 motif。GST 沉淀实验原理就是，把你要研究的蛋白基因亚克隆到带有GST（谷胱甘肽转移酶）基因的原核表达载体中，并在细菌中表达GST 融合蛋白（ GST-X）。把 GST 融合蛋白挂到带有 GST 地物的Sepharose beads 上，然后把另一种蛋（ Y）白加入其中。由于蛋白质之间的结合作用，形成了这样的复合物： GST-X----Y。这一复合物与固体支持物（ Sepharose beads）又结合在一起，可以被沉淀下来。此法又有在不同情况下的具体应用，以下一一作介绍。

（1） GST 融合蛋白与重组蛋白的相互作用

GST 融合蛋白是在原核表达的，所以没有经过过多的象真核细胞内具有的蛋白修饰作用。所以另一种用来检验相互作用的蛋白也可以用原核表达出来，也就是所谓的重组蛋白。当 GST融合蛋白把重组蛋白沉淀下来，然后用重组蛋白的抗体作Western blotting 检测。

（2） GST 融合蛋白与体外 TNT 系统合成的多肽或蛋白的相互作用

用来检验与GST融合蛋白相互作用的蛋白或多肽也可以用 TNT体外蛋白合成体系进行合成，并且还可以在要合成的蛋白或多肽N 端或C端加上便于检测的标签。 GST融合蛋白沉淀下来的蛋白或多肽可以用该蛋白或多肽的抗体或标签抗体进行Western blotting检测。如果蛋白之间结合力非常弱，用Western blotting